1、13转化再生植株的检测131 GUS检测按Rueb等pj的方法对愈伤组织和转化小苗的幼叶进行组织染色。GUS染色结果进行照相记录。132 DNA的提取采用CTAB法提取植物基因组DNA。133 PCR检测1331标记基因NP咒啪引物序列和反应条件上游：5GCTCGACGTTGTCACTGAAG3，下游：5TCGTCCAGATCATCCTGATC3反应条件：94“C预变性5 rain， 94“C变性l rain，55“C退火1 min，72“(2延伸20 S，45个循环后72延伸10rain。PCR产物用l的琼脂糖电泳检测并照相记录。1332葡聚糖酶基因的引物序列和反应条件上游：5TAGTGTA
2、TACmATTTTGCATCATGC3：下游：5TGTTTGCTlTGTAGAGATCTATAACTTC 3。反应条件：94“C预变性5 min，94“C变性l rain，50退火1 min， 72“C延伸30 S，45个循环后72延伸10 rain。PCR产物用l的琼脂糖电泳检测并照相记录。1333几丁质酶基因的引物序列和反应条件上劫字：5CGTGGCA A ATTGGCA：rGC 3：下游：5GGTGTGTlbGGTAAATATAAGATCG3。反应条件：94“C预变性5 rain，94“C变性1 min，50“C退火l rain， 72。C延伸30 S，45个循环后72“C延伸10 ra
3、in。PCR产物用1的琼脂糖电泳检测并照相记录。图1葡聚糖酶基因和几丁质酶基因表达载体Fig1 Construction ofthe chifinase and glucanase genes vector2结果和分析21抗kan植株的再生如图2所示，西瓜对照子叶外植体在无K的MS培养基中再生率可达95，在Kan浓度O一125 meL的浓度梯度中，芽再生率随着Kan浓度升高而降低，达到125 mg几时，芽再生困难。Kin滩度(mglL)图2 Kan浓度对西瓜抗性芽分化的影响Fig2 Effects ofKan concen打ntion on shoo缸differentiation frequ
4、ency图3不同l(an浓度对西瓜再生芽的影响Fig3 Effect ofdifferent Kan concentration on watermelon shootsAFan 0m牡；BKan25mg，I；CK50 rrl叽；DKan75“g几；EKanl00mgJL；FKanl25 met,22 GUS检测西瓜子叶外植体经农杆菌感染后，经过预培养后转入选择诱导培养基，7 d后就分化产生的小芽。30 d后将再生芽切下放入伸长培养基上进行伸长。待芽伸长至约1，5 cm高时，切下并接种入生根培养基，7 d后便可分化出根，得到正常的完整植株。转化植栋的再生和生根情况如图4所示。在100mg，LK
5、an的再生芽筛选培养基中，Kan阳性芽频率为303。有3l，5的Kan阳性芽在含10 mgL Karl的生根培养基中生根，本试验共得到转基因植株13株。在转化过程中，分别对抗性愈伤组织和植株幼小叶片进行GUS染色。从图5可以看出， Kau阳性外植体百分率随着预培养时间的延长先上升而后迅速下降，GUS阳性芽百分率逐渐升高，在预培养时间30 h时，达到364，而后变化比较平缓。在筛选生根培养基上，仍然有74，5的植株表现为假阳性。Nauerby等”J在转化大豆GUS捡测中也报道了类似结果。图4转化檀株在Kan中再生和生根(左边为外檀体在100 mgL Knn的再生照片，右边为Ken抗性芽在10 m
6、gL Kan生根的照片)Fig4Shoots regeneration and roots induction ofhonsgenie watermelons on Kan medlum(1eft，shootsregeneration oftransgroic watermelon；right root induction oftransgenic watermelon)326预培养时间图5不同预培养时问对西瓜转化的影响Fig5 Effect ofdifferent precnlture time on watermelon transformation圈6转化西瓜愈伤和叶片GUS染色(左边为
7、愈伤，右边为小叶片)Fig6GUS assay oftransformed callusand leaf(1eft,callus；right,leaf)23 PCR检测从图7可以看出，阳性质粒对照约在240 bp处有一条特异扩增带， 转化植株同样也有一条扩增带，而未转化植株则没有特异带出现。因为标记基因NPTH是和目的基因高度连锁的，表明目的基因很有可能已经导入西瓜。为了进一步验证该结果，对檀株分别进行了葡聚糖酶和几丁质酶基因特异引物PCR扩增鉴定(图8，图9)。由图8和图9可以看出，阳性质粒对照均检测到一条特异性扩增带，转化植株同样也有一条特异性扩增带，进一步证明目的基因葡聚糖酶和几丁质酶基
8、因已经转入西瓜植株。M 1CK 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13圈7 NPTII基因PCR特异检溯Fig7 PCRampU tnn$窖enjc_tlcationofNPTllin putative watermelonM 1 Kb DNA标准分子量； I。阳性质粒对照；cK来转化植株；2-13。转基因植株M。1 kb matkvr,I。positive control；Ck non-transgenie watermelon；2-13transgenicwatermelonwith脚TM 1CK 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12巧图8葡聚糖酶基因PCR特异
9、检测Fig8 PCR amplification ofglucanase in putative transgenic watermelonM 1 Kb DNA标准分子量；1，阳性质粒对照；CK未转化植株；2-13，转基因植株M，l kb marker；1，positive control；CK,non-transgenic watermelon；2-13，transgenic watermelon with酎UCarZaSC327M 1 CK 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 D圄9几丁质酶基因P豫特异检测Fig9 PCR mmplification ofchitinase
10、in transgenic watermelonM，IKb DNA标准分子量；1，阳性质粒对照；ck未转化植株：213：转基因植株M，1 kb marker；1，positive control；CK non-transgenic watermclon；2-13，transgenic watermelon with chitinase24转基因西瓜T0代的形态特征转基因西瓜的To代生长与对照相比在植株形态上没有明显差异，目前部分转基因西瓜已经开花，拟进行单株自交工作。3讨论图10转基因西瓜To代的形态特征(左边为对照右边为转化植株)Fig10 Morphologic feature ofthe
11、 transgenic watermelons(1e屯non-lransgenic watexmelon；一g吣mmsgenic W锄锄elon)西瓜枯萎病是西瓜生产中的限制因子，迄今为止，已发现西瓜枯萎病有3个生理小种，即生理小种0，生理小种1和生理小种2。与其他两个生理小种相比，生理小种2更具侵染性。西瓜对枯萎病的抗病性为多基因控制，遗传规律比较复杂，而且病源菌本身不断分化，通过常规方法选育抗病品种变得非常困难。转基因技术则为西瓜的品种选育提供了新的选择途径。西瓜、甜瓜等绝大多数双子叶植物在感染农杆菌侵染时，能对农杆菌侵染作出相应的受伤反映，因此农杆菌介导法被广泛的用于双子叶植物的基因转化
12、。328GUS染色HPCR鉴定结果表明葡聚糖酶和几丁质酶复合基因已被成功导入西瓜，转化To代植株生长完全正常。蓝海燕等口I报道，通过农杆菌介导法转化几丁质酶和葡聚糖酶基因的烟草对赤星病病原菌(Alternaria altermata)的侵染具有较高的抵抗能力，但也有报道表明几丁质酶基因导入某些植物会表现出不同程度的基因沉默【7-lq。转化的西瓜植株葡聚糖酶和几丁质酶能否表达，以及转化植株的枯萎病抗性如何，有待作进一步研究。参考文献：l Brolglie Karen,Ilen cheK Mark Hlledar,et a1Transgenic plants with enhanced resis
13、tance to the fungal pathogenRhizoatoia solani Science，1995。8(1)，97-1092 Zhu Q，Maher E Al Masoud S，ct a1Enhanced protection against fongal attack by constitutive coexpressionofohitthase and gincanasc genes in廿msgenic tobaccoBiotechnology,1994，12(8)807-8123 蓝海燕，田颖川。王长海等。表达113-葡聚糖酶基因的转基因烟草及抗真菌病的研究遗传学报，
14、2000，27(1)。70774 蓝海燕，陈正华农杆菌介导法将卜1，3葡聚糖酶基因导入油菜的研究初报。中国油料作物学报，2000，22(1)，6-105 Rueb SImproved hitochemical staining for 8-D-gIuenronidase activity in monocotyledonous plantsRice GenetNewsL 1989，897-8986 Nauerby B，Madsen MA rapid and efficient system for pea suitable mmsformationPlant Cell Report，1991，
15、9：676-6797 Kunz,CHSchob,L Start,et al Developmentally regniated silencing and resefion oftobacco chifinase Iransganicexpression Plant J，1996，437-4508 Chen W EXGu,Q HLiang,et a1Introduction and constitutive expression of a dee ehitinase gene in breadwheatusingbiolisticbombardment andfoebargenea selec
16、tablemarkerThanrApplGend，1998，1296-13069 ZhuHSMuthukrcshana,SKdshnaveni,ct a1Biolistictransformation of sorghumusing a rice chitinase geneJGet Breed,199824325210 Charennpornwatlana S，k VL Wang,et a1InimdtanceI expression and silencing ofa chitinase transgenicin rice Thcor_ApplGenct，1999,371-378TFans
17、formation of Glucanase and Chitinase Genes in WatermelonZhang Mingfang*Yu Tianxiang Mao Bizen91 He Zhuhua2(1 College ofAgriculture and Biothechnology,Zhejiang University,Hangzhou 310029，China；2National Laboratory ofPlant Molecular Genetics,Shanghai Lrkstitute ofPlent Physiology and Ecology,Shanghai
18、InstihI慨for Biological SciencesChineseAcademy ofSciences，Shan曲ai 200032，chi)Abstract：A construct containing a rice chitinase gene and an alfalfa glucanase gene wasco-transferred into watermelon through Agrobacteriura tumefaciens-mediated methodPlantlets wereregenerated in vitro by resistance selection on MS medium containing various concentions ofkanamycinGUS and PCR-aided assays indicated that both chitinase and glucanase genes have been co-transferredinto watermelon successfullyKey words：Watermelon；Glueanase；Chltinase；Gene transformation329
