1、Marine Sciences/ Vol. 26 ,No. 12/ 2002 41菌 2藻相互作用下胞外酶活性变化研究 *郑天凌 1 徐美珠 1 俞志明 2 宋秀贤 2(1 厦门大学生命科学学院应用与环境微生物研究所 361005)(2 中国科学院海洋研究所 青岛 266071)提要 报道了在实验室培养条件下塔马亚历山大藻 ( Alexandrium tamarense) 与几株海洋细菌之间的生态关系。实验表明 , 在培养前期 , 培养液中的营养成分尚足以维持藻类和细菌的生长 ,细菌的加入是胞外酶活性升高的主要原因所在 ;在培养的后期 ,混合培养液和藻对照培养液中胞外酶活性持续升高。 A. t
2、amarense 在单独培养下 ,其胞外酶活性从第 12 天起才有明显的提高 ,第 16 天增加较快 ,达到 0. 104 mol/ (L h) ; 至第 20 天藻体衰败时 ,胞外酶活性达到最高水平 ,为 0. 385 mol/ (L h) 。 Z7 细菌单独培养时 ,其胞外酶活性在单独培养的 2d 后有一个高峰值 0. 133 mol/ (L h) , 随着培养时间的延长 , 其酶活性逐渐降低。细菌 Z7 和 Z10 与 A.tamarense 共培养下 ,两者胞外酶活性变化趋势相似。关键词 塔马亚历山大藻 ( Alexandrium tamarense) ,细菌胞外酶 ,菌藻关系* 国家
3、 973 项目 2001CB409710 号 ; 国家自然科学基金项目39790110号和 30070157号。第一作者 :郑天凌 ,出生于 1955 年 ,博士 ,教授 ,博导 ,在研项目主要有 :国家“九五”重大基金项目中国沿海典型增养殖区赤潮灾害发生动力学及其防治机理研究 ; 国家自然科学基金项目海洋污染环境的生物修复作用研究等。通信地址 : 厦门大学生命科学院应用与环境微生物研究所 ,361005 ,E2mail :wshwzh jingxian. xmu. edu. cn收稿日期 :2001207227 ; 修回日期 :2002205218赤潮藻类的生长和增殖 ,除了与环境中温度、光
4、照、盐度、营养物等理化因子有密切关系外 ,还与海水中的微生物有着相当复杂的生态关系 1 3 。一方面细菌吸收藻类产生的有机物质 ,并为藻类的生长提供营养盐和必要的生长因子 , 从而调节藻类的生长环境 ;另一方面细菌也可通过直接或间接的作用抑制藻细胞的生长 ,甚至裂解藻细胞 ,从而表现为杀藻效应。微生物的这种抑藻、杀藻及有效降解藻毒的作用具有种间特异性。所以 ,利用微生物的种间特异性 ,抑杀有害藻类而不损害其它优良浮游微藻繁殖生长 ,将成为防治有害藻类的重要手段 4 ,5 。胞外酶是指那些在细胞内合成后穿过细胞质膜的酶。胞外酶水平在水体中被认为是衡量细菌和微型生物生物量的重要指标 6 。 2葡萄
5、糖苷酶是最为常见的一种胞外酶 ,它广泛存在于海水、半咸水、海洋沉积物中 ,可以水解多糖类物质中的 2葡萄糖苷键。塔马亚历山大藻 ( Alexandrium tamarense) 属于涡鞭毛藻纲 , 是一种可产生 PSP(神经麻痹性贝毒 ) 毒素的海洋甲藻。由 A. tamarense 产生的 PSP毒素可以通过贝类的积累而达到使人中毒的浓度。 A. tamarense赤潮不仅对人体健康造成直接危害 ,而且对水产养殖业、海洋生态环境、自然景观的破坏也是相当严重。因此 ,开展对 A. tamarense 的研究具有重要的意义。本研究目的在于探讨海洋细菌在塔马亚历山大藻赤潮生消过程中的作用类型 ,为
6、利用微生物防治赤潮提供可靠的理论和实践基础。1 材料1. 1 藻种来源及培养条件1. 1. 1 藻种 实验用的藻种为单细胞藻类塔马亚历山大藻 ,由暨南大学水生生物研究所提供。1. 1. 2 培养基 藻类所用培养液选用改良的 f/ 2培养液进行培养。1. 1. 3 培养条件 藻类置于三角瓶中培养 , 温度为 22 1 , 光照时间 L D = 12 h 12 h , 光照强度 3 500 lx。研究报告 R EPORTS海洋科学 / 2002 年 / 第 26 卷 / 第 12 期421. 2 菌种的来源1. 2. 1 细菌来源 从厦门西港海域 1 10 cm深的海洋沉积物中分离。1. 2. 2
7、 细菌的分离 采样时间为 1998 年 6 月 ,采样地点为厦门西港 ,取表面 1 10 cm的沉积物。在2216 E海洋细菌固体培养基上培养 2 d 之后 , 表面长出大小形态多样的细菌菌落。此时进行细菌的分离。最初分离出 12 株菌落特征差异较大的细菌 , 进行预备实验。经过预备实验筛选出 3 株形态特征和生理生化反应特性具代表性的细菌 ,暂称之为 Z5 , Z7 , Z10 , 分别对这 3 种细菌进行形态学和分子生物学的鉴定。1. 3 胞外酶活性的测定实验选用 2葡萄糖苷酶作为测定对象。用定量移液器移取 2 ml 水样至预先经灭菌处理的培养瓶中。每个样品包括 2 个空白组和 3 个平行
8、组 ,加样后 ,立即加入 50 l 底物 MUF2D2glucoside 工作液 (用无菌蒸馏水和甲基溶纤剂以 1 1 的比例溶解底物配制而成 , 浓度为 10 nmol/ L) , 样品中底物的终浓度为 250 mol/ L , 立即在空白组中加入 50 L HgCl2溶液 (浓度为 2mmol/ L)终止酶反应。在室温下避光培养 2 3 h , 培养结束后立即在平行组中加入 HgCl2 溶液终止反应 ,并迅速冷冻保存。测试前逐步解冻恢复至室温 ,用 Hitachi 860 荧光分光光度计测定样品荧光强度 , 激发光和发射光波长分别为 353 nm , 450 nm(其它参数为 :狭缝宽 E
9、x = 10 nm , Em = 10 nm ,扫描速率为 60/ s) 。胞外酶活性由下式计算 :V = ( F - Fb ) B/ ( T S)其中 V 为胞外酶水解底物的速率 ( g/ (L h) ) ;F为平行样品的荧光强度 (平均值 ) ; Fb 为空白样品的荧光强度 (平均值 ) ; S 为单位浓度标准荧光物质的荧光强度 ( mol/ L) ; T 为培养时间 ( h) ; B 为 1 mol底 物 中 有 机 组 分 的 碳 含 量 ( 本 实 验 底 物 为MUF2D2glucoside , B = 72(g L) / mol) 。用无菌海水配制浓度为 1 , 0. 5 , 0
10、. 25 , 0. 125 ,0. 063 , 0. 032 mol/ L 的标准荧光物 MUF溶液 ,与样品同期测定荧光强度 ,作标准工作曲线 ,斜率即为 S。在该实验中观察对照藻在实验室中自然生活状态下培养液中 2葡萄糖苷酶水平的变化。并取培养48 h 的海洋细菌 Z7 和 Z10 以无菌海水稀释至密度为1 1012 个 / ml 的活细菌悬浊液 , 在培养的第 6 天将2. 5 ml 活菌液加入 500 ml 藻细胞的培养液。即使培养液中的细菌密度为 5 109 个 / ml。分别测藻细胞密度和水体中 2葡萄糖苷酶的变化。实验结果如表 1 3所示。实验组胞外酶活性 mol/ (L h)6
11、 d 8 d 10 d 12 d 14 d 16 d 18 d 20 dA藻对照 0. 021 0. 037 0. 037 0. 056 0. 082 0. 104 0. 287 0. 385A + Z7 0. 041 0. 184 0. 148 0. 059 0. 145 0. 322 0. 471 0. 489Z7对照 0. 011 0. 133 0. 133 0. 060 0. 058 0. 053 0. 050 0. 048A + Z10 0. 086 0. 482 0. 406 0. 111 0. 186 0. 479 0. 488 0. 490Z10对照 0. 050 0. 062
12、 0. 066 0. 050 0. 057 0. 064 0. 032 0. 035表 2 A. tamarense 与细菌 Z7 或 Z10 共同培养对水体中 2葡萄糖苷酶活性 ( mol/ ( L h)的影响Tab. 2 The effect on GlcA ( mol/ ( L h) ) when A. tamarense is cultured with bacteria Z7 or Z10实验组藻细胞密度 (个 / ml)0 d 2 d 4 d 6 d 8 d 10 d 12 d 14 d 16 d 18 d 20 dA对照 7 11 27 74 215 589 881 1 328
13、2 310 1 885 1 540A + Z7 11 13 33 78 129 454 944 1 488 1 982 2 000 1 905A + Z10 7 14 20 49 139 362 960 1 652 2 920 2 130 1 620表 1 A. tamarense 与细菌 Z7 或 Z10 共同培养对藻细胞密度 的影响Tab. 1 The effect on alga cell density when A. tamarense is cultured with bacteria Z7 or Z10研究报告 R EPORTSMarine Sciences/ Vol. 26 ,
14、No. 12/ 2002 43表 3 菌藻共同培养时 2葡萄糖苷酶活性同二者单独培养时酶活性相加之和的比较Tab. 3 The comparison of GlcA in co2cultured system with that in controlled system实验组 胞外酶活性比 ( %)6 d 8 d 10 d 12 d 14 d 16 d 18 d 20 dA藻对照 + Z7对照 100 100 100 100 100 100 100 100A + Z7共同培养 128 108 87. 1 50. 9 104 211 140 113A藻对照 + Z10对照 100 100 100
15、 100 100 100 100 100A + Z10共同培养 121 487 394 105 134 285 153 1172 结果与讨论2. 1 革兰氏染色实验和光学显微镜观察染色与镜检结果为 : Z5 : 革兰氏阳性 ,短杆状 ,长0. 7 1. 0 m , 宽 0. 4 0. 5 m , 两端椭圆。 Z7 : 革兰氏阳性 ,杆 状 ,带荚膜。 Z10 :革兰氏阳性 ,短杆状 ,长1. 2 m ,宽 0. 5 m ,两端椭圆 ,呈胶囊状。2. 2 细菌的分子生物学鉴定利用国际数据库中的数据 , 通过序列分析和树图构建 , 得到这 3 株细菌在分类学中的位置 : Z5 属于鞘氨醇单胞菌属
16、( Sphingomonas) , 但基因库中尚未发现与之相符的种 ,很可能为一新种。 Z7 与细菌基因库中巨大芽孢杆菌 ( Bacillus megaterium ) 基本一致 (仅有 2个核苷酸差异 ) , 是 Bacillus megaterium 的同种不同株系 ; Z10 为芽孢杆菌的一种 , 与 Bacillus halmapalus 的16S rDNA 差异仅为 2 %。2. 3 A. tamarense 藻生活过程中胞外酶的自然变化以及加入细菌对其产生的影响实验结果如表 1 3 所示。由表 1 可以看出 ,在藻类生长的指数期加入该浓度的活细菌 ,对藻细胞的生长有一定的影响。在培
17、养前期 ,细菌对藻细胞生长的影响不明显 ;在培养的中期 ,这种影响比较明显。在培养的第 14 天 , 加入细菌 Z7 的培养液中藻细胞的密度为对照的 138. 9 % ,加入细菌 Z10 的培养液中藻细胞密度为对照的 124. 4 % ; 但总体上说来 , 在这一浓度下 ,细菌对藻细胞密度的影响是比较微小的 ,各实验组中藻细胞的密度基本上是处于同等水平的。在藻细胞水平基本相同的情况下观察各实验组中胞外酶所发生的变化 ,可以更直接地体现藻菌共同培养对水体中胞外酶活性的影响。从表 2 3 可以看出 , A. tamarense 单独培养下 ,其胞外酶活性从第 12 天起才有明显的提高 , 第 16
18、 天增加较快达到 0. 104 mol/ (L h) ,至第 20 天藻体衰败时 ,胞外酶活性达到最高 (0. 385 mol/ (L h) ) 。这表明在培养的前期藻细胞本身所产生的胞外酶活性较低 ,当藻体衰败时 ,则分泌出大量的胞外酶 ,这些胞外酶对藻细胞本身的裂解有重要作用。Z7细菌单独培养时 ,其胞外酶活性在单独培养的 2d 后有一个高峰值 0. 133 mol/ (L h) , 随着培养时间的延长 , 其酶活性逐渐降低 , 至第 14 天仅有 0. 048 mol/ (L h) 。而 Z10 细菌胞外酶活性变化在单独培养期间不显著 ,其最高峰值仅有 0. 066 mol/ (L h)
19、 ,至第 14 天相应下降到 0. 035 mol/ (L h) 。这说明单独的海洋细菌在海水培养液中 , 分泌胞外酶的量是有限的 ,并且随着培养液中可被细菌吸收的营养成分逐渐减少 ,细菌的胞外酶活性随之下降。细菌 Z7 和 Z10 与藻 A. tamarense 共同培养下 , 两者胞外酶活性变化趋势相似。胞外酶活性均在加入细菌的第 2 天 (即培养的第 8 天 ) 达到一个高峰 ,但此后其活性开始下降。到了培养的第 12 天其胞外酶活性降低到一个谷点。之后 A + Z7 培养液中胞外酶活性从0. 059 mol/ (L h) 迅速增加 , 到了第 20 天达到0. 489 mol/ (L
20、h) 的最高值 ; A + Z10 培养液中胞外酶活性从第 12 天的 0. 111 mol/ (L h) 增至第 20 天的 0. 490 mol/ (L h) 。表 3 显示的是混合培养液中胞外酶活性与对照藻细胞培养液和细菌培养液中的胞外酶活性相加之和的比较。可以看到 ,在培养前期 ,A + Z10 混合培养液中胞外酶活性明显地大于两个对照之和。在加入细菌的第2天 , 即培养的第 8 天 , 其值相当于两个对照之和的487 % ,第 10天相当于对照的 394 %。而 A + Z7 混合培养液中胞外酶活性与两个对照之和相差不多。第 8天和第10天的值分别为两对照之和的 108 %和 87.
21、 1 %。这表明A. tamarense 和 Z10 细菌之间有着较为深刻和密切的联系。 A. tamarense 可以有效地促进 Z10 细菌胞外酶活性的增长。而 A. tamarense 和 Z7 细菌的相互影响不明显 ,它不能促进 Z7 细菌的胞外酶活性增长。研究报告 R EPORTS海洋科学 / 2002 年 / 第 26 卷 / 第 12 期44研究者认为 , 在培养前期 , 培养液中的营养成分尚足以维持藻类和细菌的生长 ,细菌的大量加入是胞外酶升高的主要原因所在。大量的细菌从富营养化的2216E海洋细菌培养基上转移到 f/ 2 藻类海水培养基中 , 环境发生了较大的改变。 2216
22、E细菌培养基中富含细菌易于吸收的小分子物质如六元糖类 , f/ 2 海水培养基中小分子物质的含量则相对贫乏。环境的改变使细菌胞外酶的活性亦产生较大的改变。加入空白海水培养基的细菌 ,其胞外酶活性相应地发生一定的变化。而有藻类生长的海水中 ,因为藻类生命活动的影响 ,高聚物质的含量相对比空白海水培养基要高。因此 , 细菌与藻细胞共同培养时 , 水体中的胞外酶活性迅速升高。在培养中期 ,细菌胞外酶活性出现了明显的低谷。这是由于藻细胞大量繁殖 ,在营养竞争上处于优势地位 , 对外加细菌的生长起抑制作用 , 从而反映细菌生物量指标的胞外酶活性随之降低。在培养的后期 ,混合培养液和藻对照培养液中胞外酶活
23、性持续升高。从表 2 中可以看出 ,自培养的第16 天起 ,藻对照的胞外酶活性即出现急剧的升高。到了第 20 天 ,达到 0. 385 mol/ (L h) 。这是由于藻细胞本身在衰老和死亡的过程中向环境中释放大量的可溶性高聚有机物。这些高聚有机物诱导了细菌中胞外酶的合成。这些酶被释放到水体中后 ,又可对藻细胞的进一步裂解起作用。藻类衰亡物质的分解为细菌提供了丰富的营养 , 从而引起细菌的大量增殖 , 大量的细菌合成大量的胞外酶 ,水体中的胞外酶即急剧上升。所以 ,在水环境中藻类和细菌的关系是十分微妙的。藻类生长占优势时可抑制细菌的量 ,而当藻类衰败时则促进了细菌的增殖 5 ,6 。Munst
24、er 和 Chrost 1990 年在野外研究中发现 , 在藻类赤潮的发生阶段 , 水体中的胞外酶活性一般较低 , 而在赤潮衰败时 , 水体中的胞外酶活性急剧上升。本实验的结果与此符合。分析原因 , 研究者认为 , 在藻类生长的前期即赤潮发生阶段 , 初级生产力高 , 水体中存在大量小分子的六元糖 (葡萄糖、半乳糖等 ) ,抑制了 2葡萄糖苷酶的活性及其合成。而当藻类生长后期即赤潮衰败阶段 ,藻类大量死亡 ,释放出大量可溶性高聚有机物 ,诱导了胞外酶的合成 ,从而使胞外酶的活性升高。由此可以推断 , 胞外酶活性的高低 , 是藻细胞衰老程度和藻类赤潮发展阶段的一个重要指标。参考文献1 郑天凌、薛
25、雄志。海洋微生物在环境生态中的作用 ,海洋科学 ,1994 ,3 :35 382 郑天凌。微型藻类在海水环境中的自净作用 , 环境科学学报 ,1990 ,10(2) :195 2003 林伟、陈 马马 、刘秀云。海洋微藻除菌及除菌与自然带菌微藻生长特点比较 ,海洋与湖沼 ,2000 ,31(6) :647 6524 赵以军、刘永定。有害藻类及其微生物繁殖的基础菌藻关系的研究动态 ,水生生物学报 ,2000 , 20(2) :173 1815 连玉武、王艳丽 ,郑天凌。赤潮科学中菌 2藻关系研究进展 ,海洋科学 ,1999 ,1 :35 386 郑天凌、徐美珠、张瑶等。 EEA一种新的、重要的海
26、洋生态学参数及其应用 , 台湾海峡 , 2001 , 20(4) : 454 461THE VARIATIO N OF BACTERIAL EXTRACELL ULAR EN2ZYMATIC ACTIVITY UNDER THE INTERACTIO N BE2TWEEN BACTERIA AND AL GAEZHENG Tian2ling1 XU Mei2zhu1 YU Zhi2ming2 SONG Xiu2xian2(1School of Life Sciences, Xiamen University, 361005)(2 Institute of Oceanology, Chinese
27、 Academy of Sciences, Qingdao, 266071)Received : Jul., 27 , 2001Key Words : Alexandrium tamarense , EEA , Interaction between bacteria and algaeAbstractThis article reported the ecological relationship between Alexandrium tamarense and several strains of marine bacteriaunder laboratory cultivation c
28、ondition. The result showed that at the prophase of cultivation , the addition of bacteria con2研究报告 R EPORTSMarine Sciences/ Vol. 26 ,No. 12/ 2002 45duced an increasing of 2glucosidase activity ( GlcA) when the nutrition in the culture medium was sufficient to maintainthe growth of algae and bacteri
29、a. At the anaphase of cultivation , the GlcA rose continually in the mixed cultivation andthe control. Also the finding indicated that firstly , after 12 th day in the pure culture of A. tamarense , the GlcA roseobviously and increased to 0. 104 mmol/ (L h) at the 16 th day. Secondly , the highest l
30、evel of the GlcA (0. 385 mmol/L h) has been detected at the 20 th day during the decline of algae. And finally when Z7 bacteria was cultivated sepa2rately , the GlcA reached a peak value at 2 nd day (0. 133 mmol/ (L h) ) , then begun decreasing with the time.Moreover , the variation of GlcA , when Z
31、7 and Z10 were cultured with algae respectively , has been investigated during thisresearch work. (本文编辑 :刘珊珊 )几种优良养殖对虾杂合性的比较研究 *黎中宝 吴仲庆(集美大学水产学院 厦门 361021)提要 应用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术研究了南美白对虾 ( Penaeus vannamei) 、日本对虾( Penaeus japonicus) 、斑节对虾 ( Penaeus monodon) 、新对虾 ( Metapenaeus ensis)养殖群体杂合体缺乏及过量。结果表明南美白对虾在
32、Est - 2( F = 0. 705) , Aat - 2( F = 1. 000)两个位点上存在杂合子缺乏 ,在 Adh - 3( F = - 1. 000) , Sdh - 2( F = - 1. 000) , Mdh - 4( F = - 1. 000)三个位点上存在杂合子过量 ; 日本对虾在 Est - 1( F = 0. 258) , Sod - 1( F = 0. 467) 两个位点上存在杂合子缺乏 ; 斑节对虾在 Est - 1( F = 0. 254) , Sdh - 3( F = 1. 000)两个位点上存在杂合子缺乏 ;新对虾在 Aat - 1( F = 1. 000)
33、位点上存在杂合子缺乏 , 在 Est - 1( F = - 0. 158) , Sod - 1( F= - 1. 000) , Me - 4( - F = 1. 000) 三个位点上存在杂合子过量。导致杂合子缺乏的主要原因可能是自然选择、近交、 Wahland 效应等。杂合子缺乏会导致某些基因从基因库中消失 ,造成种群遗传多样性的降低 ,从而降低物种适应环境的能力。关键词 南美白对虾 ( Penaeus vannamei) , 日本对虾 ( Penaeus japonicus) , 斑节对虾 ( Penaeusmonodon) , 新对虾 ( Metapenaeus ensis) , 杂合子缺
34、乏 , 杂合子过量近年来 ,我国日本对虾 ( Penaeus japonicus) 、斑节对虾 ( Penaeus monodon) 、南美白对虾 ( Penaeus van2namei) 、新对虾 ( Metapenaeus ensis) 养殖发展迅猛 ,已成为我国海水养殖新的经济增长点 ,但随着养殖规模的扩大、集约化程度的不断提高及养殖环境的日趋恶化 ,对虾种质严重下降 ,已成为对虾健康养殖、持续生产的重要制约因素 ,越来越受到人们的关注。关于这4 种养殖对虾群体的遗传多样性 (另文 ) 及南美白对虾的遗传控制 1 已做了详细研究 ,本文报道了这 4 种对虾养殖群体杂合体缺乏及过量的状况
35、,以期为遗传育种等研究提供基础资料。1 材料和方法日本对虾、斑节对虾、南美白对虾、新对虾采自厦门、杏林地区的养殖群体 , 每种群随机采样 26 个 , 所有样本皆为成虾。样本迅速携至实验室内处理 ,活体解剖 ,取肌肉 ,在 - 80 冷冻贮藏备用。取冰冻的 4 种* 福建省重大科技项目 :对虾抗病良种选育 992Z27 号。第一作者 :黎中宝 , 出生于 1966 , 博士 , 副教授 ,现在厦门大学海洋与环境学院博士后流动站工作。 E-mail : Lizhong2bao jmu. edu. cn收稿日期 :2001-11-27 ; 修回日期 :2002208218研究报告 R EPORTS
