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类型丹参酮ⅱa预防血管紧张素ⅱyou导的大鼠心肌肥大的机制.doc

  • 上传人:cjc2202537
  • 文档编号:181475
  • 上传时间:2018-03-23
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    1、丹参酮A 预防血管紧张素诱导的大鼠心肌肥大的机制实用医学杂志 2006 年第 22 卷第 8 期丹参酮A 预防血管紧张素大鼠心肌肥大的机制冯俊张洁郑智粱黔生摘要目的:观察丹参酮A 磺酸钠盐(sodiumtanshinone11Asulfonate,STS)对血管紧张素 11(angiotensin,Ang11)诱导的心肌细胞肥大的影响,以探讨 STS 在钙调神经磷酸酶(calcineurin,CaN)依赖的信号通路心肌肥大中的作用.方法:以培养的原代心肌细胞为模型,用 Ang刺激细胞外 Ca 内流,丹参酮A 及钙离子拮抗剂雏拉帕米(Ver)进行干预 ,检测心肌细胞 【ca; 及 CaN 活性;

    2、 【H. 亮氨酸掺入法测定心肌细胞蛋白质合成速率作为心肌细胞肥大的指标.用 Westernblot 法检测心肌细胞 CaN 蛋白的表达.结果:Ang1I 刺激组【cai 水平 ,CaN 蛋白的表达及蛋白核酸合成速率明显增高,与对照组相比差异有显着性(P0.01),而 STS 能有效地降低由 Ang刺激引起的【ca2】;增高(P0,0lvsAng组),明显抑制 Ang诱导的蛋白质合成速率的增加(P0.01vsAng组).AngII刺激组 CaN 活性及其蛋白表达明显高于对照组,差异有显着性(P0.05,P0.01).STS 及 Ver 抑制 Ang1I 介导的心肌细胞 CaN 活性及其蛋白表达的

    3、增高.结论:CaN 通路在 Ang刺激的心肌细胞肥大中起重要作用;STS 具有Ca2 阻滞剂的特点,能有效地降低由 Ang刺激引起的【ca;增高,导致 CaN 活性及其蛋白表达降低,阻滞心肌肥大的发生和发展.关键词心肌病,肥厚性血管紧张素丹参酮钙调神经磷酸酶EffectsofsodiumtanshinoneRAsuifonateonmyocardialhypertrophyinducedbyangioteminIIinneonatalratsFENGJun,ZHANGfie,ZHENGZhi,LIANGQian-sheng.TheEmergencyDepartmentofTongiiHospi

    4、talAJdiatedtoTongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030,China【Abstract】0bjectivesToobservetheeffectsofsodiumtanshinonc1IAsulfonate(STS)onthecardiocytichypeamphyinducedbyangiotensin(Ang11)intheprimarycultureofneonatMratcardiocytessoastoexploretherolesofcalcineurin(CaN)-

    5、dependentsignalingpathwayinmyocardialhypearophy.MethodsBasedonthemodeloftheprimarycultureofneonatalratcardiocytes,CainfluxinducedbythestimulationofAngwasinterferedbyverapamil(Ver)andSTS.andthenwasdetectedbymonitoringtheintracellularClevelandtheCaNactivities.ProteinsynthesisratewasassayedbyH-Leucinei

    6、ncorporationastheindexofcardiocytichypertrophy.CaNexpressionwasassessedusingWesternblot.ResultsProteinsynthesisrateandintracellularCalevelstimulatedbyAngintheeardiocyteswashighersignificantlythanthatincontrolgroup(P0.O1).STSdecreasedsignificantlytheincreasedintraccllularCa“levelinducedbyAng(P0.01)an

    7、dinhibitedproteinsyntheses(P0.01).TheactivitiesandCaNexpressionwasincreasedmoresignificantlythanthatincontrolgroup(P0.05,P0.叭)inthecardiomyocytesstimulatedbyAng.STSandVeralsosuppressedtheactivitiesandCaNexpressioninthecardiomyocytesstimulatedbyAng.ConclusionsItissuggestedthatCaNsignalingpathwaymaybe

    8、importantincardiocyteshypertrophyinducedbyAng.STScaneffectivelydecreasetheincreasedintracellularCa2levelandcardiocytichypertrophyinducedbyAngviainhibitingtheactivitiesandtheexpressionofCaNinthecardiomyocytes.【Keywords】 Cardiomyopathy.hypertrophicAngiotensinTanshinoneCalcineurin心肌肥大是心肌细胞对外界和(或)内在刺激的一

    9、种适应性反应.已知胞内 Ca 浓度升高是心肌肥大的一个信号,最近证实,由 Ca 活化的钙调神经磷酸酶(calcineurin,CaN)在心肌肥大的信号转导中起重要作用.CaN 可能是 Ca 信号致肥大基因活化的偶联环节.提示 Ca 一 CaN 依赖的信号通路可能是介导心肌肥大的一条新通路.CaN 通过使 T 细胞核因子 3基金项目:国家自然科学基金(项目编号:30500657)作者单位:430030 武汉市,华中科技大学同济医学院附属同济医院急诊科(nuclearfactorsofactivatedTcells,NF.AT3)去磷酸化后进入细胞核,在核内与 GATA4 相互作用,诱导一系列肥大

    10、基因表达改变,引起心肌肥大发生.近年来的研究表明,在压力负荷等病理因素所导致的心肌细胞肥大反应中,血管紧张素(angiotensin1I,Ang1I)是重要的刺激因子,具有生长因子样作用,可直接导致心肌肥厚.丹参是我国传统中药,广泛用于冠心病的治疗,但关于其对心肌肥厚的作用报道较少.本实验用培养的新生大鼠心肌细胞研究丹参的主要成份丹参酮A 的提取物丹参酮A 磺酸钠盐(sodiumtanshinoneAsulfonate,STS)对 Ang诱导的心肌细胞究研验实.自导诱=U肥大及 CaN 依赖的信号通路的影响,探讨 STS 此作用的可能机制,为其在临床用于心肌肥厚的防治提供实验依据.1 材料与方

    11、法1.1 动物和试剂 13d 龄 Wistar 大鼠,雌雄不拘(同济医学院动物实验中心提供).Ang1I,CaN,PNPP,Fura 一 2/AM,5 一溴脱氧尿苷,leupeptin,PMSF,兔抗鼠CaN 抗体 ,辣根过氧化物酶标记羊抗兔 IgG 等均为Sigma 公司产品,DMEM 千粉培养基,胰蛋白酶,胎牛血清(Gibco 公司),【H】一亮氨酸 (中科院上海原子能研究所),SodiumtanshinoneIIAsulfonate(美国达拉斯西南医学中心),其余试剂为国内目前最优质的化学试剂.1.2 实验分组(1)对照组;(2)Ang1I(10mol/L)组;(3)Ang(10mol/

    12、L)+STS(10g/L)组;(4)Ang(10-7mol/L)+维拉帕米(Ver)(10mol/L)组.1.3 新生大鼠原代心肌细胞培养将 13d 龄Wistar 大鼠于无菌条件下取出心室,在 4DHanks液中剪碎,用 0.1%的胰蛋白酶消化成单细胞悬液.为了选择性收集心肌细胞,加入 20%的 DMEM 培养液在5%CO,37培养箱中差速贴壁 12h 除去非心肌细胞;将未贴壁的细胞悬液转移到另瓶培养,在培养的前 48h,加入 5 一溴脱氧尿苷(0.1mmol/L), 以抑制非心肌细胞的生长.1.4 心肌细胞大小的测定心肌细胞在无血清培养液中培养 24h 后,每 24h 按实验分组药物加药

    13、1 次,48h 换液 1 次.分组药物持续作用 7d 后,0.25%的胰酶消化使之脱落,在相差显微镜下用测微器测细胞直径,每孔观察 l0 个视野,每个视野观察 10 个细胞,取其平均值.1.5 细胞Ca2i 浓度测定心肌细胞在无血清培养液中培养 24h 后,按实验分组药物加药继续培养 24h,应用特异的钙敏感指示剂 Fura.2/AM 测定心肌细胞Ca2+i 浓度 .将负载 Fura 一 2 的心肌细胞置于荧光显微镜下(PTI1048), 钙荧光的激发波长为 340/380实用医学杂志 2006 年第 22 卷第 8 期IlIT1,发射波长为 510B.m.荧光信号经 Felix 专用软件处理

    14、.ca浓度根据 Gynkiewicz 提供的公式计算,Cai=(R.Rmin)/(RmaxR)(Sf/Sb)Kd,Kd 为 224nmol/L,R 为荧光值,sf 为游离钙荧光强度,sb 为结合钙荧光强度,ca2浓度单位为 nmol/L,重复 6 次.1.6CaN 活性测定参照符民桂等 1 的方法.1.7CaN 蛋白表达检测心肌细胞在无血清培养液中培养 24h 后,按实验分组药物加药刺激,继续培养24h,按 Bradford 方法提取蛋白并定量,等量蛋白质加入 3加样缓冲液,煮沸 3min 后上样,在制备好的SDS 聚丙烯酰胺凝胶(分离胶 8%,积层胶 4.5%)垂直电泳,然后经电转移至 PV

    15、DF 膜上,室温下用含 5%脱脂奶粉的 TBS2T 封闭 2h,加入兔抗鼠 CaN 抗体(1:2000 稀释),4 孵育过夜 ,次日用 TBS2T 于室温下洗膜 4 次,每次 15min,接着加入辣根过氧化物酶标记抗兔 IgG(1:1000 稀释),在室温下轻轻摇动 2h,然后同样用 TBS2T 于室温下洗膜 4 次,最后用 ECL 试剂,室温下温育 24min 后对 x 光曝光,凝胶成像分析系统扫描定量,分析结果.1.8,H一亮氨酸掺人心肌细胞在无血清培养液中培养 24h 后,加入 Ang1I,STS,Ver 和 l8.5kBq,H一亮氨酸继续培养 24h.弃培养液,PBS 冲洗 2遍,用

    16、0.25%胰蛋白酶消化后收集细胞于玻璃纤维素膜上,10% 的三氯乙酸固定,滤膜烘干后用 LS3810 液体闪烁仪测定放射强度.1.9 统计学分析所有数据均以均数.4-标准差(互.4-s)表示,采用多组间方差分析及 q 检验,P0.05 为差异有显着性,P0.01 表示差异有极显着性 .2 结果2.1STS 和 Ver 对 Ang1I 诱导的心肌细胞大小的影响各实验组药物持续作用 7d 后,Ang1I 刺激组心肌细胞直径增大,与对照组相比差异有显着性(P0.05);STS 和 Ver 抑制 Ang1I 介导的心肌细胞直径增大,与 Ang1I 组相比差异有显着性(P0.05),见表l表 1STS

    17、和 Ver 对 Ang诱导的心肌细胞大小,蛋白质合成速率,CaN 活性及蛋白表达的影响(n=6)互s注:与 AnglI 组比较,P(0.05,AAP0.01;与对照组比较;P0.05, P0.012.2 心肌细胞Ca2+i 浓度在无血清培养液中培养 24h 后,按实验分组药物加药继续培养 24h,检测各组心肌细胞Cai 浓度.对照组,Ang1I 组,Ang1I+STS 组,Ang+Ver 组心肌细胞的(ca】i 浓度分别为(128 土 3)nmol/L,(177-4-9)nmol/L,(125.4-3)nmol/L和(128 土 5)nmol/L.Ang1I+STS 组Ca2i 浓度(125

    18、土 3)nmol/L低于 Ang1I 组(177.4-9)nmol/L(P0.01).用医学杂志 2006 年第 22 卷第 8 期2.3CaN 活性在各实验分组药物作用 24h 后,AngIi 刺激组心肌细胞 CaN 活性明显高于对照组(P0.05);STS 和 Vet 可明显抑制 AngII 介导的心肌细胞 CaN 活性增高,与 AngIi 组相比差异有显着性(P0.05),_见表 1,图 1.对照组 AngB 组 AngI1+STSAngII“er 组i:jAng11 组比较,P0.05:与对照组比较,P0.05图 1STS 和 Ver 对 AngII 诱导的心肌 CaN 活性的影响2.

    19、4【H】一亮氨酸掺入 Angil 作用 24h 后,AngH组心肌细胞合成速率较对照组明显增加(P0.01),SrS 和 Ver 能抑制 Angil 诱导的心肌细胞蛋白质合成速率的增加(P0.01),见表 1,图 2.25002000目嵩 1500鍪 1000I9i5000对照组 Ang组 AngII+STSIAngII+Ver 组注:与 AngH 组比较,P0.0l;与对照组比较,P(0.01图 2STS 和 Ver 对 AngII 诱导的心肌蛋白质合成速率的影响2.5CaN 蛋白表达药物作用 24h 后,Ang1I 组心肌细胞 CaN 蛋白表达明显增加,与对照组相比有显着的统计学意义(P0

    20、.01),用 STS 治疗后,CaN 蛋白表达明显降低(P0.01),见表 1,图 3.对照组 Ang1I+STS 组 Ang1T+VerAng组图 3STS 和 Vet 对 Ang诱导的心肌 CaN 蛋白表达的影响3 讨论心肌肥厚足对各种心血管刺激因子如血流动力学负荷,生长冈子以及激素等的适应性反应,但持续的心肌肥厚会导致失代偿而发生扩张性心肌病,心衰和猝死.有资料显示,许多刺激因子如机械牵张,AngII,内皮素 (endothelin.1,ET.1)均可引起心肌肥厚,而 ca 是参与心肌肥厚形成的重要分子 ,在多途857径信号传导中起中心调节作用,Angil 是调节心肌肥大的重要体液因素之

    21、一.Angil 通过 G 蛋白偶联激活细胞膜的磷脂酶系统,产生三磷酸肌醇(IP3)和二酰甘油(DK), 它们是细胞肥大生长的重要第二信使.IP3使 Ca 从肌浆网释放,且 AngI1 还能促使 ca 通过ca 通道或 Na/Ca 交换进入细胞内 J,二者均可使【ca】.增加.受 Ca/CaM 活化的 CaN 在心肌肥大的信号传递中起重要作用,活化的 CaN 可使存在于胞浆内的活化 NFAT3 去磷酸化,使 NF.AF3 转位入核,调节肥大基因的表达.丹参酮A 是丹参中最丰富,结构最具有代表性丹参酮,STS 是其提取物.在我国 ,STS 已经被制成静脉注射药用于心肌梗死或心绞痛的病人,病人的临床

    22、症状,体症和心电图都有显着的改善.ATMORE 等证明 STS 对豚鼠心脏分离的乳头肌有负性肌力作用,这种作用可随细胞外 ca 增加而逆转 .国内研究 171 也报道了类似结果.XU 等也证明 STS 可以阻断心肌细胞 L 一型 ca 通道,阻止 ca 内流,具有 ca 阻滞剂的特点.本实验在此基础上,通过对原代培养的新生大鼠心肌细胞的观察发现,Angil 刺激引起细胞ca】 i 浓度的增高 ,提示 Angil 可能通过引起细胞【ca.浓度的增高使心肌细胞 CaN 活性及其蛋白表达增加,从而导致心肌细胞肥大的产生.而 STS 及 Ver也能明显抑制 Angil 刺激引起的心肌细胞 CaN 活性

    23、及其蛋白表达的增加,其作用机制可能是因为 STS 及Ver 能够抑制细胞【ca】浓度的增高,提示 STS 可通过阻止 ca 内流,降低 CaN 活性及其蛋白表达而抑制心肌肥大的发生和发展.4 参考文献1OLSONEN,MOLKENTINJD.Preventionofcardiachypertrophybycalcineurininhibition:hopeorhypeJ?CircRes,1999,84(6):623632.f2】符民桂 ,唐朝枢.钙调仲经磷酸酶活性测定J.中国动脉硬化杂志,2000,8(1):8283【3】ttEFTIMA,HANDERBA,EPPENBERGERHM,eta1

    24、.Signalingofpathwaysincardiacmyoeytehypertrophy【J】.JMolCellCardiol,1997,29(11):28732892.41W1LKINSXSBJ,DeWINDT1J.BUENOOF,eta1.TargeteddisruptionofNI“ATc3,butnotNFATe4,revealsanintrinsicdefectincalcineurinmediatedcardiachypertrophicgrowth【J】.MolCellBiol,2002,22(21):76037613.5SCHUIZRA.YUTZEYKE.Calcineu

    25、rinsignalingandNFATactivationincardiovascularandskeletalmuscledevelopmentJ.DevBiol,2004,266(1):116.61ATMOREL.WHITINGRLCalciumentryblockingpropertiesofSodiumtanshinoneIIAsulfonatesulphonate,anactiveprincipaloftheantianginalextract,Danshen【J.BrJPharmacol.1982.75(supp1):149.【7】李芳,乇孝铭,李相忠,等.缺 m/再灌注时心肌细胞线粒体钙超载及保护的超微结构定虽观察【J.中囤病理牛理杂志 ,1992,8(6):565568.(收稿:20051130)町:兮乏!叭 0OOOOO0O一目 0_【v)掣蜒 u

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