1、高一生物增廣班 李江德老師教學資料 1 細菌的簡單染色和細菌的簡單染色和細菌的簡單染色和細菌的簡單染色和革蘭氏革蘭氏革蘭氏革蘭氏染色染色染色染色 （一一一一） 實驗目的實驗目的實驗目的實驗目的： 學習細菌的簡單染色法和革蘭氏染色法。 （二二二二） 實驗原理實驗原理實驗原理實驗原理： 用於生物染色的染料主要有鹼性染料、酸性染料和中性染料三大類。鹼性染料的離子帶正電荷，能和帶負電荷的物質結合。因細菌蛋白質等電點較低，當它生長於中性、鹼性或弱酸性的溶液中時常帶負電荷，所以通常採用鹼性染料（如美藍、結晶紫、鹼性複紅或孔雀綠等）使其著色。酸性染料的離子帶負電荷，能與帶正電荷的物質結合。當細菌分解糖類產酸
2、使培養基pH下降時，細菌所帶正電荷增加，因此易被伊紅、酸性複紅或剛果紅等酸性染料著色。中性染料是前兩者的結合物又稱複合染料，如伊紅美藍、伊紅天青等。 簡單染色法是只用一種染料使細菌著色以顯示其形態，簡單染色不能辨別細菌細胞的構造。革蘭氏染色法是1884年由丹麥病理學家C.Gram所創立的。革蘭氏染色法可將所有的細菌區分為革蘭氏陽性菌（G+）和革蘭氏陰性菌（G）兩大類，是細菌學上最常用的鑒別染色法。該染色法所以能將細菌分為G+菌和G菌，是由這兩類菌的細胞壁結構和成分的不同所決定的。G菌的細胞壁中含有較多易被乙醇溶解的類脂質，而且肽聚糖層較薄、交聯度低，故用乙醇或丙酮脫色時溶解了類脂質，增加了細胞
3、壁的通透性，使初染的結晶紫和碘的複合物易於滲出，結果細菌就被脫色，再經蕃紅複染後就成紅色。G+菌細胞壁中肽聚糖層厚且交聯度高，類脂質含量少，經脫色劑處理後反而使肽聚糖層的孔徑縮小，通透性降低，因此細菌仍保留初染時的顏色。 （三三三三）實驗器材實驗器材實驗器材實驗器材： 1、市售養樂多和優酪乳。 2、染色液和試劑：結晶紫、碘液、95%酒精、蕃紅、二甲苯、油鏡油。 3、器材：廢液缸、洗瓶、載玻片、酒精燈、擦鏡紙、顯微鏡。 高一生物增廣班 李江德老師教學資料 2 （四四四四）實驗方法實驗方法實驗方法實驗方法： 1、簡單染色： （1） 塗片：取乾淨載玻片一塊，將細菌製成薄塗面，注意取菌不要太多。 （2
4、）晾乾：讓塗片自然晾乾或者在酒精燈火焰上方溫火烘乾。 （3）固定：手執玻片一端，讓菌膜朝上，通過火焰2-3次固定（以不燙手為宜）。 （4） 染色：將固定過的塗片加結晶紫染色1-2min。 （5）水洗：用水洗去塗片上的染色液。 （6）乾燥：將洗過的塗片放在空氣中晾乾或用吸水紙吸乾。 （7）鏡檢：先低倍觀察，再高倍觀察，並找出適當的視野後，將高倍鏡轉出，在塗片上加油鏡油一滴，將油鏡頭浸入油滴中仔細調焦觀察細菌的形態。 2、革蘭氏染色： （1）塗片：塗片方法與簡單染色塗片相同。 （2）晾乾：與簡單染色法相同。 （3）固定，與簡單染色法相同。 （4）結晶紫色染色：將玻片加適量（以蓋滿細菌塗面）的結晶紫
5、染色液染色1分鐘。 （5）水洗：傾去染色液，用水小心地沖洗。 （6）媒染：滴加碘液，媒染1min。 （7）水洗：用水洗去碘液。 （8） 脫色：將玻片傾斜，連續滴加95%乙醇脫色2025s至流出液無色，立即水洗。 （9）複染：滴加蕃紅複染5min。 （10）水洗：用水洗去塗片上的蕃紅染色液。 （11）晾乾：將染好的塗片放空氣中晾乾或者用吸水紙吸乾。 （12）鏡檢：鏡檢時先用低倍，再用高倍，最後用油鏡觀察，並判斷菌體的革蘭氏染色反應性。 （13）實驗完畢後的處理： 將浸過油的鏡頭按下述方法擦拭乾淨。 a.先用擦鏡紙將油鏡頭上的油擦去。 b.用擦鏡紙沾少許二甲苯將鏡頭擦23次。 c.再用乾淨的擦鏡紙
6、將鏡頭擦23次。注意擦鏡頭時向一個方向擦拭。 看後的染色玻片用廢紙將油鏡油擦乾淨。 高一生物增廣班 李江德老師教學資料 3 （五五五五）注意事項注意事項注意事項注意事項： 1. 革蘭氏染色成敗的關鍵是酒精脫色。如脫色過度，革蘭氏陽性菌也可被脫色而染成陰性菌；如脫色時間過短，革蘭氏陰性菌也會被染成革蘭氏陽性菌。脫色時間的長短還受塗片厚薄及乙醇用量多少等因素的影響，難以嚴格規定。 2. 染色過程中勿使染色液乾涸。用水沖洗後，應吸去玻片上的殘水，以免染色液被稀釋而影響染色效果。 3. 選用幼齡的細菌。G+菌培養12h-16h，E.coli培養24h。若菌齡太老，由於菌體死亡或自溶常使革蘭氏陽性菌轉呈陰性反應。
