1、No.1.20071我国果蔬生产加工的现状我国果蔬年产量在世界居于首位,据2000年的统计数据,我国苹果、梨、桃、李的产量居世界第一,占世界总产量的比例分别高达36.69%、50.28%、27.05%、42.32%1。但我国的果蔬在品种、品质、产后、加工技术与设备方面与国外相差甚远,尤其是农药残留问题,更使得我国果蔬在出口贸易中频频遭受技术壁垒的限制。为了提高我国农业的生产加工水平,为了提高农民生活质量,为了加快我国经济的生产与增值,发展新的分析检测技术是当务之急。2农药残留分析技术的发展控制农药残留尤其是果蔬中的农药残留十分必要。农残分析是在复杂的基体中对目标化合物进行定性或定量的分析,而果
2、蔬样品中农药残留量一般在ppmppb范围内,因此要求分析方法灵敏度高、特异性强。此外,随着农药品种日益增多,食物样品中常含有多种农药残留组分,因此农药残留分析方法逐渐由单一种类农药多残留分析向多品种农药多残留分析发展,而且对农药的代谢物、降解物以及共轭合物的残留分析给予了更多的关注。收稿日期：2006-06-08*通讯作者基金项目：农产品安全全程质量监控技术研究与开发项目(锡科计2005104号);无锡市2005年重大科技计划项目(DL050001)。作者简介：孙震(1966-),女,副教授,博士研究生,研究方向为食品微生物及免疫学、食品安全及快速检测。果蔬中农药残留分析检测技术的发展孙震，顾
3、亚萍，钱和*(江南大学食品学院,无锡214036)摘要：研究了果蔬中农药残留分析检测技术的发展以及应用现状,探讨了我国果蔬生产加工中存在的问题。关键词：果蔬;农药残留;分析检测中图分类号：TS255文献标识码：B文章编号：1005-9989(2007)01-0015-05Development of pesticide residue analyzing technology infruirts and vegetablesSUN Zhen,GU Ya-ping,QIAN He*(College of Food Science and Engineering,Southern Yangtze
4、University,Wuxi 214036)Abstract:Thsi artcile studied the deveolpment and the actuailty of the pesticdie resdiue anaylznig and inspect-nig technoolgy ni frutis and vegetabels.Also ti discussed the mani probelm in the production and processing ofthe fruits and vegetabels in Chnia.Key words:frutis and
5、vegetables;pesticdie resdiue;anaylzing and nispectoin专题论述15No.1.2007农药残留分析包括两部分,样品的前处理和分析检测技术。而样品的前处理即农药残留的分离、提取和净化是农残分析中工作量最大、对残留分析结果起关键作用的步骤。由于基体和杂质的复杂性以及不同农药理化性质等的差异,因而农药的预处理方法亦各有其特殊性。经典的样品预处理技术费时、费力、最容易引起误差且操作繁琐,同时需使用大量有机溶剂。20世纪90年代发展起来的SFG克服了经典萃取方法的许多缺点,是一种前景看好的分离纯化技术。农药残留分析是一项对复杂混合物中痕量组分的分析技术,
6、它要求精细的微量操作手段和高度灵敏的检测技术。现在农药残留分析要求多残留分析、回收率高(70%)、重现性好、低检出限、操作简单易行。3样品前处理处理技术新兴的样品前处理技术,尽可能地缩短了提取时间,简化提取步骤,减少溶剂消耗,可用于对农残的快速检测中,这其中包括固相萃取法、微波辅助提取、超临界流体提取、快速溶剂提取及底物固相分散等。其中,前三者应用最为广泛。3.1固相萃取3.1.1固相萃取法(Solid Phase Extraction,SPE)SPE是利用选择性吸附与选择性洗脱的液相色谱法分离原理,从而达到快速分离、净化与浓缩的目的。因而它的原理与一般色谱的相似。根据柱中填料的不同,其原理可
7、分为吸附型(如硅胶、大孔吸附树脂等)、分配型(如C18、苯基等)和离子交换型。就目前在农药残留分析中应用最为广泛的分配型而言,是利用待测物在液相和固相中分配系数的不同而达到萃取分离的目的。此时,它要求固相与待测物的亲和力要大于样品底物与待测物之间的亲和力,这样才能使被分析物保留在固相上。随后选择一种与待测物有更强亲和力的溶剂作淋洗剂,将待测物从固相上洗脱下来。这个保留与洗脱的机理,来自于待测物和干扰杂质与固相表面活性位置、液相及底物间不同的分子间作用力。固相萃取实际上是色谱技术应用的另一种形式。3.1.2固相微萃取(SPME)固相微萃取(SPME)是20世纪80年代末由加拿大Waterloo大
8、学Pawliszyn和Arhturhe教授提出的一种简便、快捷、无溶剂的样品制备与前处理技术。SPME的原理是利用待测物在基体和萃取相之间的非均相平衡,使待测组分扩散吸附到石英纤维表面的固定相涂层,待吸附平衡后,在进样口通过热解析或溶剂解析而导入色谱柱完成分离分析。SPME与GC联用适用于分析极性较小和易挥发的有机物。该技术集萃取、富集、进样、分离分析于一体,目前已被广泛应用。SPME与HPLC联用,解决了GC对于强极性、难挥发性物质不能分析的问题,它是通过溶剂的解析作用使待测物进入HPLC柱。此技术需要专门的溶剂洗脱接口装置,目前还处于发展阶段。SPME除拥有SPE的所有优点外,同时消除了S
9、PE中诸如堵塞和使用有机溶剂的缺点。SPME的萃取模式可分为3种:直接法,即将石英纤维暴露在样品中,主要用于半挥发性的气体、液体样品萃取;顶空法,将石英纤维放置在样品顶空中,主要用于挥发性固体或废水水样萃取;衍生化法,对于本身没有合适的纤维材料萃取或难挥发性、极性较大的待测物,可采取两种方式进行衍生。两种方式分别为:一种是将衍生剂与待测物衍生后,再萃取衍生物;另一种是先将衍生剂吸附到纤维层上,再用此纤维头去萃取待测物。3.1.3 SPE和SPME技术的优点及展望SPE与SPME对样品的预处理与常规液-液分配、柱层析法相比,具有以下优点:(1)需用样品量和有机溶剂量大大减少,降低了对人体和环境的
10、污染;(2)对待测物集萃取、富集、净化于一体,避免了乳化现象,简化了样品处理步骤,提高了分析物的灵敏度;(3)操作简单,易于实现与定量测定技术的联用;(4)高效、快速,费用低廉。目前SPE与SPME技术在以下几方面有待进一步提高:(1)改进固相填料及涂层高聚物的合成技术,提高柱效和重现性;(2)研究新型特效性的固相填料和不同极性的SPME涂层高聚物材料,以满足更多物质的需要;(3)加快和其它检测手段联用技术成熟性,扩大分析检测的范围。随着这些技术的不断完善,SPE与SPME技术在分析化学领域必将展现广阔的应用前景。吴玉杰采用微量化学样品前处理技术、固相萃取技术等样品前处理技术和食品中农药残留量
11、气相色谱检测方法,检测荞头中甲胺磷农药的残留量,测得结果回收率为87.4%109%,精密度为0.52.5mg/kg,检测低限为0.02mg/kg2。3.2微波提取微波提取是利用微波能来提高提取效率的一种新技术。微波是频率大约300MHz300GHz,即波长在100cm至1mm范围内的电磁波。从微观上讲,虽然还不能象讨论原子、分子那样用量子力学来严格地描述介电加热的过程,但可用经典理论,从分子等微观粒子的运动来讨论介电专题论述16No.1.2007加热。当对某一样品施加微波时,在电磁场的作用下,样品内微观粒子可产生四种类型的介电极化,即电子极化(原子核周围电子的重新排布)、原子极化(分子内原子的
12、重新排布)、取向极化(分子永久偶极的重新取向)和空间电荷极化(自由电荷的重新排布)。在这四种极化中,与微波电磁场的变化速率相比,前两种极化要快得多,所以不会产生介电加热;而后两种极化则与之相当,故产生介电加热,即可通过微观粒子的这种极化过程,将微波能转化为样品的热能。一般说来,物质对微波能的吸收取决于极性。极性分子在微波能的作用下被加热,分子的极性越大,其对微波的吸收能力就越强。非极性分子由于不能与微波发生介电取向极化而对微波不起反应,称为微波透明物质。不同物质介电常数不同,其吸收微波能的程度不同,因此产生的热能及传递给周围环境的热能也不相同。在微波场中,吸收微波能力的差异使得基体物质的某些区
13、域或萃取体系中的某些组分被选择性加热,从而使得被提取物质从基体或体系中分离,进入到介电常数较小、微波吸收能力较差的提取剂中。而在传统提取过程中,能量首先无规则地传递给提取剂,然后提取剂扩散进基体物质,再从基体溶解或夹带多种成分扩散出来,即遵循加热-透基体-或夹带-透出来的模式。也就是说,在传统提取过程中,能量累积和渗透过程以无规则的方式发生,提取的选择性很差。有限的选择性只能通过改变溶剂的性质或延长溶剂的萃取时间来获得,前者由于同时受溶解能力和扩散系数的限制,选择面很窄,后者则大大降低了提取效率和速度。而微波提取由于能对提取体系中的不同组分进行选择性加热,因而成为至今唯一能使目标组分直接从基体
14、分离的提取过程,具有较好的选择性;另一方面,微波提取由于受溶剂亲和力的限制较小,可供选择的溶剂较多。此外,热传导、热辐射造成的热量损失使得一般加热过程的热效率较低,而微波加热利用分子极化或离子导电效应直接对物质进行加热,因此热效率较高,升温快速、均匀,大大缩短了提取时间、提高了提取效率。3.3超临界流体萃取法(Supercritical Fluid Extraction,SFE)超临界流体本质上是处于临界温度以上的高密度气体,既具有气体密度小、扩散速度快、渗透力强的特点,又具有液体对样品溶解性能好、可在较低温度下操作的特点。目前作为超临界流体的溶剂应用最多的是二氧化碳,常用于非极性或弱极性农药
15、的提取。与经典的萃取技术(如索氏提取法)比较,SFE有以下的优点:(1)快速方便、具有选择性;(2)黏度小、扩散能力强、溶解范围广,二氧化碳易于制备、无毒、不易燃;(3)流体密度、溶解度和黏度都能通过压力来控制,加入改性剂还可以增强萃取效率增强除杂能力;(4)超临界流体在常压下可自然挥发,省去浓缩步骤;(5)SFE可以与GC、HPLC、超临界流体色谱等联机;(6)样品用量小、分析速度快、回收率高(甚至可达99%)。4农药分析检测方法控制农药残留尤其是食品中的农药残留十分必要。食品中农残分析是在复杂的基体中对目标化合物进行定性或定量的分析,而食物样品中农药残留量一般在ppmppb范围内,因此要求
16、分析方法灵敏度高、特异性强。此外,随着农药品种日益增多,食物样品中常含有多种农药残留组分,因此农药残留分析方法逐渐由单一种类农药多残留分析向多品种农药多残留分析发展,而且对农药的代谢物、降解物以及扼合物的残留分析给予了更多的关注。近年来,农药残留分析在传统方法的基础上得到了迅速的发展。4.1超临界流体色谱(Supercritical fluid chrometegra-phy，简称SFC)SFC是以超临界流体作为流动相的色谱技术。超临界流体具有气体和液体双重性质,其黏度小,传质阻力小,扩散速度快,溶解能力强,既克服了GC和HPLC的缺陷,又兼备两者的优点。因其较低的使用温度,故能直接分离GC难
17、以分析的热不稳定、高分子量、强极性和非挥发性化合物,提供比HPLC更高的分离效能和快速的分析速度。在SFC的应用中采取程序升密度相当于GC中的程序升温和HPLC中的梯度淋洗。尤为突出的特点是:SFC可与大多数通用型、选择型的GC和HPLC的检测器相匹配,如FID、NPD、ECD、UV等,易与质谱(MS)和傅立叶变换红外光谱(FTIR)等大型仪器联用,使其在定性定量分析中极为方便。许多在GC或HPLC上需经过衍生化处理才能分析的农药均可用SFC直接测定。如用SFC可把氨基甲酸酯类农药与脂类物质分离,这对于在含有脂肪的食品中的农药残留分析是具有重大的意义的。氯菊酯、溴氰菊酯、呋喃丹、抗蚜威氨基甲酸
18、酯类等农药可用HPLC分析。基于SFC较高的分离效能,可用来分离和分析手性化合物,手性SFC适于分析非离子型的具有低中挥专题论述17No.1.2007发性的手性化合物,包括手性药物的拆分和农药分析。将SFE与GC、SFC、HPLC、SFC-GC、毛细管柱液相色谱、凝胶渗透色谱(Gel permeation chromatog-raphy,GPC)或酶联免疫技术(Enzyme-Linked Immuno-sorbent Assays,ELISAs)联机,易于实现准确、快捷、灵敏、简便的全自动分析过程。SFE与其它分析仪器的联用可以通过离线(off-line)和在线(on-line)两种方式进行。
19、离线SFE是指对分析物收集后,再选用合适的方法和仪器进行分析。在线SFE联用是指分析物直接转入色谱系统或其它分析仪器中予以分析。离线SFE从本质上说较易实现,因为只需考虑萃取。而在线SFE联用则需要综合考虑,其最大优点在于分离提纯及分析检测的自动化,能定量地将萃取物转入分析系统,灵敏度高,且样品所包含的理化信息高度保真,适于痕量组分的分析。离线SFE在萃取不同的样品以及后续的检测方式上具有较大的灵活性,同时由于在线SFE一次性投资大,且某些精密接口技术尚不完善,因而SFE在线分析的广泛应用尚需时日,因此目前农残分析中常用的是离线SFE。4.2薄层色谱法(TLC)薄层色谱法实质上是以固体吸附剂(
20、如硅胶、氧化铝等)为担体,水为固定相溶剂,流动相一般为有机溶剂所组合的分配型层析分离分析方法。薄层色谱法不需要特殊设备和试剂,简便易行、快速、直观、灵活,可同时用于分析多个样品。但是,由于灵敏度不高,近年来较少使用,多用于复杂混合物的分离和筛选。TLC除用特殊的显色剂观察斑点颜色和用Rf值定性外,与其它技术的联用不仅可以定性,而且可对样品中被分离的一种或多种成分进行定量分析。20世纪80年代发展起来的高效薄层色谱(HPTLC)与扫描技术结合,是一种易于建立和掌握的半定量技术。欧盟国家采用自动化多通道展开技术,用HPTLC定量筛选了饮水中256种农药残留。4.3气相色谱法(GC)气相色谱法(GC
21、)是目前应用最多的方法,多达70%的农药残留量检测是使用气相色谱来进行的。气相色谱法具有操作简便、选择性高、分离效能高、灵敏度高、分析快速以及应用范围广等特点。易汽化,汽化后又不发生分解等现象的农药均可采用气相色谱法检测。使用气相色谱法,多种农药可以一次进样,得到完全的分离、定性、定量,再配以高性能、高选择性的检测器,使分析速度更快,结果更可靠。气相色谱应从两个方面考虑,即色谱柱和检测器。气相色谱法使用的色谱柱主要是填充柱和毛细管柱。在农药残留分析方面,已由过去以填充柱为主,变到目前以毛细管柱为主。由于弹性石英毛细管柱的出现,使操作更方便易行。进样系统的不断改进,不但提高了毛细管气相色谱分析的
22、精密度和准确度,而且大大增加了进样量,进一步提高了灵敏度。微机控制处理大量的分析数据,使得毛细管柱的优点得到更充分的发挥。对多种类型或同一类型农药多残留分析来说,毛细管色谱是最得力的工具。用二维或多维毛细管柱分离的农药可达二三百种之多。用气相色谱测定关键是如何选择检测器,理想的检测器应具备灵敏度高、稳定性和重复性好、线性范围宽、响应速度快以及结构简单、造价低、操作安全、应用范围广等特点。用于气相色谱法的检测器主要有电子捕获检测器(ECD)、火焰光度检测器(FPD)、氮磷检测器(NPD)等。ECD是具有高选择性和高灵敏度的离子化检测器,其选择性只对具有电负性的物质有响应,如含卤素、硝基、氧原子等
23、化合物都有很强的响应。它被广泛应用于有机氯农药和其他含电负性原子的农药残留量检测。如对黄瓜、韭菜上的百菌清的测定采用ECD检测器,最小检出量为1.210-12g,添加回收率为80.8%86.3%;番茄、甘蓝上氰戊菊醋的最小检出量为1.1710-11g,回收率为82.1%90.1%3。陈静研究用两种检测器(氮磷检测器和火焰光度检测器仪器)和两种不同极性色谱柱(中极性毛细管色谱柱DB-1701、非极性毛细管色谱柱DB-1)作为研究手段,比较了20种有机磷杀虫剂在两种色谱柱(DB-1、DB-1701)、两种检测器(FPD、NPD)上的保留时间及最小检测量,建立了用不同极性色谱柱上有机磷农药的保留时间
24、可作为有机磷农药双柱定性确证的的方法;建立了DB-1701,GC-FPD测定蔬菜中20种有机磷杀虫剂的气相色谱法,该方法的最小检测量为510-11210-12g,线性范围在210-9110-11g4。FPD是利用火焰中化学作用发展起来的一种高灵敏度、高选择性检测器,它只对含硫、磷的化合物有讯号,目前广泛应用于含硫、磷农药残留量的检测。如涕灭威在苹果中的残留检测用此检测器的最低检测浓度为0.004mg/kg。4.4气相色谱质谱法(GC-MS)气相色谱质谱法(GC-MS)将气相色谱仪和质谱仪串联起来,成为一个整机使用的检测技术。它既具有气相色谱高分离效能,又具有质谱准确鉴定化合物结构的特点,可达到
25、同时定性、定量的检测目的。用于农药残留量检测工作,特别是应用于农专题论述18No.1.2007药代谢物、降解物的检测和多残留检测等具有突出的特点。但是由于质谱仪价钱比较昂贵,目前在国内尚未广泛应用于农药残留量检测工作。4.5高效液相色谱(HPLC)HPLC是以液体作流动相的一种色谱法。高效液相色谱的应用越来越广泛,现已成为农药残留检测不可缺少的重要方法。其原因主要是HPLC能适合分离检测不易气化或受热易分解、分子量大、离子型农药、强极性农药及其代谢物,这些农药用GC测定时,必须先进行衍生化处理。其次是HPLC可以与柱前提取、纯化及柱后荧光衍生化反应和MS、计算机等系统联用,容易实现分析过程的自
26、动化。同时,采用高效色谱柱、高压泵和高灵度大大提高了液相色谱的检测效率、灵敏度和速度。目前,应用于农药残留分析时使用最多的检测器是紫外吸收检测器(UV),其次是荧光检测器。紫外吸收检测器的优点是灵敏度高,流量和温度的变化影响小,是梯度淋洗的一种比较理想的检测器,但是只能检测对紫外光有吸收性能的农药。但由于大多数农药本身不发射荧光,经衍生化反应又较麻烦,限制了FD的应用。4.6液相色谱质谱法(LC-MS)液相色谱质谱联用技术(LC-MS)是一种内喷射式和粒子流式接口技术将液相色谱与质谱联接起来,用于分析对热不稳定、分子量较大、难以用气相色谱分析的农药残留的新方法。它具有检测灵敏度高、选择性好、定
27、性定量同时进行、结果可靠等优点。LC-MS对简单样品可进行分析前净化并具备几乎通用的多残留分析的能力,用于对初级监测呈阳性反应的样品进行在线确证,其优势明显。尽管LC-MS对分析技术和仪器的要求高,但它仍是一种很有利用价值的高效率、高可靠性的农药残留分析技术。4.7毛细管电泳(CE)CE的工作原理是使用毛细管柱内的不同带电粒子(离子、分子或衍生物),在高压场作用下以不同的速度在背景缓冲液中定向迁移,从而进行分离。根据样品组分的背景缓冲液中所受作用的不同,CE又被分为毛细管区带电泳(CZE)、毛细管凝胶电泳(CGE)、等电聚焦(IEF)等几大类。CE具有分离效率高、快速、样品用量少等特点。Ash
28、ok K.M等人综述了CE在农药残留分析中的应用。在农药残留分析中,毛细管区带电泳(CE)的运用最为广泛。毛细管区带电泳(CE)非常适用于那些难以用传统的液相色谱法分离的离子化样品的分离与分析。这一技术具有极高的效率和分离能力,其分离效率可达数百万理论塔板数,操作简便。毛细管电泳所需样品量极少,一般只需几纳升。目前,毛细管电泳尚缺乏灵敏度很高的检测器,可利用的紫外检测器能检测几个P,但因样品量只用几个纳升的体积,故所用样品浓度被限制在10-6。因此,只有研究开发灵敏度更高的检测系统,毛细管区带电泳的优势才能充分发挥出来。4.8免疫分析(IA)免疫分析(IA)是基于抗原抗体特异性识别和结合反应为
29、基础的分析方法。通过对半抗原或抗体进行标记,利用标记物的生物或物理或化学放大作用,对样品中特定的农药残留物进行定性定量检测。免疫分析具有特异性强、灵敏度高、方便快捷、分析容量大、分析成本低、安全可靠等优点,一般不需要贵重仪器,可大大简化甚至省去前处理过程,容易普及和推广。若开发成试剂盒,可广泛用于现场样品和大量样品的快速监测。目前,酶免疫分析方法的研究十分活跃。该方法是利用有机磷和氨基甲酸酯两类农药具有抑制靶标酶(如乙酞胆碱酯酶)活性的生化反应作用,用于对相应农药残留进行快速定性定量检测。此法既可以检验单一农药残留量,又可以检出多种农药的综合残留量。利用此方法对蔬菜、水果、果品和农产品进行农药
30、残留量测定,灵敏度高,操作简单,检测速度快。刘曙照、冯大和采用固相抗体直接竞争ELISA法测定小白菜和苹果中的甲萘威残留量,并以高效液相色谱法进行验证。结果表明:ELISA法测定小白菜和苹果中甲萘威残留的检测限为0.4ng/kg5。美、英等国曾以竞争性ELISA为基础,开发出数种农药的酶联免疫检测箱,使用的检测形式有管式的,也有微孔反应板式,定量检测灵敏度高,检测限可达g/kg级6。参考文献：1应义斌,韩东海.农产品无损检测技术M.北京:化学工业出版社,2005:52吴玉杰.食品中农药残留分析方法研究D.湖南师范大学硕士论文,20043石健,和有杰.四种农药在蔬菜上的残留研究及安全评价J.农业环境保护,1994,(5):226-2274陈静.蔬菜中有机磷杀虫剂多残留分析方法研究D.中国农业大学硕士论文,20045刘曙照,冯大和.固相抗体直接竞争ELISA法测定小白菜和苹果中的甲萘威残留J.农药学学报,2001,(4):69-726刘秀.梵朱华.单克隆抗体在农业上应用M.安徽科技出版社,l995专题论述19
