1、丁酸钠对大肠癌 HT-29 细胞形态及其生长曲线的影响现代肿瘤医学 2005 年 10 月第 13 卷第 5 期丁酸钠对大肠癌 HT 一 29 细胞形态及其生长曲线的影响李铁军,刘成霞,张静,黄丽华,王兵,张孝卫,张尚忠?595?【摘要】目的观察体外培养的 HT 一 29 细胞在丁酸钠作用后形态学及生长曲线的变化.初步探讨丁酸钠对结肠癌细胞的凋亡诱导作用.方法利用相差显微镜,可变投射显微镜,电镜观察细胞形态学变化,M1Tr法检测 HT 一 29 细胞生长情况.结果丁酸钠作用后的 HT 一 29 细胞形态发生改变,表现为细胞体积变小,形状变圆,细胞核固缩,脱壁细胞逐渐增多,细胞膜突起减少,核内染
2、色质呈团块状积聚于核膜下,并可见凋亡小体.丁酸钠 2.5,5 和 10mM 对 HT 一 29 细胞生长均有抑制作用,并呈浓度,时间依赖性.结论细胞形态学的变化初步显示了丁酸钠对结肠癌细胞具有凋亡诱导作用.【关键词】丁酸钠;HT 一 29 细胞;形态学;M1rr 法; 凋亡;生长曲线【中图分类号】R7334【文献标识码】A【文章编号 】16724992 一(2005)0559504EffectofsodiumbutyrateonconfiguritionandgrowthcurveofHT 一 29cells.LITiejunILIUChengxia.ZHANGJing.eta1.JinanI
3、nstituteofMedicalScience.jinan250013.China.【Abstract】ObjectiveObservingthechangeofcortfiguritionandgrowthcurveofHT 一29cellstreatedwithsodiumbutyrateandtheeffectofsodiumbutyrateoninductionofapoptosisincolonicneoplasmcells.MethodsCellswereobservedbyPCM.BVPM.EM.MTYexaminethegrowthofHT 一29cells.ResultsC
4、onfiguritionofHT 一 29cellswerechangedaftertreatmentwithsodiumbutyrate.Thecellsbecamesmaller-shapeofcellsrounderandpykno-sis,sheddingcellsincreasedgradually.Thenumberofprotrusionofcellmembranedecreased.Chromatinaccumulateunderthenuclearenvelope.ApoptosisbodiesappearedalsobyEM.2.5,5and10raMsodiumbutyr
5、ateallcancausegrowthinhibition.Theeffectsweretimeanddosedependent.ConclusionSodiumbutyratehaveaneffectoninductionofapoptosisincolonicneoplasmcells.【Keywords】 sodiumbutyrate;HT-29:conflgufition;MTY;apoptosis;growthcurve(ModemOncology2005.13(5):595598)大肠癌是我国常见的恶性肿瘤,严重威胁着人类的健康,其发病率呈逐年上升趋势.国内外都在试图寻找有效的预
6、防和治疗方法.有报道丁酸盐可以抑制 DNA 合成,并通过多种途径诱导多种肿瘤细胞凋亡“.国内谭晓华曾做过丁酸钠诱导结肠癌 HT 一 29 细胞凋亡实验,但只是初步的观察.本文利用相差显微镜,可变投射显微镜,电镜观察了体外培养的 HT 一 29 细胞在丁酸钠作用后形态学改变.M1Tr法检测了 HT 一 29 细胞生长情况,绘制了细胞生长曲线.现将结果报告如下.1 材料与方法1.1 结肠癌 HT-29 细胞株,人胚肾 293 细胞株购自山东省医学科学院.1.2 实验试剂,药品丁酸钠(Sigma)用 0.1MPBS 配制成 0.2mol/L 的储存液(pH=7.2),4 保存备用.四甲基偶氮唑蓝(M
7、1Tr)(Sig.ma).1.3 主要仪器【收稿日期】【修回日期】【作者单位】【作者简介】200502062oo5 一 O2 一 l6济南市医学科学研究所,山东济南 250013山东大学齐鲁医院,山东济南 250013李铁军(1969 一), 男,山东济南人,主管技师,主要从事肿瘤治疗的研究工作.CO 孵箱( 日本三洋产品);酶标仪(MULTISKAN 产品);超净工作台(北京半导体设备一厂);倒置相差显微镜(Olym.pus,日本);可变投射显微镜(BVPM 一 15 型,美国 BD 生物公司生产);扫描,投射电镜( 日本 JEOL 公司).1.4 细胞培养结肠癌 HT 一 29 细胞常规培
8、养于含 10%小牛血清的 RP.MI1640 培养液中,在 37C,5%的 CO 培养箱中培养.每日观察活细胞的形态,数量,培养液颜色和透明度.实验组分别为丁酸钠 1.25,2.5,5 和 lOmmol/L 浓度组.以人胚肾 293细胞作对照.应用计算机细胞周期分析软件计算出各时相分布的百分比.l5 普通相差显微镜观察观察培养过程中细胞的形态,数量,培养液颜色和透明度,以及细胞的附着,贴壁,伸展,移动,有丝分裂等活动.1.6 可变投射显微镜观察取常规培养的处于对数生长期的 HT 一 29 细胞,用 0.25%的胰蛋白酶消化,用含 10%小牛血清的 RPMI1640 培养液制成单细胞悬液,调整细
9、胞密度为 510/ml.将细胞接种到预先放置盖玻片的培养皿中,每皿接种 6ml.置培养箱中 3 天,待细胞接近长成单层,更换培养液,加人丁酸钠,使终浓度为 5mmol/L,对照组加人等量的 PBS.24 小时后,终止培养.BVPM 观察 HT 一 29 细胞的生长状态,细胞形态,细胞膜运动及细胞贴壁过程.并随机计数 15 个视野,计算每个视野内的平均细胞数,观察对照组和丁酸钠处理组 0h 和MODEl!【JlV_ll1lNO,5212 人胚肾 293 细胞l_常 f 凡胚忤 2o3 钏咆霉或形,K 纳 57 戈J 满培谇帆底 .计胞出脱齿化亡.川把小 M 浓慢丁钠f1Hj:IllJ 术 293
10、 圳胞肜数匠他22 可变投射显微镜观察221 丁酸钠对 II129 细胞生长状态的影响常培诈24hII129I 盯乜一懿杜,l|K,圳肥拼求堙摆成片.细眦靴转凡多虬一 IN(1tl 地 l 成 ffcJ 太卦眦艇咆.幢昭或lI.胞 k 小怒琳.1 处于 抒裂 I 钏 l 眦地棱寥忙施恺袅垭出 i 旧牛物学壮盘T 艘触 5Mfi:JII24h 野 lI 胞数叫! 少(I)flit 世小髓细 J 飚乳 10 一之细胞稀疏,世川孵 K 小曲于融,氍qL-r,刮控孵胞 r1 月药前 IFI 胞十视的胞n,t(0I1.竹计学j 月后胞自目细胞较iOh1m.P舾,f24 mP0iJJ222 丁酸钠对 H1
11、2 细胞形态的嚣晌常吼坫养 24寮,IT29 删胞博人浆比删 JJ,糟舒荆胞蠢删棱浆 1L 圳倒胞性 JB 挑小,核 f.馋内染也陋|寓齄于俊肫司 IT 嘴钠 5【l-M 川 24-H1 脱栈 il.I 谁包咂块状韶卅此脚低II 州 胞形态,2 培养 HI29 川胞脱流慢.钏胞 r,定|;十胞 rJ20 一 1,胞定越.措状球壮或规则嘭 ur 仙肜拒政也坐噼目 fll29fjj 女械+宙.:十#0 目目目 zfn2g(惜视野 JI-m5mM 作 m胞自呈.琨 r 自盹薰脱 f“埔23 电镜观察2.3.I 扫描电镜一 ttIrI29PI+I 胞 K 梭肜或粪细胞饱满,f;南的微纨巴.南川胞川连接
12、紧衔.3,4.5Mj 脯钠.JlJ 小川 iT.t 川 It,圳啦是 n徽绒毛址捷挑少缄 ff1 尖 .仆裁 I-球样崔 .细胞 f.件封 ff 小.挪分恤孵洲 I 小博 l52.3.2 透射电镜观察十羹 f.,1_童【J也昕fj 讣泌粘.8剖 6l 辱 I7新 III29胞俄尢,I?J 多十也浆 l?0 战札体内质网健钠川 l.圳抛 I皇州缩.棱氍觇I 目 3 电托 1jsI时 IIr2i 胞芏氍援彤或姜阿彤,细抱饱满.表面丰富的激帆毛围 5 电托45)Mr 祷钠作?14.I 后 i2q 如胞,知胞目辅.氧西微城毛明显直少.近干 l 置.出现轻鹰球弹屯则.泼 J 弛胀.性 I常染包质.-1
13、块状聚集.仲染乜质边壤.部分荆胞分泌牲.池群世化,州融边 l 凋 T:小1 丰.924M 丌试验检测细胞活力鳢制生长曲线实啦结姓小,I25mM 丁陂钠浓地计 II1一 29 圳胞兀州的 LK抑制 f1?川【P【】05)r 敬钠 25510mlljHT29 细忸 l 乇均仃抑制 nJIJ.J|ll 敞也,【问怅确:表 3 再厂酸悄-f 站肠蜘 I一 29 细胞(1l】影 10 为小 lJ 敞地J 艘钠埘 lIT29 圳胞 L【tI111 缱影.剪 4 电忙4_)寸 I 扭【1i 知甩饕 l.钿咆地表面有三富的越城毛訇 6 电钝 x3205mM 丁踺钠 48 小时后 IIT29细胞.细臆目垴表面微
14、械毛走.出现明显球样盘调亡?J, 悼初步形成图 7 电境4,5mM 丁畦钠作f】71 小时后 Irl29细胞.细孢固缔.表面擞绒毛消是.出现叫显球样奄,可见较围 8 电境 5)站骑墙HT 一细胞一胞插托 t 可见多括#?枉多的拥亡小悼膜规则? 胞策可见丰富的线柱俸 ,内质问和分址颗粒598表 3 丁酸钠对结肠癌 Irl29 细胞【)i1 值的影响 c.一 8注奋浓度姐夸与时烈虹招匕 P(n丧 4 址.各敞度 J峨鼬卦 1 作川于 293 细胞帕 OD 值并非废,忤时问点比较,无统汁学=提州丁酸钠刈肾 293 缃_鼬 l 吣硅的 gtM0JPIJ11.1Jhf4-:同浓度】嚏钠时人忏 293 细
15、胞,:KflI 线的影响表 4 丁酸钠对 293 细胞)121 值的影响 lT=5.n=8各浓度蛆问比较各时间最比较.P005,屯统计学差异图 95mM 丁酸钟作 m48h 詹 1I129 抱膻挂明显固埔.桎内常禁邑庸呈团块聚集异染色质迪聚.抑胞周造见凋亡 1 忙 x5000.鼠 8r1釜:薹 0.80.2匡篓:= 二 7!O-一时闻(h)图 11 显示同采度丁酶抽对人胚肾 293 蛔胞主长曲线的影响M(f1)l:lN).【lI(;YI)I2005.V(I3.Nt53 讨论1陵钠人类耋占肠中细落 l 发酵碳嗽化合物产叶.m 一币 1r4娥短链脂酸 flI_J 钠盐=研究发现.J 瞍钠州体外蜥养
16、肿哺乳动物绑胞系朽多种生物学功能,如抑制转 fl:l 胞的特征性表型,诱导计多肿删细胞系分化特 fJ:地滞胞刷捌于(.illG 以及皤导细胞凋亡.色埘坫肠癌的济疗潜能越来越引起最视.肿鲫发 1 是细胞增扣 E 亡失衡 l 结果:_=l_lI 制 jllI!营绌啦长娃抗肿葫 l 物雨璺怍用机制之一:Hliij 主耍川 MT 丁宴骑观察扰肿临药物f 勺细胞生比抑制作用:乖研究 l.披 1_.rlJM 兀实验舭察 rJ 陵钠对结肠癌 liT 一29 细胞抑制作用.结果示,与对照纽帏 l 比,I25ram浓度组存各蜣察 It,iDI 妊均求 ,J)叶 H1一 29 细胞的抑制作用 25ram“J 浓度
17、组(2.5,5,10),fi-各时酬观察点(分别:加曲后【248 和 72h 观察)则示 m 明的生 r 乇抑制忤崩,备之间差异冉显酱性 tP(0.O1 丁酸钠对 HT 一 29纲胞的 乏抑制作用表现出浓度时 M 依赖性奉实验 Il_1 陡钠作用的 I 一 29 纳胞形态篮生改变,表现为细胞倬业小形态变.随若】酸钠浓世的增高技作用 i 时闸的延乇.脱细胞连渐增多经-叮变透射姥微镜观察剑 r 酸钠稍 lII)HT 一 29 细胞荆胞腆突起减少,日占堆过缓慢.核内染也 J 五目 1 块状聚集.帆聚于核噗描电和透肿电镜直接地H1 搦匀 lI 胞的特点.蛔圳胞固筘,细呲而儆龇毛,球圳胞核 I 封 ff
18、.核内常染色质固块状装集.件染色质出壤十 l 镶磷 f.行“见捌亡小体的形哦期 Ji 胆形忐学的变化步址r1 帔钠对结肠橱绑胞的州亡诱.ficJH.为世一步骑 J 酸讷牛 K 抑平促进搁亡作 J 足有蛐眦运扦,牛研究叶 1.f 体 fi9 几肾 293 细胞忭 r刊照 f 究.术发现 r 艘钠埘 293I 胞的 l:J=乇抑制 1 捌 l 匮廿件川之 J 睦钠自 E 够使 I1r 一 29 细胞形志学发乍变化,抑制肿痛削胞牛 K,r 诱导埔细胞州亡的 fiqlI【参考文献 l1JxiI.Wurill?.FEn,“Hltireapoptosisintibiacellsinduced1s,Mium
19、huiyralean,lilsmhaaismJ1.Zholtll-Yixt,-KxlJv 眦1Kueba(.2003.25,4J40l,4052lWilsll1AJ.Arango.MH,tasonJM.alTR3/Ntir77inh)nrercell“JIJl“Ih,2003,63f171:54015411.J3R,mmmeeM.hwdnS.SidmanEG“Butyleinducedt:I 一 2eelIalmpl(isismediatviathemitoehonddalpathwayJJ(Ju1.21103.52(11:94IO0I41houej.ShimkiKDhm,dswnHist-,
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