1、 收 稿 日 期 : 2005 - 01 - 13;修 回 日 期 : 2005 - 08 - 04通 讯 作 者 :樊 美 珍 , E - m ial: mzfanahau. edu. cn基 金 项 目 :国 家 自 然 科 学 基 金 面 上 项 目 (30570004)细 脚 拟 青 霉 不 同 菌 株 清 除 DPPH自 由 基 活 性 研 究李 春 如 ,宗 文 明 ,杨 成 ,胡 丰 林 ,樊 美 珍 ,李 增 智(安 徽 农 业 大 学 微 生 物 防 治 省 重 点 实 验 室 ,合 肥 230036)摘 要 :在 初 筛 基 础 上 选 择 不 同 地 理 来 源 的 10
2、株 细 脚 拟 青 霉 ,用 二 苯 基 苦 基 苯 肼 自 由 基 酶 标 仪 法 比 较 了 不 同 提 取 部 位 的DPPH自 由 基 清 除 率 。 结 果 表 明 在 所 有 供 试 菌 株 中 细 脚 拟 青 霉 的 两 个 菌 株 清 除 自 由 基 活 性 均 较 高 。 10株 细 脚 拟 青 霉 间 的清 除 自 由 基 活 性 少 数 相 似 ,多 数 差 异 显 著 ;发 酵 液 和 菌 丝 体 提 取 物 清 除 自 由 基 活 性 不 同 ;菌 丝 体 不 同 溶 剂 先 后 提 取 所 得 物清 除 率 也 不 同 ,其 中 氯 仿 提 后 甲 醇 提 取 物
3、无 论 提 取 量 ,还 是 活 性 均 较 高 , 5分 钟 时 的 清 除 率 最 少 也 有 6610% ( Pt02菌 株 ) ,最 高 是 Pt69菌 株 达 到 9315% , Pt57菌 株 的 清 除 率 为 9218% ;氯 仿 提 取 量 极 少 ,活 性 也 不 高 ;经 氯 仿 和 甲 醇 提 取 后 的 水 提物 ,得 率 只 有 甲 醇 的 一 半 左 右 ,而 活 性 与 氯 仿 提 取 物 相 当 ,在 14111% 4513%之 间 。关 键 词 :虫 草 ;细 脚 拟 青 霉 ;提 取 物 ; DPPH;自 由 基 清 除 率中 图 分 类 号 : Q936
4、 文 献 标 识 码 : A 文 章 编 号 : 1008 - 9632 (2006) 02 - 0028 - 04自 由 基 与 人 体 健 康 关 系 密 切 , DPPH法 是 自 由 基 检测 的 常 用 方 法 之 一 ,具 有 快 速 、 简 便 、 经 济 等 优 点 ,特 别是 容 易 实 现 高 通 量 筛 选 。 国 内 外 应 用 此 法 进 行 了 不 同来 源 物 质 的 清 除 自 由 基 活 性 的 研 究 ,与 此 相 关 的 著 作也 不 少 见 1 6 。细 脚 拟 青 霉 Paecilom yces tenuipes ( Peck) Sam son是一 种
5、 常 见 的 昆 虫 病 原 真 菌 ,分 布 于 世 界 各 地 ,其 有 性 型被 报 道 为 高 雄 山 虫 草 Cordyceps takaom ontana Yakushijiet Kumazawa 7 , 但 少 见 。 在 日 本 和 韩 国 , 该 菌 常 以Isaria japonica Yasuda名 称 出 现 ,并 开 发 成 了 保 健 食 品 ,现 在 两 国 的 多 数 学 者 也 接 受 前 者 为 细 脚 拟 青 霉 的 同 物异 名 8 。 国 内 外 的 研 究 主 要 集 中 于 成 分 ,如 从 孢 梗 束(一 些 原 文 献 中 用 的 是 frui
6、ting body)或 菌 丝 体 中 分 离得 到 了 4 - beta acetoxyscirpendio1 ( 4 - ASD )、 Te2nuipesine A和 B (新 螺 旋 结 构 的 单 端 孢 霉 烯 ,具 有 促 神经 生 长 作 用 ) 9, 10 ;药 理 作 用 方 面 的 研 究 表 明 细 脚 拟 青霉 具 有 抗 癌 11 、 抗 氧 化 12 、 抗 菌 13 和 免 疫 刺 激 作用 11, 12 ,涉 及 到 抗 氧 化 方 面 的 文 献 很 少 12, 14 。 本 文 在初 筛 的 基 础 上 ,应 用 二 苯 基 苦 基 苯 肼 自 由 基 酶
7、标 仪 法对 不 同 来 源 的 10株 细 脚 拟 青 霉 的 清 除 自 由 基 活 性 进行 了 比 较 研 究 。1 材 料 与 方 法111 材 料11111 供 试 菌 株19株 虫 草 无 性 型 及 其 相 关 真 菌 菌 种 ,隶 属 于 被 毛孢 属 、 拟 青 霉 属 、 白 僵 菌 属 等 ,见 表 1。RCEF0206、 RCEF0209、 RCEF0216、 RCEF0432、RCEF0440、 RCEF0553、 RCEF0788、 RCEF0969、 RCEF1086和 RCEF1270,由 安 徽 农 业 大 学 虫 生 菌 研 究 中 心 提供 ,分 别 与
8、 文 中 p t02、 05、 12、 18、 25、 36、 57、 65、 69和 73相 对 应 。11112 培 养 基斜 面 培 养 基 ( SDAY) :葡 萄 糖 4% ,蛋 白 胨 1% ,酵母 浸 膏 1% ,琼 脂 2%。摇 瓶 培 养 基 ( SDY) :葡 萄 糖 4% ,蛋 白 胨 1% ,酵 母浸 膏 1%。复 筛 摇 瓶 培 养 基 : 3%葡 萄 糖 , 1%蛋 白 胨 , 1%酵 母浸 膏 , pH6。11113 主 要 仪 器Spectra Max M2酶 标 仪 , 6010紫 外 /可 见 分 光 光 度计 , Freeze D ry System s,
9、 Labconco Freezonel2冻 干 机 , HZQ- F160全 温 振 荡 培 养 箱 , TUMEN TL - 15高 速 离 心 机 。11114 试 剂2, 2 - D iphenyl - l - Picrylhydrazyl (DPPH ) ( Sigma- A ldrich公 司 ,美 国 ) ,其 余 国 产 分 析 纯 。112 方 法11211 接 种 与 培 养准 备 活 化 斜 面 菌 种 2 支 ,培 养 3 d。 点 接 种 于SDAY平 板 上 ,培 养 7 d。 用 打 孔 器 取 面 积 相 等 的 5块 ,接 种 于 液 体 培 养 基 , 80m
10、L /250mL三 角 瓶 。 将 1cm2 菌82第 23卷 第 2期2006年 4月 生 物 学 杂 志JOURNAL OF B IOLOGY Vol. 23 No. 2Ap r, 2006苔 接 种 于 200mL /500mL 液 体 摇 瓶 ,于 25 , 160 r/m in摇 床 上 培 养 8d。11212 样 品 处 理三 角 瓶 取 出 后 5000 r/m in离 心 10m in,使 菌 丝 和 发酵 液 分 离 ,上 清 液 进 行 分 级 醇 沉 ,使 乙 醇 的 终 浓 度 达 到70% , 4 放 置 24h去 除 其 中 部 分 多 糖 和 蛋 白 。 浓 缩
11、 至原 体 积 1 /4后 定 容 。 冻 干 处 理 ,得 供 试 样 品 。 称 取 冻干 发 酵 液 样 品 60mg溶 于 2mL蒸 馏 水 中 得 待 测 样 品 。同 时 进 行 菌 丝 体 预 冻 保 存 ,冻 干 的 菌 丝 体 先 后 分 别 用三 氯 甲 烷 、 甲 醇 和 水 提 取 。 残 渣 烘 干 称 重 。上 述 样 品 保 存 于 4 冰 箱 备 用 , 3种 菌 丝 体 提 取 处 理样 品 在 临 测 时 ,分 别 取 100 L样 品 用 80%甲 醇 400 L稀释 至 500 L.水 提 物 在 80%甲 醇 稀 释 后 少 量 样 品 有 絮 状沉
12、淀 ,经 5000 r/m in离 心 10m in,上 清 液 待 测 。11213 DPPH自 由 基 清 除 率 测 定 15 (1 )加 样 品 溶 液 100 L 和 012g/mL DPPH 试 液100 L干 96孔 酶 标 板 中 , 3个 重 复 。(2)样 品 加 入 后 振 荡 30 s,在 37 和 517nm波 长 下测 定 其 吸 光 值 (A sd) ;同 时 测 定 不 加 DPPH的 样 品 空 白吸 光 值 (A s)和 加 DPPH但 不 加 样 品 (以 100 L 80%甲醇 或 蒸 馏 水 代 替 样 品 )的 吸 光 值 (Amd)。 37 保 温
13、20m in后 再 测 定 1次 。 在 Spectra Max M2酶 标 仪 上 以终 点 法 进 行 检 测 。(3)最 后 均 按 下 述 公 式 计 算 : 自 由 基 清 除 率 = 1- (A sd A s) /Amd x100%。11214 数 据 处 理应 用 SPSS1115软 件 进 行 数 据 处 理 ,数 据 均 为 3重 复 。2 结 果 分 析 与 讨 论211 19种 虫 草 及 其 相 关 真 菌 发 酵 液 提 取 物 清 除 自 由基 活 性由 表 1可 知 ,不 同 菌 种 的 清 除 自 由 基 活 性 差 异 显著 ,起 初 时 清 除 率 在 20
14、18% 73%之 间 ,中 国 被 毛 孢RCEFl027菌 株 其 清 除 率 是 最 弱 的 玫 烟 色 拟 青 霉 菌 株RCEFl437的 315倍 。 随 着 时 间 延 长 至 20分 钟 后 ,清 除率 相 应 提 高 ,但 是 提 高 幅 度 各 不 相 同 ,一 般 地 起 初 清 除率 低 的 提 高 幅 度 较 大 ,如 蝙 蝠 蛾 拟 青 霉 RCEF0936菌 株起 初 清 除 率 在 5116% , 20 分 钟 后 其 值 变 成 最 高 为8112%。 另 外 ,长 座 被 毛 孢 RCEF0883和 细 脚 拟 青 霉RCEF0440菌 株 清 除 自 由 基
15、 活 性 也 较 强 ,起 初 时 检 测 分别 达 到 6713%和 5419% , RCEF0188、 RCEF0741、 RCE2Fl437、 RCEF0892和 RCEF0880等 5个 菌 株 的 清 除 率 均不 到 30%。 细 脚 拟 青 霉 的 两 个 菌 株 清 除 自 由 基 活 性 均较 强 ,考 虑 到 该 菌 还 有 培 养 周 期 较 短 的 优 点 ,因 此 ,另外 选 择 了 9株 不 同 地 理 来 源 的 细 脚 拟 青 霉 和 初 筛 中 活性 较 高 的 RCEF0440共 10株 进 行 下 一 步 研 究 。表 1 19株 虫 草 及 其 相 关
16、真 菌 发 酵 液 提 取 物 清 除 自 由 基 活 性Table 1 Free radical scavenging capacity of extracts from broth of 19 strains菌 株 RCEF编 号 起 初 min 20 m in11中 国 被 毛 孢 Hirsutella sinensis Liu Guo, Yu et Zeng RCEFl027 7310 112 7313 11421长 座 被 毛 孢 Hirsutella longissim a L i et al. RCEF0883 6713 211 7815 21031细 脚 拟 青 霉 Paeci
17、lom yces tenuipe( Peck) Samson RCEF0440 5419 111 7812 11341蝙 蝠 蛾 拟 青 霉 P. hepiali Chen et al1 RCEF0936 5116 213 8112 21051拟 珊 瑚 虫 草 无 性 型 H irsutella sp1 RCEF0886 4810 119 4515 11861细 脚 拟 青 霉 Paecilom yces tenuipes( Peck) Samson RCEF0275 4618 115 7813 11671多 形 白 僵 菌 B eauveria am orpha (Hohn1) Samso
18、n RCEF1053 4011 310 7816 21381长 座 被 毛 孢 Hirsutella longissim a L i et al. RCEF0717 3816 216 7010 11991蝉 拟 青 霉 Paecilom yces cicadae(M iq1) Samson RCEF0946 3712 118 6119 211101多 形 白 僵 菌 B eauveria am orpha (Hohn1) Samson RCEFl054 3619 115 6212 112111黄 山 被 毛 孢 Hirsutella huangshanensis Li et al1 RCEF0
19、270 3511 113 6415 113121紫 色 野 村 菌 N om uraea atypicola ( Yasuda) Samson RCEFl078 3417 111 2413 115131蝉 拟 青 霉 Paecilom yces cicadae(M iq1) Sam son RCEF0943 3411 210 6610 118141黄 山 被 毛 孢 Hirsutella huangshanensis L i et al1 RCEF0868 3019 211 4919 119151蛹 拟 青 霉 P1m ilitaris( Kob. ) B rown Paecilom yces
20、 tenuipes; 2, 2 - D iphenyl - l - Picrylhydrazyl; DPPH, free radical scavenging ac2tivity(上 接 22页 )Effects of INF - on signal proteins in Ch lam ydiatrachom a tis infected cells in vivoZHANG Xiao - qing1 , L I J ian1 , ZUO Ke - qiang1 , YU p ing2(11Department of B iochem istry, Xiangnan University,
21、Chenzhou Hunan 423000, China;21Department of Immunology, Central South University, Changsha Hunan 410078, China)Abstract: To study the signal pathway in Chlam ydia trachom atis infected cells,McCoy cells were cultured and infec2ted by chlam ydia trachom atis. W estern blottings were app lied to exam
22、 ine transient change of p rotein tyrosine phosphoryla2tion status and JAK1, JAK2 and STAT1ps activation in C t - infected McCoy cells stimulated with various dose and period ofIFN - , respectively. The result showed p rotein tyrosine phosphorylation was increased under the stimulation of IFN - .JAK
23、1, JAK2 and STAT1p91 activation was depended on the concentration of IFN and the time of exposure to IFN in C t -infected McCoy cells, respectively, after stimulation of IFN - . JAK1, JAK2 and STAT1 were activated in C t - infectedMcCoy cells under the stimulation of IFN - .Key words: JAK; STAT1; Chlam yd ia trachom a tis; IFN - ; signal transduction13第 23卷 第 2期2006年 4月 生 物 学 杂 志JOURNAL OF B IOLOGY Vol. 23 No. 2Ap r, 2006
