1、， 一Z 1 cD3E胞浆区 亡信 CD3e胞浆区Tyr突变阻断下游的细胞凋亡信号传递 。 2，f 何亦平刘彦信肖声刘士廉郑德先 医科 医学所中国协和医科大学基础医学院医学分子生物学国家重点实验室，北京1(xo5) 中国图书分类号R39212 摘要目的：利用稳定表达CDSe融合分子的细胞凋亡模型，研究其cD3E一1TAM中两个酪螽酸的突变对细胞凋亡信号传 递及相关基因表达的影响。方法：将稳定表达CDSe融台分子及其3种突变分子的T淋巴细胞分别用抗CD8单抗刺激后，检测 4种细胞蛋白酩氨酸磷酸化和胞浆Ca：浓度的变化以及细胞揭亡相关基因表达。结果：抗体刺激后，表达cD8E的细胞与表达 其3种突变
2、分子的细胞相比，其蛋白磷酸化增加胞浆Ca2 浓度升高；立早基因nut77和细胞两亡基因 表达水平升高。 结论：首次发现CD3E-ITAM中两个酩氨酸的突变阻 了CD3介导的凋亡信号传导选径，并影响nut77和 基因的表达： 关键词 细胞揭亡信号酪氨酸突变 CD3e分子 Mutation of tyrosines in the cytoplasmic domain of CD3blocks the apoptotic sig- haling pathway ofT lymphocytes HE Yi- ， u Yah-Xin，YdAO Sheng et Ntiorml Lohoratories
3、ofMedicalMolecularBiology，Chinese AcMemy 0， Medical&ieneesPeking UnionMedical College，Belting 1(30005 Abmct Objective：To study the effect of the mutation of two tymsiin CD3e-ITAM on apoptofic sialing pathway by us 【lg the cell ites staby exoread cD8E chJroeramolecule armitsmutants -黜；珊sto Ph衄 衄a esi
4、n CD3eIT：UI asmodels Methods：The cells we sfimated with antiCD8 monoclonal antibcdy and the prtcln phesphclafionanalyzed by“resternblotoonoP3alJon of analyzed by flow c)cmetry and nut77 and fns genepressiom determined by Northern-blot and RT-PCR respectivelyResults：h w showed that m pm tein plsphory
5、lati,)ns andintraceular concenlatlons ofC we坤increasednr77 andfas ne expressions upregulateainthe ceils with啦【一 pression of CD8E ，but r in the。db with the expression of CD8nmtms C碱d 蚰：h was found at the first time that mutation of any o1e 0f the two tyrosines in CD3elTAM blocks the apoptotic sgmlJng
6、 pathway mediated by CIY3molecule Keywords Cell apoptotlc signaling Mutatlon of t；：nroslnes CD3E m ule T淋巴细胞抗原受体(TCR)与CD3分子各亚单 位(CD37、8、E和)形成稳定的复台物，传递外界抗 原刺激信号，引起细胞的激活或凋亡。T细胞激活 和凋亡信号的传递主要是通过CD3E和CD3E两个 亚单位传递的，CD3和CD3胞浆区含有保守的免 疫受体酪氨酸激活基序(irranune receptor tTosine based activation motif，即Y(L(X)YKL17_8
7、，简称为 ITMTI)，TCRCD3的刺激信号使ITMTI中的酪氨酸快 速磷酸化，其下游的蛋白酪氨酸激酶(PTKs)，如 ZAP70、Lck和Fyn等与酪氨酸结合而活化，从而诱 导一系列胞内生化事件，如相关蛋白的磷酸化、胞浆 cd 浓度升高、Ras GTP积累、转录因子活化等，最 国家自然科学基盘(批准号39470160)，卫生部基盘(94一l-。I7)和中 国医学科学院基盘(93l008) 作者苘彳卜：何亦平，男，25岁，硕士、主要研究细胞凋亡信号传递； 指导教师，郑德先男，教授，博士生导师主要研究生物化 学和分子生物学 终激活一系列基因表达，使T细胞激活 本实验室以往的研究中，构建r CD
8、8ct胞外区、 跨膜区和CD3E胞浆区(含ITAM)的融合基围 (CD8E)，并转染CD8阴性的Jurkat细胞，经G418筛 选获得了稳定表达CD8E的细胞株(命名为 JK)， 用抗CD8单抗刺激能诱导TJK细胞凋亡 。将此 融合基因胞浆区1TAM中两个酪氨酸分别突变或同 时突变为苯丙氨酸的cD8E(Y170F)、cD8E(YI81F)和 cD8E(YI70FYI8IF)分别转染Jurkat T细胞，获得稳 定表达的各细胞株分别命名为T1JK、12JK和B JK。在同样条件下，抗CD8单抗刺激不能引起 JK、T2-JK和33JK细胞凋亡 。j。此结果表明 CD3dTAM中的两个酪氨酸不仅在介
9、导细胞激活中， 而且在介导细胞凋亡中均起必不可少的作用。但 cD3E介导的T细胞凋亡的信号传递途径仍不明了， 本文进一步探讨了CD3elTMI中两个酪氨酸位点的 突变对下游细胞凋亡信号的影响 维普资讯 http:/ l材料与方法 三 ； 11蛋白酪氨酸磷酸化的检钡4 本实验室已经构 建的野生型CD8s、突变型CD8s(YI70F)、CD8s (YI81F)和CD8s(Y170FY181F)融合基因转染CD8一 Jurkat细胞后，所获得的4株稳定表达上述融合蛋白 的细胞株分别命名为T_JI(、T1jK、他一JK和 jK 。 取1 xlo细胞，用PBS洗1次，离心弃上清，细胞悬 浮于100 l含
10、20 f m1抗CD8单抗并已预热至 37的PBS中，细胞刺激3mln后，加人】lTll预冷的 PBS终止刺激。同时设不经抗体刺激的阴性对照。 离心收集细胞，按常规方法裂解细胞，总蛋白经 SDSPAGE电泳分离，转印至Nc膜，用抗磷酸化酪 氨酸( )单抗(PY20)进行Western蛋白免疫印迹， 用碱性磷酸酶显色系统(BM公司)显色。 t2胞浆C 浓度的检测 l x l 细胞用Hanks 平衡盐水(HBSS)洗2次，再将细胞悬浮于l ml FIB ss，加入5 l C 探针nu03，AM(Molecular Probes公 司，1 rmnol溶于DMSO)，使终浓度为5,mnolL，于 37
11、保温3060 mill。 ss洗l状，细胞再悬浮于 HBSS中。先不加抗体，以流式细胞仪分析胞浆 ca2 浓度。然后加含抗CD8单抗的PBS(抗体终 浓度为20gm1)，刺激细胞l min，立即用流式细胞 仪分析c 浓度的变化。 13 nut77基因表达的检测将5l 各转染细 胞不经抗体刺激或于150 srra抗CD8单抗包被过 的培养皿中刺激l、2和4 h后，离心收集细胞并提 取总RNA，进行甲醛凝胶电泳后。按常规方法转至 NC膜。以nur77 cDNA片段为模板，随机引物法标 记操针。65 预杂交液(025 mol Na2HPO4，pH74， 7SDS)中杂交30 min。加入标记好的探针
12、杂交过 夜。然后按常规进行洗膜。x光片曝光，洗片和观察 杂交结果。 14 fas基因表达的检测5 x l 转染细胞不经抗 体刺激或于150 ；，m1抗CD8单抗包被过的培养皿 中刺激4 h，离心收集细胞，用一步法提取总RNA。 按下述方法进行RT-PCR反应：总RNA 3 (8 )， Oligo(dT)25 l和ddH2040 l，混匀，离心。于95 加热23 win后取出，缓慢冷却至室温。加入1O RNasin(50单位)、25 vl 10x逆转录反应缓冲液、 2 5 10dNTP、25 wl BSA(1 I 盯d)和20 MMLV逆转录酶(Biolab，100单位)，置37 水浴反应 15
13、 h。接着进行PCR反应， 的引物为： 中国免艘学杂志1999年第15崔 GAPDH：P1：5 一CCATCACCA 0 GeA03 P2：5 一CC rIACCACCITCTIG一3 PCR的条件为：25 10 x PCR缓冲液、15 l 、25 l DMS0、10 l PI、10 P2、30出逆转 录产物、加双蒸水至总体积250 94变性4 m ，加人03出Taq酶，以50O出矿物油覆盖。按 94T：变性40 s、58退火l min、72延伸40 s的条 件，进行3O个循环反应。同时以3一磷酸甘油醛脱氢 酶(GAPDH)eDNA引物进行PcR，作为内对照。 2结果 21 4株转染细胞内蛋白
14、酪氨酸的磷酸化如图l 所示，4株转染细胞经抗CD8单抗刺激后，蛋白质酪 氨酸磷酸化增加，但T_jK细胞的磷酸化蛋白的种类 和强度都高于3株表达CD8突变体的细胞。在T1一 JK和T2JK细胞中，其ITMI中的一个酪氨酸突变 即可影响蛋白质的酪氨酸磷酸化。但在未受抗体刺 激时，T1jK和12jK细胞与野生型T JK细胞相比， 各有一种蛋白质发生显著的酪氨酸磷酸化，提示两 个酪氨酸可能有不完全相同的功能。 22 4株转染细胞内ca2 浓度的变化将4株转 染细胞先经ca2 探针Fluo-3AM处理，再用抗CD8 单抗刺激l vain，以流式细胞仪测定抗体刺激前后细 胞的荧光强度表示胞浆口 浓度的变化
15、。结果如 97 66 46 30 图l抗c蛳单抗刺激前后4株转染细胞内蛋白质酪氨酸 磷酸化的分析结果 F 1 Protein砷mph0ryl 0n in trmlectants stmmated with mti-cD8 roAb Note：1，35 mad 7T-JK，T1一JK，T2-JK atldT3一JK cellswithout hh Slim ulatoa2，4，6 and 8T-JKn-JKT2-JK and“13一JK celIs stinmlat td thb 维普资讯 http:/ CI 胞浆区 E ! 二 FLl 国2各转染细胞抗体刺激前【_-)后(1胞浆( 浓度变化 啦
16、2 Ccmgralioo ofintraceUular ca： inthelransfectalltsdlnulatedwith(一)and without()antia J b Note：ABC and DT-JKT1JK，T2-JK and T3一JK cellsivey 28 S nu一7 l8 S l 2 j 4 5 6 7 82 16 吕! 图3抗体刺激后各转染细胞中hurT7基因的表达 Fig3 hurT7 gene expression山transfectaals stimulated with Ab Note：14589-12 and I316 JK，T1一JK，T2-JK s
17、ad 13一JK ceils stiumat ed rIIiCD8 T for012 and4 h i 图2所示，抗体刺激后，只有T-JK细胞胞浆( 浓 度迅速升高，B JK细胞没有变化，表明cD8E的 rrAM中两个酪氨酸同时突变，阻断了抗体刺激信号 引起的Ca2 浓度变化。但有趣的是，在只有一个酪 622 bp 527 bp |l hD 国4抗体刺激各转染细胞中fasmRNA的表达 F 4 fasmRNA expression hi Uransfectalals slinmlated tb and wiflxutAb Nce：T-JKTI-JK，T2-JK sad 1“3一JK 4 cel
18、l lines reectivety 氨酸突变的T1JK和他 JK细胞中，胞浆ca2 浓度 略有下降，提示这两个酪氨酸的信号传递功能并 完全相同，也不是二者功能的简单叠加。 23 4株转染细胞内nut77基因的表达 0nhem 印迹的结果如图3所示，未受抗CD8抗体刺激韵4 株转染细胞均无nu订7 mFLNA表达。抗体刺激1 h 后，1 倦细胞中即有nut77 mRNA高表达；刺激2 h 后nur77mRNA的表达量达到最高；刺激4 h后仍能 检测到nut77 raRNA。其余3株表达a)8E突变体构 细胞在抗体刺激后，nut77 mRNA的表达均没有明显 升高，提示CD8E的ITAM中酪氪酸
19、的突变可阻断抗 维普资讯 http:/ 体的刺激信号 24 4株转染细胞内 基因的表达4株转染细 胞用150 ug“I抗CD8单抗刺激4 h后，提取 IL“qA 并进行RTPCR和琼脂糖电泳。用GAPDH怍内对 照，检测4株转染细胞内fas基因的表达，结果如图 4所示 在不受刺激的情况下，各转染细胞都有很 微弱的fas mRNA表达。但在抗体刺激后，只有TJK 细胞的fas mRNA的表达量显著增高，其余3株转染 细胞的fas mRNA表达量均无明显变化。提示CD8e 的1TAM中，两个酪氨酸中的任何一个发生突变，均 可阻断细胞凋亡信号的传递，以及凋亡信号引起的 下游凋亡基因 的表达 3讨论
20、nut77是属于核甾醇类受体家族的转录因子，它 能够以单体或与其它因子结合的形式而发挥作用。 在不同类型的细胞中，nur77能被不同信号所诱导而 使细胞产生不同的效应“ 。nur77也在细胞凋亡中 起作用，但不同信号诱导表达的nut77 mINA的结构 不同，全长nur77 mRNA可使细胞凋亡，而缺少 v (A) 的mRNA则可调节细胞激活 。用减法杂交 和反义RNA的方法，Woronicz等发现，TCPdCD3诱导 的细胞捅亡依赖于立早基因nur77的表达，诱导细 胞激活或凋亡的信号都能作用于nur77启动子上游 的不同区域而激活nur77基因表达 。 。本研究结 果表明，在TCRCD3诱
21、导的细胞凋亡过程中，蛋白 质的酪氨酸磷酸化、细胞内c 浓度的升高、nur77 的表达与CI)3e1TAM中两个酪氨酸位点的完整性是 密切相关的。Woronicz的实验也表明，抗CD3单抗 诱导的高浓度的ca2 信号能诱导高水平nur77表 达 ，这与本实验的结果是一致的 缸是最重要的细胞捅亡基因之一。在未成熟 胸腺细胞凋亡中，缸的表达并非必不可少，但激活 T细胞、T细胞杂交瘤和肿瘤细胞的细胞凋亡都是 通过 及其配体FasL相互作用的途径而实现的 对k基因在细胞凋亡中的表达调控目前还鲜有报 道，在捅亡中，转录因子nur77所调节的靶基因尚未 中国免疫学杂志1999年第15卷 确定，但Ju等认为n
22、ut77可能上调FasL的表达 。 本研究的实验结果进一步证实nut77是TCRCD3介 导的凋亡信号和细胞凋亡相关基因表达的桥梁。而 且，实验结果也表明，在 JK细胞中，nut77可能有 上调缸基因表达的作用 考虑到 与FasL相互 作用非常密切，二者的表达受到相同转录因子的调 节也是可能的。 本文首次证明CI)3e一1TAM中任何一个酪氨酸突 变或两个酪氨酸同时突变都阻断捅亡信号传递而抑 翩T淋巴细胞凋亡。只有在完整的1TAM存在的情 况下，才能诱导高水平的nur77基因表达，fas mRNA 的表达水平也随之增加。CI)3e既能传递细胞激活 的信号，又能传递细胞凋亡的信号，表明其上游信号
23、 是共同的，而nut77可能是调节细胞激活和凋亡的 关键基因。nur77基因表达和 与FasL表达调控 机制的研究将有助于揭示细胞激活和捅亡调控过程 的分子机制。 4参考文献 1 Weiss AT cell antigen 。ep【 日ig treaw,ducfion：atale tails c 0ph c protein tyrosine knases,el11993173：209 2郑德先鄂勇Tethomt C“at CDSa和CD3e的融合分子卉导T 淋巴细胞罚亡科学通报，1997；42(1)：84 3何亦平刘彦信，郜勇“a1CD3e胞浆医两个醋氨酸其同舟导 T淋巴细胞捅亡科学通报199
24、8 43(】2)：1299 4 H TG，NathD，Lau L F d A geneinducible by n】m曲 fac【o eodes mb the steroid and山 d hTe l1T pe由 lyProc Nail Acad Scl USA1988 85：8444 5 Liu Z GSmith S WMtd皿gM K A d Ai：optotk s delivered tI】 the Y-cdl a T-oell hybrid requiretheinmzediatly gene nut77 Nartlre1994；367：291 6“,komnez J DI _itEalnan B J Regulatim ofthe Nut77 s,emid把魄 叫in aetlvafiinduced apoptosisMol Cell Bio11995；】 064 7 Ju sT，P日mhD J，CuiH et Fl田(C095)FasLinteraction5 reqmred p n cell death after T-oell aeliation Nature1995；373： 【收稿1997-09-06修回1998-02-05 (编辑张慧) 维普资讯 http:/
