1、收 稿日期 ： 20081229 接受日期 : 20090221基金项目 ： 公益性行业 （农业 ）科研专项 （nyhyzx07-029）；热带生物技术研究所中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金 (ITB-BZD0733)作者简介 ： 宁文彬 ，男 ，在读硕士生 ，Tel: 0898-66890772，E-mail:nwb-觹 通讯作者 。 Author for correspondence Tel: 0898-66890772，E-mail:果 树 学 报 2009，26（3）: 386389Journal of Fruit Science香蕉果实采后乙醇脱氢酶活性与乙烯代谢的关系宁文
2、彬1，2，刘菊华1，贾彩红1，徐碧玉1，金志强1*（1中国热带农业科学院热带生物技术研究所 ，海口 571101；2海南大学农学院 ，海口 571101）摘 要 ： 乙醇脱氢酶 （ADH）在果实的生长发育以及果实成熟过程中起到一定的作用 。 以香蕉果实为材料 ，测定了乙烯 、1-甲基环丙烯 （1-MCP）处理对香蕉果实采后乙烯释放量和 ADH 活性的影响 ，以了解 ADH 活性与乙烯代谢的关系 。 结果表明 ，与正常后熟的香蕉相比 ，乙烯处理使香蕉果实的乙烯释放量提前 11 d 达到峰值 ， ADH 活性提前 11 d开始上升 。 1-MCP 处理则显著抑制了香蕉的乙烯释放 ，没有出现乙烯峰
3、，ADH 活性也被抑制 ，活性变化不明显 。 推测在香蕉果实采后成熟过程中乙醇脱氢酶 （ADH）活性与乙烯代谢成正相关 ，乙醇脱氢酶 （ADH）活性可能受乙稀代谢调控 。关键词 ： 香蕉 ； 乙醇脱氢酶 ； 乙烯 ； 1-甲基环丙烯中图分类号 ：S6681 文献标识码 ：A 文章编号 ：10099980(2009)0338604Study on the relationship between activity of alcohol dehydrogenase andethylene metabolism for postharvest banana fruitNING Wen-bin1，2，
4、LIU Ju-hua1，JIA Cai-hong1，XU Bi-yu1，JIN Zhi-qiang1*（1Research Institute of Biotechnology for Tropical Crops，Chinese Academy of Tropical Agricultural Science，Haikou， Hainan 571101 China；2College of Agriculture，Hainan University，Haikou， Hainan 571101 China）Abstract: Alcohol dehydrogenase （ADH） plays i
5、mportant roles in the proceses of fruit growth， development and ripening. Inorder to understand the relationship between ADH activity and ethylene metabolism during ripening of banana fruit，ethylenerelease and ADH activity were measured after ethylene and 1-MCP （1-methylcyciopropene）treatment. The r
6、esults showedthat with ethylene treatment，the ethylene biosynthesis and ADH activity peak appeared 11 days earlier than the normallyripened fruits. However，under 1-MCP treatment，the peak of ethylene release was not obvious and ADH activity was greatlyinhibited. It indicated that exogenous ethylene c
7、ould promote ethylene biosynthesis and ADH activity of banana fruit. This re-sult suggested that ADH activity was positively related to ethylene metabolism，the ADH activity may be controlled by ethy-lene metabolism.Key words: Banana； Alcohol dehydrogenase； Ethylene； 1-methylcyciopropene香蕉属于典型的呼吸跃变型热
8、带水果 ， 对乙烯非常敏感 ； 一般认为采后香蕉果实是由乙烯引起的呼吸跃变 ， 大量乙烯的产生 ， 引起许多生理生化变化 ，如淀粉转变为糖 、多酚的降解 、结构碳水化合物的酶解 。 这些变化都影响着果实的品质 ，如硬度 、涩味 、香味 、颜色以及货架期1。 因此 ，尽可能抑制乙烯合成或阻止乙烯发挥作用就成为延长香蕉保鲜期的关键措施之一 。 乙烯受体抑制剂 1-甲基环丙烯 （1-MCP ），能不可逆地与乙烯受体结合 ，从而阻断了与乙烯的正常结合 ， 有效地抑制了植物对内源或外源乙烯的敏感性2，因此在园艺采后保鲜领域具有良好的应用效果 。乙醇脱氢酶 （ADH，E.C.1.1.1.1.）是乙醇发酵的
9、主导酶 ，催化乙醛和乙醇间的氧化还原反应 ，在植物无氧呼吸过程中起着重要作用 。 有研究表明3，ADH属于厌氧诱导蛋白 ， 陆生植物在土壤涝渍和环境缺氧等条件下可诱导根组织 ADH 活性的大幅度升高 ，其活性在淹水后短期升高有利于植物供应能量 。乙醇脱氢酶 （ADH）在果实的生长发育中起到一定的作用 ，可参与鳄梨 （Persea americana Mill.）4、马G1G2G3G1G3G2G4G1G4G2G5G1G5G2G1 G3 G4 G5 G6 G2 G7 G8 G9G3G1G3G4G3G6G3G7G3G9G3GAGBGCGDGEGFG10G3GAGBGCGDG11G12G13G14G1
10、1G15G13G16G11G17G18G19G1AG10G10G16G1BG12G15G14G1CG10G12G1DG1EG13G16G1DG16G1FG20!GEGFG10G13G11“#G1CG13G16G13G10G11G12G13G14G11G15G13G16G11图 1 乙烯 、1-MCP 处理在香蕉果实采后不同时间乙烯释放量的测定Fig. 1 Changes in ethylene production in naturally ripenedbananas，ethylene-treated bananas，and 1-MCP-treatedbananas at different
11、 ripening stage3 期铃薯 （Leptinotarsa decemlineata）5等果实成熟调节等多种生理生化代谢 。同时 ，在葡萄 （Vitis vinifera L）果实中乙醇脱氢酶 （ADH）基因表达与乙烯生物合成及代谢有一定的关系6。 在哈密瓜 （Melon）果实中乙醇脱氢酶 （ADH）可能参与乙烯信号的传导并调节芳香物质的生物合成7。 但目前关于乙醇脱氢酶 （ADH）活性与乙稀代谢之间的相互作用在果实采后成熟过程中的研究却很少 。 利用外源乙烯和 1-甲基环丙烯（1-MCP）对香蕉果实进行处理 ，分析采后香蕉果实在外源乙烯和 1-MCP 处理下乙烯生物合成及代谢的变化
12、与乙醇脱氢酶 （ADH）活性之间关系 ，探讨它们对香蕉果实采后成熟过程的影响 。 为进一步研究ADH 基因在香蕉果实采后不同成熟过程中的差异表达提供参考依据 。1 材料和方法1.1 材料与处理实 验 材 料 为 巴 西 香 蕉 （M.AAA GroupCavendish）果实 ，采自中国热带农业科学院热带生物研究所香蕉园 。 采收成熟度一致 、饱满度约为 78成 、生长期为 110 d 的果实 ，将香蕉去轴落梳 ，分成单个香蕉果指 ，挑选大小均匀 ，无病虫害及机械损伤的果实 ，去掉顶部的干花 ，并用 0.1%次氯酸钠进行表面消毒 10 min。取出晾干一个晚上 ，根据采后天数随机选取 3 个果
13、实装进一个保鲜盒中 ， 外源乙烯处理准备 8 个盒 。1-甲基环丙烯 （1-MCP ）处理准备 10个盒 。 外源乙烯处理 ，参考 Liu8的方法 ：采后 0 d 单蕉指密闭注射 100 LL-1ethylene，22 ，18 h 后开盖 。 根据采后天数 0、1、2、3、4、5、6、7 d，8 个等级进行取样 。 1-甲基环丙烯 （1-MCP ）处理 ， 参考 Seemi等9的方法 ：采后 0 d 香蕉果指 ，按 1 LL-1的量称取 1-MCP 粉末加水 ，密闭在 22 ，18 h 后开盖 。 根据采后天数 0、2、4、6、8、10、12、14、16、18 d，10 个等级进行取样 。1.
14、2 方法1.2.1 香蕉果实采后乙烯释放量的测定 将不同处理的香蕉果实分别放入密封罐中 ，密闭 3 h 后 ，用注射器抽取罐内气体 1 mL， 采用日本岛津 GC17A 型气相色谱仪测定果实乙烯释放量 ，每罐测定 4 次 。气相色谱的工作条件为 ：火焰离子化检测器 （FID），载体为 6080 目 AI2O2柱温 90 ，进样温度 100 ，载气为 N2，流速为 25 mLmin-1。 由面积外标法计算乙烯释放量 ，重复 3 次 。1.2.2 香蕉果实乙醇脱氢酶的提取与测定 乙醇脱氢酶粗酶液的提取 ： 按照现代植物生理学实验指南（中国科学院上海植物生理研究所 ， 北京科学出版社 ）的方法 。
15、根据采后成熟天数 ，按不同处理从每盒中随机选取 1 个果实称取 1.0 g 香蕉果肉于预冷的研钵中 ， 加入 3 mL 预冷的 0.2 molL-1Tris-HCl pH7.8（含 1 mmolL-1PMSF）和质量分数为 10% PVPP，在冰浴上研磨成浆 ，于 4 、12 000 g 条件下离心 20min，上清液用于酶活性测定 。乙醇脱氢酶活性的测定 ：参考 Hanson 等10的方法 。 取 100 L 酶液和 2.85 mL 酶反应液 （150 mmolL-1Tris，pH 值 8.0，0.3 mmolL-1NAD）混匀 ，然后加入 30 L 95%乙醇启动反应 ， 用紫外分光光度计
16、于340 nm 处测定光密度值 。 以每 min A340增加 0.01 为1 个酶活性单位 （U），酶活性用 Umin-1表示 。2 结果与分析2.1 外源乙烯 、1-MCP 处理对香蕉果实采后乙烯释放量变化的影响图 1 表明 ，香蕉果实正常成熟条件下 ，采后早期乙烯释放量较低 ，变化不明显 ，到采后 10 d 乙烯释放量增加比较明显 ，表明乙烯生物合成开始启动 。在采后 14 d 乙烯释放量达到峰值 ， 约为 8 d 的 25 倍 ，从 1418 d 一直下降 ，在采后 18 d 下降到最低值 。外源乙烯对香蕉果实进行处理 ， 乙烯释放时间比正常成熟明显提前 ，处理后马上启动乙烯的生物合成
17、 。在处理后 3 d 乙烯释放量达到峰值 ， 为开始 0 d 的 30倍 ，比正常成熟提前 11 d 达到峰值 。 1-MCP 对香蕉宁文彬等 : 香蕉果实采后乙醇脱氢酶活性与乙烯代谢的关系乙烯释放量Ethyleneproduction采后时间 Time after harvesting/d1-MCP 处理 1-MCP treatment正常成熟 Normal ripening乙烯处理 Ethylene treatment353025201510500 1 2 3 4 5 6 7 8 10 12 14 16 18387果 树 学 报 26 卷G1G2G3G1G3G2G4G1G1 G3 G4 G
18、5 G6 G2 G7 G8 G9G3G1G3G4G3G6G3G7G3G9G3GAGBGCGDGEGFG10G3GAGBGCGDG10G11G12G13G14G11G15G13G16G11G10G17G18G19G1AG10G15G1BG12G15G14G1CG10G12G1DG1EG13G16G1DG16G1FG20!GEGFG10G13G11“#G1CG13G16G13G10G11G12G13G14G11G15G13G16G11乙醇脱氢酶活性ADHativity/Umin-1 g-1采后时间 Time after harvesting/d图 2 乙烯 、1-MCP 处理在香蕉果实采后不同时间
19、乙醇脱氢酶活性的测定Fig. 2 The ADH activity changes in naturally ripenedbananas，ethylene-treated bananas，and 1-MCP-treatedbananas at different ripening stage果实进行处理 ，乙烯释放量变化并不明显 ，一直处于较底水平 。2.2 外源乙烯 、1-MCP 处理对香蕉果实采后乙醇脱氢酶活性的影响图 2 表明 ，香蕉果实在正常成熟条件下 ，采后早期乙醇脱氢酶活性变化不明显 。 到采后 14 d 才开始急剧上升 ，表明 ADH 活性被启动 ， 18 d 上升到最大值 。
20、 发现 ，ADH 的活性是在乙烯释放量达到峰值时才开始启动 。 外源乙烯对香蕉果实进行处理 ，使ADH 活性比正常成熟提前 11 d 被启动 ，3 d 时就开始上升 ， 6 d 上升到最大值 ， 之后开始下降 ， 同样ADH 的活性是在乙烯释放量达到峰值时才开始启动 ， ADH 活性达到最大值在乙烯释放量达到峰值之后 。 推则香蕉果实采后成熟过程中乙烯代谢可能影响 ADH 活性 。 1-MCP 对香蕉果实进行处理 ，明显抑制 ADH 活性 ，在 0 d 和 18 d 中 ADH 活性没有明显的波动 。3 讨 论香蕉是呼吸跃变型果实 ， 微量的乙烯即可启动果实的后熟 ， 其中果实迅速软化和果皮褪
21、绿转黄是香蕉采后最显著的变化 。 1-MCP 处理可以明显抑制香蕉果实的乙烯产生量和呼吸速率 ， 延缓了果实的后熟进程11-12。 本研究进一步证明 ，外源乙烯对香蕉果实进行处理使乙烯的生物合成时间明显提前 。 在处理后 3 d 乙烯释放量达到峰值 ，为 0 d 的 30 倍 ，比正常成熟提前 11 d 达到峰值 。1-MCP 处理香蕉果实明显抑制了乙烯的生物合成 ，没有乙烯峰的出现 。乙醇脱氢酶 （ADH，E.C.1.1.1.1.）催化乙醛和乙醇相互转化的可逆反应 ， 广泛分布于各类植物和植物器官组织中 ；在植物处于逆境 、果实的生长发育以及果实采后成熟衰老等过程中均发现了 ADH 的存在并
22、与之相关的作用 。有研究表明 ，当植物处于逆境时 ，ADH 参与植物逆境反应信号的转导 ， 同时激素乙烯 、ABA 对 ADH 有一定的诱导作用13。 在葡萄的果实生长发育中克隆 3 个 ADH 基 因 ， 分 别 为VvADH1、VvADH2、VvADH3。 通 过 Northern 表 明VvADH1 和 VvADH3 的 mRNA 仅在浆果发育的早期有短暂的累积 ；而一旦进入转熟期 ，VvADH2 产生过量表达 。 分析表明 ， 在浆果发育过程中 ， 果实中ADH 基因主要就是 VvADH2。 浆果进入转熟期后 ，ADH 活性的上升与 VvADH2 表达相一致14。乙醇脱氢酶 （ADH）
23、在果实采后成熟衰老以及芳香物质的生物合成也起到一定的作用 。有研究表明 ，ADH 可能参与果实成熟过程中乙烯信号的传导 。 在研究葡萄的浆果发育中发现 ，VvADH2 基因的表达水平和 ADH 的活性成正相关 。 当用 1-MCP 处理后发现可以抑制 VvADH2 的表达水平和 ADH 的活性 。 同时用 2-CEPA 处理并在厌氧的条件下发现可以提高 VvADH2 的表达水平和 ADH 的活性6。 在研究 2 个同源性很低的哈密瓜 ADH 基因 Cm-ADH1和 Cm-ADH2 时发现用 1-MCP 处理可以抑制 ACC氧化酶表达 ，同时也抑制 Cm-ADH 基因的表达 。 乙烯处理则可以提
24、高 Cm-ADH 和 ACC 氧化酶的表达水平 。同时 Cm-ADH 参与调节果实中芳香物质的合成7。本研究中 ，利用外源乙烯 ，1-MCP 对呼吸跃变型香蕉果实进行处理 ，结果表明 ，外源乙烯处理使香蕉果实乙烯生物合成明显提前 ， 比正常成熟提前 11 d达到峰值 。乙醇脱氢酶 ADH 活性同样比正常成熟提前 11 d 上升 。 但是 ADH 活性是在乙烯释放量达到峰值时才开始被启动 。 可见乙烯在促进乙烯生物合成及代谢的同时进一步促进乙醇脱氢酶 （ADH）的活性 。 1-MCP 处理香蕉果实使乙烯生物合成和 ADH活性都被明显抑制 ，乙烯释放量没有峰值出现 ，ADH一直处于较低的活性水平
25、。可见 1-MCP 抑制乙烯生物合成及代谢的同时也抑制了香蕉果实采后乙醇脱氢酶的活性 。 所以 ， 根据前人研究和本实验结果推测 ， 外源乙烯在调节内源乙烯生物合成的同时进一步调节 ADH 活性 ， 并调节 ADH 基因的表达水平 。1-MCP 则在抑制内源乙烯生物合成的同时进一步抑制 ADH 活性和 ADH 基因的表达水 。 所以 ，在香1-MCP 处理 1-MCP treatment正常成熟 Normal ripening乙烯处理 Ethylene treatment201510500 1 2 3 4 5 6 7 8 10 12 14 16 183883 期蕉果实采后成熟过程中乙烯代谢与乙
26、醇脱氢酶（ADH）活性成正相关 ，乙醇脱氢酶 （ADH）活性由乙稀代谢所调控 。但是 ，目前的研究主要集中于乙醇脱氢酶 （ADH） 基因的表达水平 ， 对于乙醇脱氢酶（ADH）基因与乙烯信号的传导方式以及乙醇脱氢酶（ADH）性活在果实采后不同成熟过程中相互作用机理的研究却很少 。 所以关于乙烯信号的传导方式与ADH 基因相互作用在果实成熟中作用还有待进一步研究 。参考文献 References：1 JAMES J， GIOVANNONI. Genetic regulation of fruit developmentand ripeningJ. The Plant Cell， 2004，16:
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