1、 植物组织培养技术实验指导实验一 组培室设备参观及器皿的洗涤和灭菌一、目的要求：1通过参观，了解组织培养室的几个主要组成部分和各部分应有的基本设备以及有关仪器的用途与功能。2通过实际操作，学会洗涤剂的配制和各种器皿的清洗和灭菌方法。二、材料用具：高压灭菌锅、烘箱、超净工作台、双筒解剖镜、酸度测定仪、空调机、控温仪、百分之一与万分之一天平、电炉、玻璃器皿（试管、三角瓶、移液管、漏斗、烧杯、容量瓶、试剂瓶、量筒酒精灯），以及镊子、解剖刀、解剖针、手术剪，肥皂、洗衣粉、重铬酸钾、浓硫酸等。三、说明：在进行各类具体的组培实验前，首先了解组培室的结构及主要设备的用途和性能是十分必要的，总体上的了解有利于
2、以后各实验的进行以及正确的使用各种仪器和设备。植物组织培养是一项十分细致的工作，为了保证植物外植体不受污染，第一关就是要对各种器皿进行清洗和消毒，使它们保持无菌状态，做这些工作同样有一套科学的方法和需要熟练的技巧，因此每个学生必须学好这套基本功。四、方法和步骤：首先在老师带领下参观组培室，并听取讲解，然后配制洗液，称取工业用重铬酸钾 40 克，溶解在 500ml 在水中，然后徐徐加入450ml 粗制浓硫酸（或废硫酸）配好的溶液呈红色，铬酸洗液是一种强氧化剂，去污能力强，但玻璃器皿上沾有油脂、凡士林、石蜡等则用此液无效，铬酸洗液可反复使用，直到溶液呈青褐色为止。此溶液腐蚀性强，洗涤时需注意。每人
3、清洗部分玻璃器皿，方法：清水洗净泡入洗衣粉水溶液中进行洗刷清水反复冲洗蒸馏水淋一遍烘干备用。然后清洗部分较脏的玻璃器皿，方法：采用先碱后酸，即用洗衣粉洗刷后冲洗干净晾干侵入酪酸洗液，浸泡时间视器皿的肮脏程度而定清水反复冲洗干净蒸馏水淋洗一遍烘干备用。带有石蜡或胶布的器皿：先将其除去，再用常规洗涤，石蜡用水煮沸数次即可去掉，胶布粘着物则需用洗衣粉液煮沸数小时，再用水冲洗，凉干后浸入洗液，以后的步骤同前。对器皿和用具进行高压灭菌，即用手提式高压灭菌锅，在 1.1 个大气压下保持 1520 分钟。解剖刀、手术剪、解剖针、镊子等用具 在接种前还要用百分之七十的酒精棉球擦一下，再用酒精灯的火焰灭菌，冷却
4、后即可应用。五、作业：试阐述为什么要对器皿和用具进行严格的洗涤和灭菌？实验二 母液的制备及培养基的配制、灭菌一、目的要求：通过掌握培养基对母液制备及常用培养基的配制和灭菌方法，为植物组织培养准备合适的营养条件。二、材料用具：高压灭菌锅、冰箱、普通及精密天平、电炉、铝锅、玻璃器皿（烧杯、量微、容量瓶、移液管、试剂瓶、三角瓶、漏斗），化学试剂(CaCl22H2O，KNO3，MgSO 47H2O，NH4NO3，KH 2PO4，Na 2EDTA，FeSO 47H2O，MgSO 44H2O，Zn SO47H2O，H3BO3，KI，NaMoO 42H2O，CuSO 45H2O，CoCl 26H2O，甘氨酸
5、，盐酸硫胺素，盐酸吡哆醇，烟酸，肌醇，蔗糖，琼脂，若干种生长调节物质及天然复合物，HCL,NaOH,酒精)，以及称量纸、药匙、玻璃棒、精密度纸，瓶盖用纸，线绳或橡皮筋、铅笔、标签纸。三、说明：植物材料培养要获得成功，并正常生长，培养基的组成成分是一个决定性因素，不同植物要求不同的培养基，因此，在进行大量工作之前，对不同培养基应进行分析、比较、试验，选择或发展出一个符合试验材料需要的适宜培养基。大多数植物组织培养所用的培养基由无机营养物、碳源、维生素、生长调节物质和有机附加物等。四、方法和步骤：（一） 母液的制备母液的配制是按所使用药品的类别，而分别配成大量元素、微量元素、维生素和铁盐等。配制母
6、液时特别要注意无机盐成分在一起，可能产生的化学反应，如 Ca2+和 SO2-4,Ca2+,Mg2+和 PO3-4一起溶解后，会产生硫酸钙或磷酸钙的不溶物沉淀，因此不能配在一起作母液贮存，应分别配制和保存。配制母液时要用双重蒸馏水等纯度较高的水，药品应采用化学纯或分析纯级，药品的称量及定容都要准确，各种药品先以少量蒸馏水使其充分溶解，然后按培养基上的排列顺序混合。现以 Murashige 和 Skoog(1962)培养基为例叙述如下：根据各种药品的特点，母液可配成 4 种。表 1 MS 培养基母液的配制成分 规定用量/mg.L-1储备液扩大倍数称取量/ mg母液定溶体积/ml配 1LMS 培养基
7、吸取量/ml母液 大量元素KNO3 1900 20 38000NH4NO3 1650 20 33000MgSO47H2O 370 20 7400KH2PO4 170 20 3400CaCl22H2O 440 20 88001000 50母液 微量元素MnSO44H2O 22.3 200 4460ZnSO47H2O 8.6 200 1720H3BO3 6.2 200 1240KI 0.83 200 166Na2MoO42H2O0.25 200 50CuSO45H2O 0.025 200 5CoCl26H2O 0.025 200 51000 5母液 铁盐Na2-EDTA 37.3 200 7460
8、FeSO47H2O 27.8 200 55601000 5母液 有机物质甘氨酸 2.0 200 400盐酸硫胺素（Vit.B 1）0.1 200 20盐酸吡哆醇（Vit.B 6）0.5 200 100烟酸（Vit.B 3）0.5 200 100肌醇 100 200 200001000 51 大量元素和微量元素母液的配制按规定用量,称取所需的各种药品，在配制时为减少工作量，可以把几种药品（如大量元素或微量元素）配在同一母液中（见表 1）.但由于各种药品的混合，可能发生反应，生成沉淀物，以致母液失效.为避免类似现象发生，在大量元素、微量元素和维生素及氨基酸的母液配制时，可采用如下 2 种做法加以解
9、决：将要配在同一母液的大量元素、微量元素和维生素及氨基酸等化合物，按“表 1”所列药品的先后顺序溶解药品，待前一种药品完全溶解后再加入后一种化学药品，以此类推；使每种成份分别完全溶解，再把它们彼此混合.2 铁盐母液的配制铁盐的成份含硫酸亚铁（FeSO 47H2O）和乙二胺四乙酸二钠（Na 2-EDTA）.这两种化合物的溶解和混合较为严格，必须按如下方法配制，否则将会产生沉淀.该方法是：分别溶解 FeSO47H2O 和 Na 2-EDTA，加热并不断搅拌，使之完全溶解，冷却，将 2 种溶液混合，调 PH至 5.5，用蒸溜水加至所需容积，棕色瓶保存于冰箱之中.3 植物生长调节物质母液的配制植物生长
10、调节物质是培养基的重要组分之一，一般是植物激素类物质，如生长素类的 IAA、IBA、NAA，赤霉素类的 GA3，细胞分裂素类的 2，4-D、KT 和 6-BA 等.由于大多数生长调节物质难溶于水，因此配制方法也各不相同：IAA，IBA 和 GA3先用少量 95%酒精溶解，再加水定容，摇匀后贮于试剂瓶中、贴上标签后，存放在冰箱中；NAA 可用热水或少量 95%酒精溶解，再加水定容至所需容积；2，4-D 可溶于少许 1molL-1的 NaOH 溶液中，然后加水定容；KT 和 6-BA 可用少量 1molL-1的 HCl 溶解，再加水定容；玉米素先溶于少量 95%酒精中，然后加水定容.植物生长调节物
11、质浓度通常用 ppm（mgml -1）和 molL-1表示，在配制母液时，常以 ppm 较为方便，一般配制成 0.5ppm 的母液，这个浓度既便于计算，也可避免冷藏时形成结晶.4 有机附加物母液的配制在植物组织培养时，培养基中往往要加入一些有机附加物，如椰子汁，以促进组织培养活性.由于椰子汁的活性成分是耐热的，在配制时，要先把由果实中采集到的汁液加热煮沸以除去其中的蛋白质，过滤，然后置塑料瓶中贮存于的-20 0c 的低温冰箱内.（二）培养基的配制1 量取所配培养基总体积的 2/3 体积的蒸馏水，如要配 l 升培养基,先量取约 700 ml 体积的水。表 2 根据培养基配方， 用量筒量取所需要的
12、各种元素的母液。物质 加入体积或重量大量元素母液(20) 50ml微量元素母液(200) 5ml铁盐母液(200) 5ml有机物质母液(200) 5ml蔗糖 30g琼脂 8g吸取母液时，注意应先将几种母液按顺序排好，不要弄错以免使培养基中药品成分发生改变。在培养不同的外植体时，应加入不同的激素。加入一种母液后应先搅拌均匀，避免因不均而使局部浓度过高而引起沉淀，琼脂可于加入蔗糖调节完 pH 值后再加入，此时应注意搅拌，以免琼脂或蔗糖沉淀于烧杯底而炭化。加热至沸腾片刻，以使琼脂充分溶解，检查时可注意烧杯内溶液是否透明。3 调节培养基的 pH 值，用 pH 计或 pH 试纸测定培养基的 pH 按照培
13、养材料的要求分别用 1 mol/L NaOH 溶液、1 mol/L HCl 溶液来调节所配制培养基的 pH 值，一般培养基的 pH值约为 5.8，培养的材料不同，对培养基的 pH 值要求也不同。4 分装 将配制好的培养基分别装在事先洗净的三角瓶，用锡铂纸封口，注明标签，然后和用牛皮纸或报纸包好的培养皿及用三角瓶装好的蒸馏水一道进行高压灭菌。5 培养基的灭菌 培养基灭菌一般采用湿热灭菌法，即将分装好的培养基放在高压灭菌锅中，加热，待压力上升到 0.5kg/cm2 时，打开放气阀排净冷空气，关闭放气阀继续加热使压力稳定在 1.1-1.2kg/cm2，温度为 121 摄氏度的条件下，维持 15-20
14、 分钟，培养基灭菌时间不宜过长，以防引起培养基成分的变化，灭菌后的培养基置于室温下贮存（最适宜的温度为 10 摄氏度），一般培养基在灭菌后二星期内应用。6 培养基的保存 消毒过的培养基通常放在接种室或培养室中保存，一般 应在消毒后的两周内用完，最好不要超过一个月。实验三 细叶连翘愈伤组织的诱导和增殖一、目的要求：掌握植物组织培养的基本技术和方法。二、实验原理：植物组织培养的理论依据是植物细胞具有全能性，所谓细胞全能性是指植物体任何一个细胞都携带着一套发育成完整植株的全部遗传信息，在离体培养情况下，这些信息可以表达，产生出完整植株。要使细胞所具有的全能性表达出来，除了生长以外，还要经过脱分化和再
15、分化等过程。分化了的植物根、茎、叶细胞，通过脱分化培养可以产生愈伤组织。愈伤组织是一种能迅速增殖的无特定结构和功能的细胞团。愈伤组织经过进一步的分化培养，提供不同的营养和激素成分，又可再生出完整的小植株。植物组织培养技术，不仅具有重大的理论意义，而且在生产实践中已显示了广泛的应用前景。三、材料用具：细叶连翘叶片、分析天平、超净工作台、高压灭菌锅、培养箱或培养室、剪刀、镊子、手术刀、电炉、烧杯、试剂瓶、培养瓶、酒精灯、精密 pH 试纸四、试验方案本试验以 MS 培养基为基本培养基，采用正交设计探索生长因子6-BA、2,4-D、NAA 对细叶连翘幼嫩叶片愈伤组织诱导的适用量，每个因子设三种水平（表
16、 1），构成三因素三水平的试验设计（表 2）。表 1 叶片愈伤诱导正交设计因素水平表因素水平 6-BAmg/L2,4-Dmg/LNAAmg/L1 0.1 0.1 0.12 0.5 0.5 0.53 1.0 1.0 1.0表 2 叶片愈伤诱导正交设计表处理 6-BA 2,4-D NAA1 0.1 0.1 0.12 0.1 0.5 0.53 0.1 1.0 1.04 0.5 0.1 0.55 0.5 0.5 1.06 0.5 1.0 0.17 1.0 0.1 1.08 1.0 0.5 0.19 1.0 1.0 0.5本试验以 MS 培养基为基本培养基，采用随机区组试验探索生长因子6-BA、NAA
17、对细叶连翘愈伤组织增殖的适用量，每个因子设三种水平，构成 9 个处理的随机区组试验设计（表 3）。表 3 愈伤增殖激素组合配比表(单位：mg/L)因素 1 2 3 4 5 6 7 8 96-BA 0.5 0.5 0.5 1.0 1.0 1.0 2.0 2.0 2.0NAA 0.01 0.1 0.2 0.01 0.1 0.2 0.01 0.1 0.2四、方法和步骤1 愈伤组织的诱导(1) 将细叶连翘的幼嫩叶片用自来水冲洗净，再用饱和的洗衣粉浸泡 30min,冲洗 30min，在超净工作台中，用 70%乙醇浸泡 30S，无菌水冲洗一次，转入 0.1%升汞中消毒 8min，在消毒过程中不断振荡使外植
18、体充分接触消毒剂，倒出消毒剂，用无菌水冲洗叶片 3-5 次。(2) 将消毒后的叶片在无菌滤纸上吸干水，用无菌解剖刀切成0.5cm0.5cm 的小片。(3) 将切好的小叶片接入表 2 所示 9 种培养基中。(4) 在 25C1C，光照 16h/d 条件下进行培养。(5)1 周后在叶片切口边缘出现愈伤组织，培养 4-6 周，愈伤组织达到高峰。2 愈伤组织的增殖(1) 将生长良好的愈伤组织从外植体上切下，切掉变成褐色的部分，其余部分切成约黄豆大小，接入表 3 所示 9 种培养基中。(2) 在 25C1C，光照 16h/d 条件下进行培养。(3) 愈伤组织生长旺盛，呈浅绿色或浅黄色，质地较为疏松。3
19、实验结果观察及记录对愈伤组织诱导及生长情况拍照记录。材料接种后，在固定周期内对材料的污染率、褐化率、死亡率、愈伤启动率以及愈伤组织诱导率等情况做观察记载及必要的统计，并根据需要调整试验步骤。以下为一些数据记录公式：启动率未污染外植体启动数/未污染外植体总数100污染率接种污染数/接种总数100%死亡率未污染死亡数/未污染总数100褐化率未污染褐化数/未污染总数100愈伤组织诱导率产生愈伤组织的块数/接种的总块数100其中，有部分外植体并未完全褐化，也长出部分愈伤组织，对于此种外植体，记录数据时，既将其当成褐化外植体同时也当成产生愈伤的外植体。用 SPSS 统计分析软件进行数据的方差分析。实验四
20、 树型金银花愈伤组织的诱导和增殖的研究实验一、实验设计1 研究的技术路线在查阅有关文献资料的基础上，结合预备试验，主要采用芽、幼嫩茎段和幼嫩叶片，着重从诱导愈伤方面研究树型金银花愈伤最佳诱导体系，主要采用单因素、双因素、以及多因素正交设计的方法，同时用多元分析法进行分析，从而摸索出最佳诱导愈伤条件。筛选出最优体系，具体技术路线如下图：外植体选取 外植体表面灭菌 愈伤组织的诱导愈伤组织的增殖图 1 技术路线2 试验方案植物的最佳繁育方法，首先是由其遗传特异性决定的，单就组织培养而言，它还受植物基因型、外植体种类、部位及培养基种类、激素类型及浓度、培养条件等诸多因素的影响。本试验在参考已有资料的基
21、础上采用正交设计和随机区组试验设计，注重启动培养基配方的研究，各阶段设计方案如下：2.1 芽愈伤组织的诱导本试验以 MS 培养基为基本培养基，MS 培养基配方见表 2、表 3和表 4。采用随机区组试验设计探索生长调节因子 6-BA,NAA 对树型金银花顶芽或侧芽诱导愈伤组织的适用量，6-BA,NAA 8 个处理的随机区组试验设计（表 2）。表 2 芽愈伤诱导激素组合配比表(单位：mg/L)水平因素1 2 3 4 5 6 7 86-BA 1 1.5 2 2.5 1 1.5 2 2.5NAA 0.05 0.05 0.05 0.05 0.1 0.1 0.1 0.12.2 茎段愈伤组织的诱导本试验以
22、MS 培养基为基本培养基，MS 培养基配方见表 1。表 2.3表 2.4。采用随机区组试验设计探索生长调节因子 6-BA,NAA 对树型金银花茎段诱导愈伤组织的适用量，6-BA,NAA 8 个处理的随机区组试验设计（表 2）。2.3 叶片愈伤组织的诱导(1) 正交实验设计本试验也是以 MS 培养基为基本培养基，采用正交设计探索生长因子 6-BA、2，4-D、NAA 以及蔗糖浓度对树型金银花幼嫩叶片愈伤组织诱导的适用量，每个因子设三种水平（表 3），构成四因素三水平的试验设计（表 4）。表 3 叶片愈伤诱导正交设计因素水平表因素水平 2,4-D 6-BA NAA 蔗糖mg/L mg/L mg/L
23、 g/L1 0.5 0.1 1.0 152 1.0 0.5 2.0 303 2.0 1.0 3.0 45表 4 叶片愈伤诱导正交设计表处理 2,4-D 6-BA NAA 蔗糖1 0.5 0.1 1 152 0.5 0.5 2 303 0.5 1 3 454 1 0.1 2 455 1 0.5 3 156 1 1 1 307 2 0.1 3 308 2 0.5 1 459 2 1 2 15(2)单因素诱导叶片愈伤本试验也是以 MS 培养基为基本培养基，采用随机区组试验设计探索生长因子 2，4-D 不同浓度对树型金银花幼嫩叶片愈伤组织诱导的影响，该因子设四种水平（表 5），构成单因素四水平的试验设
24、计。表 5 叶片愈伤诱导 2，4-D 单因素水平表水平（mg/L）1 2 3 42，4-D 0.5 1.0 1.5 2.03 试验方法3.1 培养基的选择查阅的中文文献和外文文献中绝大多数金银花的组培都选用MS（Murashing and Skoog,1962）培养基，这说明 MS 培养基为金银花组培的经典培养基，故三种外植体均选取 MS 培养基为基本培养基，以节约时间和减少浪费。3.2 培养基的灭菌根据试验设计各阶段所需要培养基。培养基配制好后进行认真严格的湿热灭菌，灭菌条件为 121C，约 110Pa 下灭菌 20 分钟，灭菌完成后取出待其冷去凝固后使用。如果为固体培养基，则在取出后应该适
25、当摇荡使培养基里面的琼脂充分混匀，以防培养基凝固不好。3.3 激素的选取根据外植体的不同分别选取了不同的激素，这些激素分别是:6-BA、NAA、2，4-D 。3.4 外植体的选取冬芽 选取 3 月份未萌发的芽,去除外层叶片。幼嫩茎段 尽量选取茎段顶层。叶片选取幼嫩叶片。3.5 外植体灭菌灭菌试剂的选取 75%酒精，0.1%升汞，30% 次氯酸钠。3.5.1 金银花芽的灭菌由于金银花芽外面常粘附有泥土，且冬芽的外层披一层绒毛，所以在进行灭菌前应进行预处理，尽量减少其表面微生物数量，降低接种后的污染率。具体处理方法为:取回顶芽，将其最外层叶片剥离，然后将其放入烧杯中，加纯净水和少量洗洁精后，放在双
26、向磁力加热搅拌器双向磁力加热搅拌器上搅拌数分钟，取出材料准备正式灭菌。a 灭菌试剂分别选用 75%酒精+0.1%升汞、75%酒精+30%次氯酸钠这两种组合进行对比灭菌处理，选择最合适灭菌试剂。b 灭菌时间75%酒精灭菌时间均为 30s，0.1%升汞灭菌时间分为三个梯度，分别为 6min、8min、10min；30%次氯酸钠则分为两梯度，分别为20min、30min。从而选择最佳灭菌试剂以及其最佳灭菌时间。c 灭菌流程75%酒精+0.1%升汞先用 75%酒精浸泡 30s，然后用无菌水清洗一次，倒去无菌水后，再用 0.1%升汞+12 滴吐温灭菌，灭菌过程中不断摇动广口瓶使外植体充分接触灭菌剂，然后
27、，倒出灭菌剂，用无菌水清洗外植体 5-6次，直到外植体上没有泡沫即可。75%酒精+30%次氯酸钠先用 75%酒精浸泡 30s，然后用无菌水清洗一次，倒去无菌水后，再用 30%升汞+12 滴吐温灭菌，灭菌过程中不断摇动广口瓶使外植体充分接触灭菌剂，然后，倒出灭菌剂，用无菌水清洗外植体 5-6 次，直到外植体上没有泡沫即可。3.5.2 金银花幼嫩茎段的灭菌灭菌前茎段预处理：由于树型金银花茎段均为中空结构，且表面披一层较致密绒毛，故在取材时不应将材料剪的过短，防止外界细菌以及真菌通过中空管道直接进入茎段内部，从而导致灭菌不彻底，另外，由于表面披绒毛，容易沾染微生物，且在灭菌过程中灭菌剂不能很好的与精
28、短表面接触，故在灭菌处理前可用毛笔蘸取少许洗洁精或者吐温来回轻轻刷洗其表面绒毛，减少其染菌几率。a 灭菌试剂 选用 75%酒精+0.1%升汞这一组合进行灭菌。b 灭菌时间75%酒精灭菌时间 30s，0.1%升汞灭菌时间为 6min、8min、10min 这三个梯度。c 灭菌流程先用 75%酒精浸泡 30s，然后用无菌水清洗一次，倒去无菌水后，再用 0.1%升汞+12 滴吐温灭菌，灭菌过程中不断摇动广口瓶使外植体充分接触灭菌剂，然后，倒出灭菌剂，用无菌水清洗外植体 5-6次，直到外植体上没有泡沫即可。3.5.3 金银花幼嫩叶片的灭菌 灭菌前应先用毛笔蘸取吐温或者洗洁精来回刷洗其正反两面，应轻轻刷
29、洗，洗洁精或者吐温的量不能太多，加 1 滴既可，加入过多会使叶片出现类似于被折叠后产生的变色以及变薄现象，可能原因是过量的清洁剂会使叶片细胞受到一定损伤。a 灭菌试剂选用 75%酒精+0.1%升汞这一组合进行灭菌。b 灭菌时间75%酒精灭菌时间 30s，0.1%升汞灭菌时间为 3min、5min、6min 这三个梯度。c 灭菌流程先用 75%酒精浸泡 20s，然后用无菌水清洗一次，倒去无菌水后，再用 0.1%升汞+1-2 滴吐温灭菌，灭菌过程中不断摇动广口瓶使外植体充分接触灭菌剂，然后，倒出灭菌剂，用无菌水清洗外植体 5-6 次，直到外植体上没有泡沫即可。3.6 外植体的接种3.6.1 芽的接
30、种芽全部采取斜插入培养基的接种方法进行接种。接种前先将灭菌好的冬芽放入已灭菌的带滤纸的培养皿中，将其表面的水吸干，再用镊子小心将芽最外层的因灭菌而褐化死亡的叶片剥去，然后用解剖刀切去芽基部茎段的一部分制造上口后，将芽小心些插入培养基中即可将其放在培养室中培养架培养。3.6.2 茎段的接种茎段也全部采取斜插入培养基的接种方法进行接种。接种前先将灭菌好的茎段放入已灭菌的带滤纸的培养皿中，将其表面的水吸干，再用解剖刀小心将茎段两端因灭菌而褐化死亡的部分切去，然后再用解剖刀将茎段切成约 0.5cm 长小段后，小心将这些小段平放在培养基中后，即可将其放在培养室中培养架上培养。3.6.3 叶片的接种叶片接
31、种前应先对叶片进行预处理，首先将灭菌好的叶片放入已灭菌的带滤纸的培养皿中，在滤纸上吸干叶片表面水分后，用剪刀小心将叶片边缘剪去薄薄一小圈，然后，用解剖刀将叶片在一部分接种时需要接触培养基的一面小心轻轻划上一些小伤口，另一部分不划，最后用剪刀将叶片剪成 0.5cm0.5cm 的小片，准备接种。叶片接种进行两种接种方法的对比：a 叶片正面朝上将一部分反面用解剖刀处理过的小叶片接种在培养基上，反面接触培养基，而正面朝上接入培养基；另一部分反面没有用解剖刀划过伤口的叶片也接种在同样的培养基上，进行比较；接种好后即可将它们放在培养室中培养架上培养。b 叶片反面朝上将一部分正面用解剖刀处理过的小叶片接种在
32、培养基上，正面接触培养基，而反面朝上接入培养基；另一部正面没有用解剖刀划过伤口的叶片也接种在同样的培养基上，进行比较；接种好后即可将它们放在培养室中培养架上培养。3.7 培养条件3.7.1 芽和茎段的培养条件温度 24C2C,光照 16h 黑暗 8 小时的光暗交替培养，日光灯。3.7.2 叶片的培养条件分两部分进行培养，从而寻找哪种培养条件适合叶片愈伤组织的诱导，以下为两中对比：a 一部分叶片在温度 24C2C 下,暗培养 15 天左右，再进行光暗交替培养。b 另一部分直接放在 24C2C 下，光照 16h 黑暗 8 小时的光暗交替培养条件下进行培养。3.8 试验观察与统计3.8.1 数据记录
33、及现象观察材料接种后，在固定周期内对材料的污染率、褐化率、死亡率、愈伤启动率以及愈伤组织诱导率等情况做观察记载及必要的统计，并根据需要调整试验步骤。以下为一些数据记录公式：启动率未污染外植体启动数/未污染外植体总数100污染率接种污染数/接种总数100%死亡率未污染死亡数/未污染总数100褐化率未污染褐化数/未污染总数100愈伤组织诱导率产生愈伤组织的块数/接种的总块数100其中，有部分外植体并未完全褐化，也长出部分愈伤组织，对于此种外植体，记录数据时，既将其当成褐化外植体同时也当成产生愈伤的外植体。3.8.2 数据处理与分析用 SPSS13.0 统计分析软件进行数据的方差分析。实验五 园艺植
34、物茎尖脱毒培养一、目的要求：练习对茎尖外植体的剥离、灭菌和接种等无菌的操作方法，熟悉快速繁殖和获得无病毒植株的全过程。二、材料用具：超净工作台、双筒解剖镜、剪刀、镊子、解剖针、解剖刀、广口瓶、烧杯、培养皿、酒精灯、升汞、酒精、吐温20、无菌水、培养基、记号笔、纱布、酒精棉球、温室盆栽葡萄、菊花的侧芽、不结球白菜的侧芽等材料。三、说明：植物茎尖处于比较幼嫩的部位，其细胞具有旺盛的生能力，易于培养而获得成功。茎尖培养根据其目的不同，取材的大小有较大的差异，较小的仅为十至几十微米的茎尖分生组织，较大的可利用几十毫米的茎尖甚至更大的芽，但一般讲茎尖愈小（小到 50100 微米的生度点）培养难度就越大，
35、有的需要一年或更长的时间才能成苗，茎尖越大培养越易获得成功。如果进行植物快速繁殖，则采用较大的茎尖，以带有叶原基的生长为宜，这样既能提高成活率，又能加快繁殖速度，如以脱毒为目的，则采用较小的茎尖，因为病毒在植株上的分布是不均匀，一般幼嫩的组织器官中病毒含量极低，以生长点含病毒最少，甚至不含病毒，所以进行脱毒种苗培养，应尽量采用极小的茎尖生长点进行培养，以获得脱毒苗。四、方法和步骤（以葡萄为例）：（1）选择品种性状典型的，生长健壮无病虫的葡萄植株，取其已萌动的顶芽或腋芽，或剪下 35cm 生长的茎顶端，剥去大叶片，先在流水中冲流 23 小时，吸干水分，再在 70%乙醇中浸半分钟，然后放入 0.1
36、%升汞滴加 12 滴吐温20 的溶液中灭菌 5 分钟，用无菌水冲洗 35 次。（2）在超净工作台上把灭菌的茎尖放在双筒解剖镜下剥去较小的叶片，根据不同目的，可取只带 23 个叶原基的生长点甚至不带叶原基的生长点，或带 23 片幼叶的茎尖。生长点剥离方法：在解剖镜下，一手用镊子夹住无菌的茎尖，一手用较细的解剖针剥掉生长点外围的叶片，直至达到晶莹发亮的光滑顶为止，然后用解剖刀仔细切取所需茎尖，随即接种在预先配制好的培养基上。（3）培养基：茎尖分化培养基：MS+BA1mg/L+NAA0.01mg/L+LH100mg/L,生根培养基：MS+IAA0.4mg/L+NAA0.5mg/L+IBA0.1mg/
37、L.茎尖培养对培养容器无特殊要求，一般以 15cm20cm 的试管，或50ml 三角瓶为宜，每支试管装 10ml 培养基，每只三角瓶装 25ml 培养基，每管或每瓶接种一个茎尖。（4）培养：接种的茎尖置于培养室内培养，温度 25 摄氏度2 摄氏度，光照 2000Lux,以日光灯为光源，每天照光 10 小时。五、作业：1、每人接种茎尖 4 个，要求二个剥至带 23 个叶原基的生长点。2、定时观察记录：幼苗分化和生根情况。3、试述利用茎尖培养为什么能够脱除病毒。 实验六 园艺植物的花药培养一、目的要求：学习园艺植物花药的采集、灭菌、接种、培养等一整套花药培养的具体方法。二、材料用具：苹果花药、批杷
38、花药、不结球白菜花药、番茄花药、四季海棠花药、天竺葵花药等，纱布、塑料袋、三角瓶、70%酒精、冰箱、显微镜、醋酸洋红、载玻片、盖玻片、MS 培养基的各种化学药品。各种灭菌、接种、培养用具和器皿等。三、说明：花药培养是植物育种的一种有效方法，即用离体花药培养的方法，使其中的花粉发育成一个完整的植株，这种花粉植株的染色体数目为体细胞的一半，称为单倍体植物，据统治到 1983 年止，通过花药培养已从 250 多种植物中得到了单倍体植株。利用花药组织进行单倍体育种对多年生果树和观赏树木而言比一、二年生植物具有特殊的意义，因为多年生木本植物的品种几乎都是杂合体，加之又多为异花授粉，难以纯化，通过这一途径
39、获得得单倍体后再使之加倍，就能得到纯合二倍体，从而为准确研究性状遗传规律和杂种优势的利用打下基础。四、方法和步骤：1、镜检确定花粉发育期：园艺植物花药培养是以采集花粉处于单核期的花药进行培养易获得成功。本实验在培养前先采集处于该时期的花蕾利用醋酸洋红压片法进行镜检，选取适宜的花粉发育时期。2、预处理：采集花蕾，用湿纱布包好放入塑料袋，置于 35 摄氏度冰箱中处理 7 天左右。3、培养基准备：采用 MS 培养基 + 2，4-D 0.4mg/L +KIN 0.2mg/L + IAA4mg/L + 蔗糖 3-8%。4、花药灭菌及接种：接种前花蕾经 0.1%升汞灭菌 1015 分钟，然后用无菌水冲洗
40、35 次，在无菌条件下取出花药进行接种，注意不要破坏花药，每瓶接种 2030 个花药。5、诱导培养：将培养瓶置于温度 2530%，光强 15002000Lux,每天光照相馆 0 小时的培养室中，诱导形成体胚或愈伤组织。6、分化及再生：将胚状体或愈伤组织及时转入分化培养基，即在MS 培养基中加入 6BA。五、作业：定时观察：胚状体和愈伤组织的分化情况。实验七 试管苗的移栽一、 目的要求：学习试管苗的移栽方法，提高试管苗的成活率。二、材料用具：葡萄试管苗、营养钵、小手铲、脸盆、蛭石及泥炭等基质、喷壶、塑料薄膜。三、说明：当葡萄无菌苗长到高 510cm 时即可移栽入土，由于在室内人工光照下培养的试管苗十分幼嫩，因此要成功的大量移栽试管苗，必须掌握以下几个环节：1.选择健壮的幼苗，要求节间短而粗壮、叶片大而浓绿，展叶四片以上，没有水渍壮叶，具有三条以上的根，根尖为黄白色，不发黑。2.逐步增加光照强度和降底空气相对湿度，促使试管苗慢慢适应自然生长条件。3.选用合适的驯化基质。四、方法和步骤：
