1、应用气相色谱质谱法筛查遗传代谢病高危患儿 179 例摘要 目的 通过气相色谱质谱联用仪对遗传代谢病高危患儿的尿液进行生化分析，以期为临床诊断和治疗提供依据 方法 收集 2011 年 8 月 3 日2012 年 1月 7 日期间 179 例遗传代谢病高危患儿尿液样本，经过尿素酶去除尿素、萃取有机酸、硅烷化反应后，应用气相色谱质谱联用仪进行化学分析，分析软件进行疾病诊断 结果 179 例高危患者中共发现 16 例（9.04%）有机酸尿症患者，其中甲基丙二酸尿症患者 8 例（50%）、苯丙酮尿症患者 2 例（12.5%），酪氨酸尿症患者 2例（12.5% ），酮症性二羧基酸尿症患者 2 例（12.5
2、%），甘油尿症和高乳酸尿症患者各 1 例（6.25%）。大部分放弃治疗，一例甲基丙二酸尿症患者和低酮症性轻度二羧基酸尿症患者经临床干预获得良好后果。结论 应用气相色谱质谱联用仪是筛查某些遗传代谢病的有效方法。关键词：遗传代谢病；气相色谱质谱联用仪；甲基丙二酸尿症；有机酸尿症Abstract Objective: To study the application of gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) in the screening organic acidurias to inherited metabolic diseases. Me
3、thod: Urine samples from 179 patients suspected to have inherited metabolic diseases were collected from August 3, 2011 to January 7, 2012. After urea was removed by urease, organic acids were extracted and Silanization reaction was treated, urine organic acid was analyzed with GC/MS solution and In
4、born errors of metabolism screening system. Result: 16 patients (9.04%) had organic aciduria. 8 (50%) were methylmalonic aciduria, 2 (12.5%) were phenylketonuria, 2 (12.5%) were tyrosinuria, 2 (12.5%) ketosis dicarboxylic aciduria, 1 (6.25%) was glyceroluria and 1 (6.25%) was lactic aciduria. Most o
5、f them had abandoned the treatment. Only two cases were treated by drug and diet. Conclusion: Application of gas chromatography-mass spectrometry in screening of certain genetic and metabolic diseases was effective.Key word: inherited metabolic diseases; gas chromatography-mass spectrometry; methylm
6、alonic aciduria; organic aciduria.遗传代谢病(inherited metabolic diseases, IMD)又称先天代谢缺陷（inborn errors of metabolism），是有代 谢功能缺陷的一类遗传 病，多为单基因遗传病，包括氨基酸、有机酸、脂肪酸等先天性的代谢缺陷。目前已命名了 600 余种遗传代谢病，总发 病率约占人口的 1%。该类疾病可在婴幼儿 时即发病，可表 现为急性脑病，造成痴呆、脑瘫、甚至昏迷、死亡等严重并发症，给家庭和社会带来严重负担1, 2。大多遗传代谢性疾病临 床表现缺乏特异性，其病因诊断需要借助实验室检查。为了明确山 东
7、省遗传代 谢病的发病概况及早期诊断干预该类疾病患儿，降低伤残率，本院于今年引进了气相色 谱质谱联用仪，并与八月份开展了对遗传代谢病高位患儿的尿有机酸代谢筛查。2011 年 8 月 3 日2012 年 1 月 7 日，本实验室共筛查高危患儿尿液样本 179 例，检出有机酸尿症患儿 16 例。现总结报告如下：材料和方法主要试剂与仪器 GC-MS QP2010 ultra 购自日本岛津；DB-5（30m0.25mm1.00um）购自 JW Scientific 公司；载气为高纯氮；BSTFA+TMCS(99:1)；尿素酶、 盐酸羟胺、 氢氧化钠、盐酸、正构烷烃、混标（17 烷酸、24 烷酸、托品酸）
8、等前处理 试剂均购自北京摩尔 美康公司。病例来源 收集了 179 例遗传代谢病高危患儿，患儿为我院住院或门诊病例，大部分来自新生儿 ICU、pediatric ICU、神 经内科、康复中心、消化科、感染科、儿童保健所等；年龄在 24 小时至 9 岁。参照文献3， 4，遗传代谢病高危病例选择指征为：(1)间歇性发作的疾病急剧恶化；(2) 类似中毒但是无毒性物 质接触史；(3)表现类似严重感染，但是多种感染指 标阴性；(4)对可疑获得性疾病治疗无反应；(5)同胞或近亲 曾有类似情况；(6) 新生儿病情急剧进展，无法解释；(7)任何类型的脑病，尤其是反复发作性的急性脑病；(8)智力运动发育落后或倒退
9、；(9)低血糖；(10)瑞氏综合征； (11)各种 “累积病”样本收集 采集患儿用 药前 5ml 随机尿液，储存于试管中，并尽快放于-20度冰箱，在一星期内进行检测 。尿液在采集 过程中一定避免 污染， 检测完的尿液放于-80 长久保存。尿液前处理 尿液前处理采用北京摩尔美康公司方法，加入尿素酶除去尿素，加入混标作为内标，用盐酸 羟胺、 氢氧化钠和盐酸进 行反应后，使用乙酸乙 酯萃取其中的有机物质，60氮气吹干，加入 BSTFA+TMCS，80，30min，进行硅烷化反应，即可上样检测5。GC/MS 进样条件设置 GC 设置条件为：色谱柱：DB-5（30m0.25mm1.00um）；进样口温度
10、为 280；柱流量为 1.34ml/min；升温程序为 100(4min)-4/min-280(10min)。MS 设置条件 为：离子源温度为 200；接口温度为 280；扫描范围 ：m/z50-m/z500。电压设为高于调谐结果 0.1kv。结果分析 采用日本岛津研制的 inborn errors of metabolism screening system软件，对 上样结果进行数据分析与 处理。结果筛查 179 例遗传代谢病高危患儿，共发现 6 种 16 例遗传代谢病患儿，9 男 7女，占全部检测病例的 9.04%（见表 1）。表 1:177 例遗传代谢病高危患儿及阳性患儿人口统计学资料c
11、haracteristic overall(n=179) IEM positive(n=16)mean age(m)(SD) 11.97 (20.96) 15.55(21.1)median age(m)(IQR) 3(0.44-12) 1.5(0.77-10.5)age categaries, 3d 20(11.17) 03d-28d 42(23.46) 6(37.5)28d-1y 73(40.78) 6(37.5)1y-3y 27(15.08) 1(6.25)n(%)3y 17(9.5) 3(18.75)sex, M:F, n(%) 110:69(61:31) 9:7(56:44)m: mo
12、nth; M: male; F: female; d: days; y: year.16 例遗传代谢病患儿中，甲基丙二酸尿症(methylmalonic aciduria, MMA)共8 例（50% ），一例甲基丙二酸患儿合并同型半胱氨酸血症，苯丙酮尿症（phenylketonuria, PKU）2 例（ 12.5%），酪氨酸尿症(tyrosinuria)2 例（12.5%），酮症性二羧基酸尿症 2 例（12.5%），甘油尿症和高乳酸尿症各 1 例（6.25%）。其特征性有机酸代谢产物如表 26。除了 2 例苯丙酮尿症患儿表型较特异，头发淡黄色，尿液有特殊气味，三氯化铁实验为 阳性外，其余 1
13、4 例患者没有特异性表现，其 临床表现及实验室检查资料如表 3。本组患者中 3、9、10、15 均为门诊病例，诊断和治疗依从性差，第一次就诊 后，没有复诊，临床资料收集不完全。 （见表 3）表 2:16 例有机酸尿症患者资料及尿液中检出的有机酸代谢产物病例诊断 性别 年龄 尿液中特异代谢产物1 MMA 女 3 月 19 天 甲基丙二酸，3-羟基丙酸 、丙酰甘氨酸、甲基巴豆酰甘氨酸、4-羟基苯乳酸、4-羟基苯丙酮酸、乳酸、3-羟基丁酸、乙酰乙酸2 MMA 男 8 月 11 天 甲基丙二酸、3-羟基丙酸 、丙酰甘氨酸、2- 酮异己酸 、乳酸、3-羟基丁酸、乙酰乙酸 、3 MMA 女 24 天 甲基
14、丙二酸水平显著升高、3-羟基丙酸、丙二酸、4- 羟基苯丙酮酸4 MMA 男 2 月 9 天 甲基丙二酸、3-羟基苯乙酸5 MMA 女 2 月 28 天 甲基丙二酸水平、3-羟基苯乙酸 6 MMA 男 5 天 甲基丙二酸、3-羟基丙酸 、3- 羟基异戊酸、3-羟基苯乙酸、4-羟基苯乳酸7 MMA 男 5 岁 1 月 甲基丙二酸、3-羟基丙酸、丙二酸 8 MMA 合并同型半胱氨酸血症男 25 天 甲基丙二酸、3-羟基丙酸、丙二酸 、4- 羟基苯乳酸、4-羟基苯丙酮酸9 PKU 女 4 岁 苯乙酸、苯乳酸、苯丙酮酸10 PKU 男 3 岁 苯乙酸、苯乳酸、苯丙酮酸、3-羟基丙酸11 甘油尿症 女 2
15、9 天 甘油水平、4-羟基安息香酸12 高乳酸尿症 女 13 天 乳酸、丙酮酸、苯乙酸、尿黑酸、苯乳酸、4-羟基苯乳酸、4-羟基苯丙酮酸13 酪氨酸尿症 男 20 天 苯乙酸、3-羟基苯乙酸、4-羟基苯乳酸、4-羟基安息香酸、高香草酸14 酪氨酸尿症 女 18 天 4-羟基苯乳酸、4-羟基苯丙酮酸、4-羟基苯乙酸、2- 羟基丁酸、4-羟基安息香酸15 酮症性二羧基酸尿症男 1 岁 6 月 3-羟基丁酸、乙酰乙酸、丙酮酸 、己二酸、庚二酸、辛烯二酸、辛二酸、癸二酸、3-羟基异丁酸、乙基羟基丙酸、2-酮异戊酸、2-酮-3- 甲基戊酸、3-羟基丙酸、3-甲基戊稀二酸、3-羟基苯乙酸、4-羟基苯乳酸、
16、4-羟基苯丙酮酸16 低酮症性轻度二羧基酸尿症男 1 月 3-羟基丁酸、3-羟基丁酸、已二酸、庚二酸、辛烯二酸 、辛二酸、香草酸、高香草酸、4-羟基苯乳酸、4- 羟基苯丙酮酸、已二酸、庚二酸、辛烯二酸、辛二酸香草酸、高香草酸、4-羟基苯乳酸、4-羟基苯丙酮酸：与正常均值比较，升高倍率1000 倍；：与正常均值比较，升高倍率 100-999 倍；：与正常均值比较，升高倍率 50-100 倍。表 3:16 例有机酸尿症患者主要临床特征初就诊时主要临床表现病例 诊断神经指征 感染指征 黄疸类型 智力状况 其他 临床及实验室检查资料1 MMA 呕吐 肺炎 重度感染、重度酸中毒、低血糖、重度贫血2 MM
17、A 呕吐 支气管炎 小细胞低色素性贫血、重度酸中毒3 MMA 嗜睡4 MMA 肺炎，咳嗽 营养不良，头小畸形5 MMA 嗜睡，癫痫脑发育不良，粒细胞减少症，支气管炎，中度贫血6 MMA 嗜睡 重度黄疸 重度感染，严重酸中毒7 MMA 惊厥 智力低下8 MMA 合并同型半胱氨酸血症嗜睡 重度黄疸 多器官脏器衰竭，结膜炎，败血症，肺炎，皮炎9 PKU 智力低下 头发淡黄色，尿液有异味三氯化铁实验阳性10 PKU 智力低下 头发淡黄色 三氯化铁实验阳性11 甘油尿症 肺炎反复呛咳 中度营养不良，贫血12 高乳酸尿症 肺炎 重度黄疸 败血症，肝大，血糖升高，酸中毒13 酪氨酸尿症 惊厥 肺炎 早产儿1
18、4 酪氨酸尿症 惊厥 重度黄疸 代谢性酸中毒，低血糖，低钾血症，低钙血症15 酮症性二羧基酸尿症酸中毒表现16 低酮症性轻度二羧基酸尿症肺炎 单纯性小细胞贫血，心肌损害，肝炎综合症讨论人体内的有机酸来源于碳水化合物，脂肪酸、氨基酸代谢以及饮食、 药物等都可对其成分产生影响，有机酸代 谢途径中某种酶的缺陷，可导致其中间代谢产物和旁路代谢产物的增加，使机体内必需物质减少，有害物质（如中间代谢产物和旁路代谢产物的有机酸等）蓄积造成神经系统及其他脏器损害，造成痴呆、 脑瘫，甚至昏迷、死亡等严重并发 症。尿液、血浆、脑脊液等都可进行有机酸分析，以尿液最为常用。我院引进的日本岛津 GC/MS 2010 u
19、ltra 仪器，弥 补了山东省尿筛检测的空白。我们检测 的 179 例患儿均 为遗传代谢病高危患儿。本组资料显示，甲基丙二酸尿症在有机酸代谢障碍中最常见，也是通过尿液筛查做出诊断的重要疾病之一。患儿资料显示，该病发病年 龄跨度较大，从 5 天到 5 岁之间皆可发病。八例患儿初就诊时没有特异性的临床表现，大多表现为原因不明的呕吐（两例）、嗜睡（四例）、惊厥（两例）、严重感染、智力低下等非特异性临床症状。引起甲基丙二酸尿症的病因较为复杂，临 床上常见的是由遗传因素引起的，遗传性甲基丙二酸尿症根据致病基因不同主要分为甲基丙二酞辅酶 A 变位酶(methylmalonyl-coAmutase，MCM)
20、缺陷型和钻 胺素(维生素 B12)缺陷型 7。除此之外，在长期素食、慢性消化道疾病等患者或孕妇生育的患儿中，也可引起甲基丙二酸尿症。 临床上维生素 Bl2 反应型往往为钻胺素缺陷型，而不反应型一般为变位酶缺陷型；甲基丙二酸尿症合并同型半胱氨酸血症往往是由甲基钴胺素缺陷引起的。所以尿有机酸检测为甲基丙二酸尿症患儿都要对其血中半胱氨酸进行检测，八例甲基丙二酸患者只有一例进行血中半胱氨酸检测，确定为甲基丙二酸合并同型半胱氨酸血症，经大剂量维生素 B12 治疗，该患者病情好 转出院。其余 7 例均放弃治疗。苯丙酮尿症、酪氨酸尿症、酮症性二羧基酸尿症和乳酸尿症均为继发性有机酸尿症，需经血氨基酸、基因分析
21、或特殊实验室检查 方能对其确诊8,9。总之，尿有机酸筛查为临床诊断和治疗提供了参考数据。尿有机酸检测在我院的开展不仅解决了有机酸尿症患者的筛查与诊断,同时提高了医生对有机酸尿症的认识与诊疗水平。但是尿筛对遗传代谢病的检测毕竟有限，需要联合串联质谱仪 、基因 诊断等检测手段才能 对遗传缺陷病做出诊断，为临床合理治疗、产前诊断提供可靠的 临床数据。参考文献：1. Leoni V, Strittmatter L, Zorzi G, et. al. Metabolic consequences of mitochondrial coenzyme A deficiency in patients wit
22、h PANK2 mutations. Mol Genet Metab. 2011 Dec 14. Epub ahead of print2. Saudubray JM, Nassogne MC, de Lonlay P, Touati G. Clinical approach to inherited metabolic disorders in neonates: an overview Semin Neonatol, 2002, 7(1): 3-15.3. 宋元宗，张霆，张春花，王自能. 尿素酶预处理-气相色谱-质谱法选择性筛查遗传代谢病高危患儿 327 例初步研究. 实用儿科临床杂志.
23、2005 Feb. Vol.20, No.2: 142-144. 4. Burton BK. Inborn errors of metabolism in infancy: a guide to diagnosis J. Pediatrics, 1998, 102(6): E69.5. 宋金青,杨艳玲,孙芳等.气相色谱-质谱联用分析在有机酸尿症筛查与诊断中的应用. (总 102)5 中国医刊 6 2006 年第 41 卷第二期：38-40.6. Carlo Dionisi-Vici, Federica Deodato, Wulf Rschinger, et. al. Classical org
24、anic acidurias, propionic aciduria, methylmalonic aciduria and isovaleric aciduria: Long-term outcome and effects of expanded newborn screening using tandem mass spectrometry. Inherited Metabolic Disease, 2006, Vol. 29, NO. 2-3: 383-389.7. Ruimei Hu, Nicole E. Buck1, et al. Gene induction for the tr
25、eatment of methylmalonic aciduria. Gene Medicine. 2009 April, Vol.11, Issue 4: 361369.8. W. Lehnert and H. Niederhoff. Seven years of experience with selective screening for organic acidurias. Pediatrics. 1984, Vol: 142, NO, 3: 208-210.9. Frazier DM, Millington DS, McCandless SE, et. al. The tandem mass spectrometry newborn screening experience in North Carolina: 1997-2005. J Inherit Metab Dis, 2006, 29(1): 76-85.
