1、 中药复方 962 胶囊对老年大鼠海马区神经生长因子及摘 要 目的：在老年性痴呆的发病中，年龄是最主要的危险因素，随年龄增长，发病率显著增高，自然衰老大鼠模型是比较接近老年性痴呆病理改变的动物模型。我们以往的实验证明：中药复方 962胶囊(含何首乌、石葛蒲等六味中药)能显著改善老年大鼠学习记忆功能。本研究观察中药复方 962 胶囊对自然衰老大鼠模型海马CAICA4 区神经生长因子(NGF)及其受体 TrK A 表达的影响，探讨中药复方 962 胶囊治疗改善学习记忆功能的作用机理。方法：雌性)0.56g/kg，中药复方 962 胶套高剂量 1.8gkg，962 胶囊低剂量0.9gkg，每日灌胃给
2、药一次，连续灌胃 2 个月，进行学习记忆实验(水迷宫 )和旷场分析后，每组随机选取 5 只，灌注固定，冰冻切片，片厚 40m，每份标本均 ABC 法行 NGF 和 TrK A 免疫组化染色。采用法国 Noesis Vision 公司 VISILOG5.0 图象分析系统对组织切片进行分析。显微镜放大倍数为 1010，在海马 CAl 区锥体细胞层连续摄取 3 个视野，这三个视野包括了整个 CAl 区，记数 3 个视野内总阳性细胞数量、 阳性细胞总面积(象素单位)及阳性细胞灰度积分值(灰度单位) 。海马 CA2 区连续摄取 2 个视野，海马 CA3 区连续摄取 2 个视野，海马 CA4 区摄取齿状回
3、包含的 1 个视野，包括了整个 CA2、CA3 、CA4 区。数据用均数标准差表示(M SD)，结果采用 t 检验。结果：老年大鼠海马 CAl、CA2、CA3、CA4 区NGF 表达较青年对照明显减少，阳性细胞数量为青年对照的19.89，11.46，6.65和 26.32；阳性细胞总面积为青年对照的 13.97，6.76，5.19和 25.01；阳性细胞灰度积分值为青年对照的 41.05，35.49，16，74和 29.17。海马CAl、 CA2、 CA3、CA4 区神经生长因子受体 Trk A 表达较青年对照也明显减少，阳性细胞数量为青年对照的 12.42，7.07，9.26和 6 7 8
4、9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 lang=EN-US29.33；阳性细胞总面积为青年对照的7.61，4.92，5.62和 23.79；阳性细胞灰度积分值为青年对照的 29，30，18.70，17.51和 34.19。以 CA2、CA3 区的减少最严重。中药复方 962 胶囊和脑复康均能提高老年大鼠海马CAl 一 CA4 区 NGF 和 Trk A 阳性细胞数量、阳性细胞总面积和阳性细胞灰度积分值，962 胶囊高剂量组基本恢复青年对照组水平。结论：老年大鼠神经生长因子(NGF)及其受体 Trk A
5、在海马区表达明显减少，可能与其学习记忆能力下降有关；中药复方 962 胶囊能够明显促进老年大鼠海马区 NGF 及受体 TrK A 表达，可能是改善其学习记忆功能的药理学基础。增强内源性神经营养物质的表达对老年性疾呆的治疗有重要意义。关键词 中药 老年 大鼠神经生长因子 TrK A 受体前 言 老年性疾呆 (Alzheimers disease。AD)是一种老年神经退行性疾病，临床以进行性记忆障碍和后天获得性知识丧失为特征，原因不明，尚元有效的治疗方法。自然衰老大鼠模型是比较接近老年性痴呆病理改变的动物模型。我们以往的实验证明：我室自行组方并研制的新复方 962 胶囊(含何首乌、石葛蒲等六味中药
6、) 能显著改善老年大鼠学习记忆功能。神经生长因子(nerve growth factor，NGF)在调节神经元生长和存活方面起着重要作用，AD 过程中神经元的丢失至少部分是由于神经营养因子的缺乏。本文观察自然衰老大鼠脑内是否发生神经生长因子(NGF)及其受体 Trk A 表达的变化，以及 962 胶囊对内源性 NGF 及其受体 Trk A 表达的影响，探讨 962 胶囊改善学习记忆功能的作用机理。 材料和方法1 药品： 中药复方 962 胶囊，委托北京第四制药厂加工提供，批号：980515，每克干粉含生药量 6.25 克。实验时采用水溶解，动物灌胃量 10m1kg。阳性对照药品：脑复康 (pi
7、racetam)，由北京市曙光制药厂提供，批号：970618，京卫药准字(1996)第 138050 号。实 验时用水溶解配成 0.056gm1。2 动物： Wistar 大鼠雌性，老年大鼠为 22 月龄(体重 33032g)，青年为 5 月龄(体重 32519g)。购于北京医科大学动物中心，动物证号：医动字 013056。3 试剂与主要仪器： ABC 试剂盒、神经生长因子(NGF)兔抗鼠抗体、酪氨酸蛋白激酶受 体 A(Trk A，主要为 NGF 的受体) 兔抗鼠抗体均购自北京中山试剂公司；恒温冷冻切片机为英国山盾公司ASE620 型，光学显微镜为 NikonTE300 6 7 8 9 10
8、11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 型，图象分析系统为法国 NoesisVision 公司 VISIUG5.0。4 方法：(1) 分组与给药：分组情况见表 1，每日灌胃给药一次，灌胃 2个月后，进行学习记忆实验(水迷宫)和旷场分析，然后灌注固定，取材进行组织形态学实验。表 1 大鼠分组给药情况 分组给药折合成人剂量的倍数青年对照水老年模型水脑复康脑复康(0.56gkg)7 倍962 胶囊低剂量962 胶囊(0.9gkg)7 倍962 胶囊高剂量962 胶囊(1.8g 从 g)14 倍注：962 胶囊成人临床用量
9、：7 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 .5g60kg日 (2)脑标本的免疫组化染色：每组随机选取 5 只，灌注固定，冰冻切片，片厚 40m，为冠状切面前囱后4.4mm。PBS 洗 5 分钟3 次，3H202 室温孵育 10 分钟，PBS 洗 5 分钟 3 次；810封闭用羊血清孵育 20 分钟，吸出，加稀释好的一抗 4过夜(一抗稀释度：NGFl：120 ，TrkAl：120)；PBS 洗，加生物素化的兔二抗(1：200稀释)室温放置 3 小时 3PBS 洗，加辣根过氧化物酶标记的三抗(
10、1： 250 稀释) 孵育 2 小时；PBS 洗，DAB 显色 2 分钟，镜下控制染色程度；Carriz 浅复染细胞核，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。阴性对照设立；分别以洗液和非免疫的正常鼠血清代替一抗进行免疫组化染色，余步骤同前。阳性反应为组织细胞结构呈棕黄色颗粒聚集。(3) 图象分析处理：采用法国 NoesisVision 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 “FONT-FAMILY: 宋体“公司 VISII。OG5.0 图象分析系统对组织切片进行分析。显微镜放大倍数为 10
11、10。在海马 CAl 区锥体细胞层连续摄取 3 个视野，这三个视野包括了整个 CAl 区，记数 3 个视野内总阳性细胞数量、阳性细胞总面积(象素单位)及阳性细胞灰度积分值(灰度单位) 。海马CA2 区连续摄取 2 个视野，海马帜 3 区连续摄取 2 个视野，海马CA4 区摄取齿状回包含的 1 个视野，包括了整个 CA2、CA3、CA4区。(4) 统计学处理：本研究均使用 SPSS 软件进行分析，数据用均数标准差表示(MSD)， 结果采用 t 检验。实验结果1 中药复方 962 胶囊对老年大鼠海马 CAl 一 CA4 区神经生长因子(NGF)表达的影响结果见表 2。青年对照大鼠海马 CAl 一
12、CA4 区 NGF 阳性神经元分布较多，老年大鼠 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 模型组海马区 NGF 阳性神经元数量、阳性细胞面积及阳性细胞灰度积分值与正常青年对照组相比均显著减少；图象分析结果表明，老年大鼠阳性细胞数量在 CAl 一 CA4 区分别为青年对照的 19.89， 11.46，6.65和 26.32；阳性细胞总面积为青年对照的 13.97，6.76，5.19和 25，01阳性细胞灰度积分值为青年对照的 41.05，35.49，16.74和 29.17，其中老年大鼠海马 C
13、A2、CA3 区 NGF 的表达减少最严重。962 胶囊与脑复康给药组老年大鼠，海马 CAl 一 CA4 区 NGF 阳性神经元数量、阳性细胞面积及阳性细胞灰度积分值有不同程度的增加。962 胶囊大剂量组(1.8g，kg) 老年大鼠海马各区的 NGF 阳性神经元基本恢复青年对照水平，阻性细胞数量是未用药模型组的 4.5，5.1，9.7 和3.4 倍；阳性细胞总面积为模型组的 7.6，9.8，12.5 和 4.0 倍；阳性细胞灰度积分值为模型组的 1.9，2.5，6.8，3.7 倍，962 胶囊对老年大鼠海马 CA2、CA3 区 NGF 的表达增加作用最明显。 表 2 962胶囊对老年大鼠海马
14、CAl 一 CA4 区神经生长因子(NGF)表达的影响 NGF海马区青年对照老年模型脑复康962 胶囊962 胶囊阳性细胞数量 (056Bk8)(0 9Bk8)(1， 8Bk8)6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 CA1119876.323812474059.278647.71321696*CA22127110，4*2442581341559*1106838*147564.1*CA3142549.4*957.5112.O56.4*75576.9*l01953.2*CA4386 6 7 8
15、9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 le=“FONT-SIZE: 7.5pt; FONT-FAMILY: 黑体“ 22.6*10210439921.8*36328.3*45.l30.7*Total51362544*67827836011770*3009 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 lang=EN-US style=“FONT-SIZE: 7.5pt“19584266202.2*阳性细胞总面
16、积(10象素单位)CA1330222*4，63.4181145252180*39622.4*CA280448.5*546.948627.9*44537.9*58127.1*CA3471214*24 土 2233.5208*28134 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 ，3325107*CA411186*283.3804.6*13496*140118*T0taI171790.7*15 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
17、25 26 27 28 29 30 ; FONT-FAMILY: 黑体“376108261.9*1112818*146359.6*阳性细胞灰度积分值( 10灰度单位)CAl354150*14510430415029115，74289.1*CA2474148*16813460121.4*37221.0580178*CA36 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 ng=EN-US style=“FONT-SIZE: 7.5pt“452144*76706134Q4*32932.959427.6*CA4
18、262163*767.834027.5*22719535832.4*Totd1541379*46522.31858915*1219847*1960753*n5，x 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 SIZE: 7.5pt; FONT-FAMILY: 宋体“s， 与老年模型组比较， * P005， * P001， * P0001， 2 中药复方 962 胶囊对老年大鼠海马 CAlCA4 区神经生长因子受体 Trk A表达的影响 结果见表 3。老年大鼠模型组海马 CAl 一 CA4 区神经生
19、长因子受体 TrkA 阳性神经元显著少于青年对照组，阳性细胞数量分别为青年对照的 12.43，7.07，9.26和 29，335 阳性细胞总面积为青年对照的 7.61，4，92，5.62和 23.79；阳性细胞灰度积分值为青年对照的 29.30，18.70，17，51和 34，19。962胶囊与脑复康有增加的作用。962 胶囊大剂量组(1.8gkg) 促进老年大鼠海马各区 Trk A 表达的作用最显示，阳性细胞数量是末用药模型照的 4.1，9.6，8.2 和 2.6 倍；阳性细胞总面积为模型组的6.1，12.8，14，3，3.5 倍；附性细胞灰度积分值为模型组的2.2，4，9，5.4，1.1
20、倍，962 胶套对老年大鼠海马 CA2、CA3 区 T山 A 表达的增加作用最明显。 表 3 962 胶囊对老年大鼠海马CAlCA4 区 Trk A 表达的影响 NGF海马区青年对照老年模型6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 E: 7.5pt; FONT-FAMILY: 宋体“脑复康962 胶囊962 胶囊阳性细胞数量(0.56g/kg)(0.9g kg)(1.8g kg)CAl163.9 土 139.6*20.416.977.643.7*67.152.1*104.489.3*CA2205
21、.9 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 FONT-SIZE: 7.5pt; FONT-FAMILY: 楷体_GB2312“147.0*14.618.7127.478.4*102.4108.7154.893.3*CA3117.468.1*10.95.451.5*78.774.1*99.855.1*CA451.024.0*15.010.747.626.0*30.222.154.130.5*Total538.3364.7*60.839.6343.2183.7*278.4217.5*413.12
22、55.4*阳性细胞：总面积(103 象素单位)CA177.959.0*5.96.651.64.75*24.616.1*6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 style=“FONT-SIZE: 7.5pt“41.831。7*CA2l12.965.71*5.69.970.942.8*44.155.477.554.6*CA356.o34.3*3.12.151.631.6*31.939.347.321.6*CA428.020.06.76.222.511.2*6 7 8 9 10 11 12 13 1
23、4 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 12.716.030.222.6Total274.8161.5*21.318.7196.6115.4*113.3102.2*196.8113.7*阳性细胞灰度积分值(l02灰度单位)CA141.526.8*12.210.628.612.2*25.426.338.726.5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 .5pt“CA245.87.2*8.68.343.530.9*39.430.2*51
24、.029.3*CA343.113.4*7.54.943.130.5*37.939.147.930.4*CA428.319.2*9.77.226.418.*17.7 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 IZE: 7.5pt“14.520.07.40Total158.635.3*37.925.3141.686.5*120.3108.1157.691.2*结论与讨论神经生长因子(nerve growth factor，NGF)是最典型、研究最深入的神经营养因子之一， 高水平存在于大脑皮层、海马、
25、嗅球等脑区，主要作用于胆碱能神经元。Trk A 受体是神经元细胞膜上 NGF 的高亲和力受体，NGF 与其结合后内在化，经逆行转运至胞体、胞核，引发一系列生理反应，促进神经元增殖和分化，调节中枢和外周存活和轴突生长，并对效应神经元的化学、机械损伤修复起重要作用。NGF 和 Trk A 缺失的小鼠表现大量背根节神经元与交感神经元的丧失以及胆碱能神经元功能缺失。有学者认为 AD 过程中神经元的丢失至少部分是由于一种或多种神经营养因子的缺乏(如NGF，BDNF ，NT3) ，这些神经营养因子的受体 trkA，trkB ，trkC在 AD 病人脑中分别下降的 69，47和 49 6 7 8 9 10
26、11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 LY: 宋体“。啮齿动物中，老龄 Fischer334 大鼠海马及前脑 NGF mRNA 水平下降4050。国内研究主要使用 RNA 减少。因此笔者认为， NGF 逆向转运障碍及 NGF 水平下降是老龄大鼠脑内起始改变，由此引起神经元的萎缩及受体 TrkA 减少，进一步降低了 NGF 的生理效应，最终导致胆碱能神经元的缺失和学习记忆障碍。这一病理过程可能与AD 过程相类似。海马区根据细胞结构的不同分为 CA1、CA2、CA3、CA4 四个区域，它们都与学习记忆密切相关，但在功
27、能上略有不同。CA2、 CA3 区是学习记忆的中心区，而 CAl、CA4 区是学习记忆的周边区。我们的研究发现：老年大鼠海马 CAl、CA2、CA3、CA4区 NGF 表达均较青年对照明显减少，但老年大鼠海马 CA2、帜 3区 NGF 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 tyle=“FONT-FAMILY: 宋体“的表达减少更严重，与学习记忆的功能分区相一致是造成老年大鼠学习记忆障碍的主要原因。侧脑室内注射 NGF 可减少切断隔海马径路或穹窿伞引起的胆碱能神经元退变，老龄大鼠注射 NGF
28、可提高胆碱乙酰化转移酶的水平，改善认知及记忆功能，因此 NGF 治疗 AD 有理论根据。文献报道脑室内灌注 NGF(13 个月) 治疗 AD 病人 3 例，出现语言插曲记忆改善，额、颞皮层烟碱结合增加，脑血流增加，说明 NGF 的治疗意义。然而，外源性 NGF 价格昂贵，分子量大不易通过血脑屏障，具有严重的副作用(包括体重减轻、疼痛和精神错乱) ，并不是理想的治疗方法。因此增加内源性 NGF 的合成和释放，成为研究 AD 治疗的重要内容。962 胶囊是我室自行研制开发的中药新药，目前，已完成临床前药效及毒理研究。我们以往的实验证明：962 胶囊能显著改善老年大鼠学习记忆功能。本实验发现，在与学习记忆密切相关的海马CAlCA4 区锥体细胞层， 962 胶囊能明显促进自然衰老大鼠神经生长因子(NGF)及其受体(Trk A)表达，说明其可能含有或导致体内产生能通过血脑屏障的某些小分子物质，促进内源性 NGF 及其受体合成和释放。962 胶囊对学习记忆的中心区一海马 CA2、CA3 区 NGF和 Trk A 表达的增加作用最强，这一药理基础是其改善老年大鼠学习记忆功能的重要机制，对于保护和修复神经元，防治 AD 等神经退行性疾病具有重要意义。6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
