1、 2005, Vol. 26, No. 7 食品科学 基础研究785 蔡慧农 , 汤凤霞 . 稳定性二氧化氯及其在食品工业中的应用 J. 食品工业科技 , 2003, (4): 92-94.6 高 珑 , 王允祥 , 等 . 响应面法优化超高压杀灭食品中枯草芽孢杆菌工艺 J. 食品科学 , 2004, 25(3): 101-106.7 Osman Erkmen. Inactivation kinetics of Listeriamonocytogenes in Turkish White cheese during the ripeningperiodJ. Journal of Food En
2、gineering, 2000, 46: 127-131.8 Emine Bayraktar. Response surface optimization of the sepa-ration of DL-tryptopHan using an emulsion liquid membraneJ. Process Biochemistry, 2001, 37: 169-175.9 Jinhua Du Y Han, R H Linton. Inactivation by chlorine diox-ide gas (ClO 2 ) of Listeria monocytogenes spotte
3、d onto differ-ent apple surfacesJ. Food Microbiology, 2002, 19: 481-490.10 Guerzoni, Maria Elisabetta, Vannini,et al. Optimisation ofthe formulation and of the technological process of egg-basedproducts for the prevention of Salmonella enteritidis sur-vival and growthJ. International Journal of Food
4、Microbiology, 2002, 73: 367-374.11 J Du Y Han, R H Linton. Efficacy of chlorine dioxide gas inreducing Escherichia coli O 157 :H 7 on apple surfacesJ. FoodMicrobiology, 2003, 20: 583-591.荸荠英抑菌成分活性跟踪方法的研究刘 欣 1 郝淑贤 2 赵力超 1 黄 慧 1 陈永泉 1(1. 华南农业大学食品学院 广东 广州 5106422. 南海水产研究所营养与食品工程研究室 广东 广州 510300)摘 要 本文通
5、过抑菌活性分析 确定敏感菌 运用硅胶板层析技术 研究生物自显影对荸荠英提取物抑菌成分的活性跟踪方法 用 200mg/ml 荸荠英提取物丙酮溶液点样 4 l 以二元溶剂氯仿 : 甲醇 8.5:1.5 展开 贴板10min 37 培养 10h 即可得到清晰的抑菌斑色谱图 应用该方法可将荸荠英粗提物乙酸乙酯部分分离得到六个活性组分关键词 荸荠英 抑菌 生物自显影 分离度Study on Tracking Bacteriostatic Components in PuchiinLIU Xin 1 HAO Shu-xian 2 ZHAO Li-chao 1 HUANG Hui 1 CHEN Yong-q
6、uan 1(1.College of Food South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China 2.Nutrition and FoodEngineering Lab, South China Sea Fisheries Institute, Guangzhou 510300, China)Abstract The biological development technique was used to provide a qualitative analysis method for tracking bacferio
7、staficcomponents in puchiin. In the study, the Bacillus subtilis was regarded as indicator organism. The optimum conditions wereobtained as follows with 200mg/ml acetone solution extract: the volumn of sample was 4 l, the diffusion time and the culturetime were 10min and 10h respectively under the t
8、emperature of 37 . Six different antibacterial points appeared with themixture of chloroform and carbinol in the ratio of 8.5 to 1.5.Key words puchiin bacteriostatic bioautography R f中图分类号 Q58 文献标识码 A 文章编号 1002-6630(2005)07-0078-04收稿日期 2004-04-01作者简介 刘欣 (1958-) 女 副教授 硕士 主要从事农产品加工贮藏民间将荸荠英又称作马蹄黄 据说在荸荠
9、果皮与果肉之间的部位富集比较多 中药大辞典 1 中认为荸荠英是荸荠中主要的活性物质 我国作为荸荠生产大国 现仅限于马蹄淀粉 马蹄饮料 马蹄罐头的生产而荸荠皮往往被作为产品废料弃去 例如某马蹄粉厂日产淀粉 30 吨 其产生的废液量在 35 吨以上 含水量为79基础研究 食品科学 2005, Vol. 26, No. 788% 的湿渣则高达 185 吨 如果能够将这些废弃物加以利用 分离出一种天然抑菌防腐成分 满足各种保健食品生产的需要 对增加产品附加值将具有不可估量的意义在活性组分分离纯化过程中常用的快速检测方法为化学显色法 紫外可见光吸光光度法和高效液相色谱法 但由于实验初期没有标准品作为对照
10、又不清楚其化学结构 难以进行定性和定量 若采用其它生物活性测定方法如滤纸片法 则需要的样品量较大 在达到有效的活性跟踪的目的的同时 也造成了原料的大量浪费 实际上不利于微量成分的纯化 分离 另外 因植物组织中通常含有多种成分 如单萜 倍半萜 醛类 酯类 酸类 酮类 醇类等 它们中有可能是一种物质具有抑菌活性 也可能是几种或多种共同作用使得植物组织具有较强抵御病菌入侵能力 2 生物自显影法依据的原理是 具有生物活性的物质 如抗菌素等 在纸或薄层上分离后与有相当的微生物的琼脂培养基表面接触 经在一定温度下培养后 有抗菌活性物质处的微生物生长受到抑制 琼脂表面出现抑菌点而得到定位 通过该法进行活性检
11、测 一方面可以充分节约原料 达到活性跟踪的目的 另一方面还可以初步证实荸荠英中存在单一组分对菌体具有抑菌活性 证实继续分离纯化得到单一抑菌活性组分的可能性 本文则探讨该法对荸荠英提取物抑菌成分的分离效果 以期为后期的提取分离工作提供有效的跟踪方法1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌种及其来源细菌 枯草芽孢杆菌 ( Bacillus subtilis ) 金色葡萄球菌 ( Staphylococcus aureus ) 大肠杆菌 ( Escherichia coli ) 沙门氏菌 ( Salmonella sp .)酵母菌 啤酒酵母 ( Saccharomyces cerevisiae )
12、假丝酵母 ( Candida sp .)霉 菌 黑曲霉 ( Asperiyillus nigar van ) 米曲霉 ( Asperiyillus oryzae )以上菌种由华南农业大学食品微生物教研室提供1.1.2 荸荠英粗提物的制备荸荠英粗品取自于某马蹄粉厂取荸荠英粗品若干 用浓度为 95% 的乙醇于室 温下浸提一周 浸提液过滤 滤渣用相应溶剂浸提两次方法同上 合并滤液即为荸荠英粗提液 将粗提液于低于 50 的条件下浓缩 得棕色膏状物即为待测荸荠英粗提物1.2 实验方法1.2.1 指示菌的确定 - 滤纸片法参考张文治等 3,4 法 将菌悬液按一定比例加 入到培养基中 摇匀后倾注平皿 将滤纸
13、片在一定浓度的待测液中浸湿 取出晾干 隔一定距离平铺于含菌培养皿中 在适宜的温度下培养一定时间 ( 细菌 37 12h霉菌 28 48h 酵母菌 28 24h) 后 测定抑菌圈直径 以无待测样的试液作为空白1.2.2 荸荠英抑菌成分硅胶板层析方法用铅笔在已活化的硅胶板下端 1cm 处划一平行于底边的细线并等距离标志点样点 点样采用 5 l 微量进样器 点样直径小于 2mm 展开采用立式玻璃展开槽先向展开室注入展开剂 静置 30min 使展开槽内部充满饱和气体 之后将硅胶板迅速放入 尽量不破坏展开槽内溶剂的饱和状态 进行线性上行展开 层析结束时取出硅胶板 及时用铅笔标记溶剂前沿 于室温下将溶剂自
14、然挥发至干待检1.2.3 生物自显影方法在无菌条件下将制好的枯草芽孢杆菌菌悬液 (10 610 7 UCF 0.1ml) 加入到培养基中 (60ml) 摇匀后倾注平皿 每个培养皿倒入培养基约 30ml 待培养基凝固后将已层析完并挥去展开剂的硅胶板贴于培养基上 盖好平皿 静置一段时间使抑菌活性物质扩散到培养基中将硅胶板轻轻揭下 平皿置于培养箱中 37 培养一定时间即可观察分离状况1.2.4 染色在培养后的平皿中加入 1% 的碱性品红溶液 ( 刚好布满培养基表面即可 ) 染色 2min 倒掉碱性品红溶液用清水冲洗至洗出液无色为止 拍照 取滤纸 ( 剪相应形状 ) 放于培养基表面 摊平 ( 注意不能
15、留有气泡 ) 待充分接触后取出滤纸 则滤纸上印有抑菌圈 晾干描绘成图2 结果与讨论2.1 指示菌的确定从表 1 可知 在中性条件下 粗提物对所选细菌的抑菌效果较好 且抑菌活性具有量效关系 特别是对细菌中大肠杆菌 金色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑菌效果最为显著 浓度为 3.13% 仍具有明显的抑菌现象 对酵母和霉菌除假丝酵母外均不显示抑菌活性 且对细菌的抑菌活性明显强于假丝酵母 由于本研究预探讨生物自显影技术在荸荠英抑菌成分定性分析中的应用 故从菌体数量的稳定性和菌种对人体的安全性双重因素出发 选择以即能反应荸荠英抑菌活性又相对安全的枯草芽孢杆菌作为下述研究的 指示菌2005, Vol. 26,
16、No. 7 食品科学 基础研究802.2 点样量的确定将荸荠英提取物乙酸乙酯部分配成 200mg/ml 丙酮溶液作为试验样 点样量分别为 1 2 3 4 l 用乙酸乙酯展开 用生物自显 影测定分离效果实验菌种 50% 25% 12.5% 6.25% 3.13%金色葡萄球菌 15.2 9.0 7.7 7.3 5.9枯草芽孢杆菌 8.8 8.6 7.2 6.8 6.3大肠杆菌 12.1 9.3 8.7 7.7 7.2沙门氏菌 8.2 7.2 6.5 5.5 5.5假丝酵母 7.0 5.5 5.5 5.5 5.5啤酒酵母 5.5 5.5 5.5 5.5 5.5米曲霉 5.5 5.5 5.5 5.5
17、5.5黑曲霉 5.5 5.5 5.5 5.5 5.5表 1 荸荠英粗提物的抑菌状况Table 1 Bacteriostasis table of puchiin extract图 1 点样量对生物自显影结果的影响Fig.1 The effect of spotting amount on bioautography由图 1 可见 当点样量为 1 2 l 时 只出现单一抑菌斑 点样量为 3 4 l 时 分离效果好 可分为3 个清晰的部分2.3 贴板时间的确定将展开后的硅胶板贴于含菌的琼脂培养基上 贴板时间分别为 5 10 15 20min 取下硅胶板 于 37培养箱中培养 待出现抑菌斑时即可观察
18、不同贴板时间的分离状况对图 2 进行分析可知 当贴板时间为 10min 时 所得的抑菌斑色谱图最清晰 这是因为压板时间过短 硅胶板上的抑菌成分来不及扩散 致使抑菌斑不显著 压板时间过长 板上硅胶充分润湿 部分硅胶脱落 影响生物自显影效果2.4 培养时间的确定用 200mg/ml 提取物丙酮溶液点样 点样量 3 l 乙酸乙酯展开 贴板 10min 37 分别培养 10 15 20h观察抑菌斑直径的变化层析板经过不同培养时间后抑菌状况见图 3 分别测量抑菌斑 C 的直径 见表 2 结果表明 当培养时间为 10h 即刚刚出现清晰的抑菌斑时 抑菌斑 C 直径最大且提取物可以明显的分为 3 个部分 培养
19、时间过长菌体生长 抑菌圈逐渐缩小 直至消失培养时间 (h) 10 15 20直径 (mm) 10.04 0.55 6.10 0.74 无明显斑点表 2 不同培养时间下抑菌斑 C 的直径Table 2 The diameter of bacteriostatic spot C on differentculturing time2.5 生物自显影展开剂的选择2.5.1 一元溶剂生物自显影现象比较一元溶剂对荸荠英粗提物的分离效果见图 4 所示低极性溶剂石油醚 氯仿不能把组分分开 活性斑点只有一个且停留在原点上 中等极性有机溶剂乙酸乙酯 正丁醇 异丙醇的分离效果较好 丙酮虽然也可以得到 2 个抑菌斑
20、 但二者相距较近 分离效果不明显 强极性溶剂乙醇 甲醇只得到一个抑菌斑 这是由于极性过强 对其中的成分有较强的拖动力 致使抑菌斑集中 以上八种有机溶剂生物自显影的斑点数及R f 列于表 32.5.2 二元溶剂生物自显影现象比较根据一元溶剂的展开结果 进行二元溶剂的配比展开实验 采用氯仿 : 甲醇 =8.5:1.5 9:1 氯仿 : 丙酮 =8:2 氯仿 : 乙酸乙酯 =1:9 乙酸乙酯 : 异丙醇 =9:1 硅胶板图 2 贴板时间对生物自显影结果的影响Fig.2 The effect of pasting time on bioautography15min 10min 20min图 3 培养
21、时间对生物自显影结果的影响Fig.3 The effect of culturing time on bioautography10h 15h 20h81基础研究 食品科学 2005, Vol. 26, No. 7溶剂 斑点数 R f 值石油醚 1 0.00 0.00氯仿 1 0.00 0.00乙酸乙酯 0.51 0.01 0.00 0.00丙酮 2 0.79 0.02 0.51 0.03异丙醇 2 0.51 0.01 0.10 0.01正丁醇 2 0.51 0.03 0.09 0.00乙醇 1 0.35 0.02甲醇 1 0.44 0.02表 3 一元溶剂生物自显影所得斑点数及 R f 值T
22、able 3 The spots unmber and R f of single-solventbioautography层析生物自显影 结果见表 4 其中分离效果较好的溶剂是氯仿 : 甲醇 =8.5:1.5 和氯仿 : 甲醇 =9:1 分别将荸荠英粗提物乙酸乙酯部分分为 6 和 4 个活性组分 ( 见图 5)溶剂 比例 斑点数 R f 值氯仿 : 甲醇 8.5:1.5 6 0.97, 0.88, 0.74, 0.63, 0.22, 0.02氯仿 : 甲醇 8:2 5 0.65, 0.57, 0.48, 0.33 0.10氯仿 : 丙酮 7:3 2 0.38, 0.17氯仿 : 乙酸乙酯 1
23、:9 3 0.60, 0.39, 0.00乙酸乙酯 : 异丙醇 9:1 2 0.75, 0.48表 4 二元溶剂生物自显影试验结果Table 4 The result of duality-solvents bioautography运用生物自显影技术对抑菌活性成分进行跟踪 通过进一步的分离纯化 经结构签定初步确定其主要的抑菌活性成分为一种甾醇类物质 对该物质进行小鼠表皮及体内抑菌实验 均取得了明显的功效在生物自显影技术应用过程中 指示菌的选择非常重要 荸荠英提取物对枯草芽孢杆菌的抑制效果良好并且枯草芽孢杆菌生长速度快 30 培养 16 17h 即可观察结果 此外枯草芽孢杆菌对人体的危害也不大
24、 因此本研究采用枯草芽孢杆菌作为指示菌薄层分离是被分离物质即样品 吸附剂及展开剂共同作用的结果 因此选择与样品及吸附剂相匹配的展开剂是分离效果好坏的关键 展开剂的选择应尽可能从以下几个方面考虑 毒性尽可能小 溶剂的粘度不宜过高 沸点适中本研究所用的荸荠英粗提物活性组分的定性方法只有活性组分才能产生抑菌斑 测定结果不受杂质的影响 具有方法简单快速 灵敏度高 培养周期短 成本低廉等优点3 结 论以硅胶板层析为基础 以枯草芽孢杆菌为指示菌的生物自显影法检测条件为 荸荠英粗品提取物浓度200mg/ml 点样量为 3 4 l 贴板 10min 37 培养10h 即可得到清晰的抑菌斑色谱图 生物自显影展开
25、剂氯仿 : 甲醇 =8.5:1.5 时展开效果最好 荸荠英粗提物可以被分开为 6 个活性组分 说明该提取物中至少存在 6 种成分具有抑菌活性参考文献1 中药大辞典 M. 上海 : 上海科学技术出版社 , 1986.2 张绪敏 . 抗菌素微生物效价测定法 M. 人民卫生出版社 ,1963. 1-109.3 张文治 , 等 . 实用食品微生物学 M. 轻工业出版社 , 1991.4 程丽娟 , 唐明 , 袁静 , 等 . 微生物学实验技术 M. 科学技术出版社 , 1993. 57.( )乙酸乙酮 正西醇 石油醚 氯仿图 4 一元溶剂生物自显影现象比较Fig.4 Comparison between different single-solvents丙酮 异丙醇 乙醇 甲醇(II)图 5 二元溶剂生物自显影现象比较Fig.5 Comparison between different duality-solvents3.5:1.5 8:2 7:3 1:9 9:1
