1、1维生素 C 的定量测定（2,6-二氯酚靛酚滴定法）一、目的要求：（1）学习并掌握用 2,6-二氯酚靛酚滴定法测定植物材料中维生素 C 含量的原理和方法。（2）了解蔬菜、水果中维生素 C 含量情况。（3）熟悉微量滴定法的基本操作过程。二、实验原理：维生素 C 是人类营养中最重要的维生素之一，它与体内其它还原剂共同维持细胞正常的氧化还原电势和有关酶系统的活性。维生素 C 能促进细胞间质的合成，如果人体缺乏维生素 C 时则会出现坏血病，因而维生素 C 又称为抗坏血酸。水果和蔬菜是人体抗坏血酸的主要来源。不同栽培条件、不同成熟度和不同的加工贮藏方法，都可以影响水果、蔬菜的抗坏血酸含量。测定抗坏血酸含
2、量是了解果蔬品质高低及其加工工艺成效的重要指标。维生素 C 具有很强的还原性。它可分为还原性和脱氢型。金属铜和酶（抗坏血酸氧化酶）可以催化维生素 C 氧化为脱氢型。2,6-二氯酚靛酚（DCPIP）是一种染料，在碱性溶液中呈蓝色，在酸性溶液中呈红色。抗坏血酸具有强还原性，能使 2,6-二氯酚靛酚还原褪色，其反应如图：当用 2,6-二氯酚靛酚滴定含有抗坏血酸的酸性溶液时，滴下的 2,6-二氯酚靛酚被还原成无色；当溶液中的抗坏血酸全部被氧化成脱氢抗坏血酸时，滴入的 2,6-二氯酚靛酚立即使溶液呈现红色。因此用这种染料滴定抗坏血酸至溶液呈淡红色即为滴定终点，根据染料消耗量即可计算出样品中还原型抗坏血酸
3、的含量。三、实验材料、主要仪器和试剂：1实验材料：多种蔬果（西红柿、尖椒、绿豆芽等）2主要仪器：2（1）天平（2）研钵（3）容量瓶（50mL）（4）刻度吸管（5mL，10mL）（5）锥形瓶（100mL）（6）微量滴定管（3mL）（7）漏斗（8）脱脂纱布（9）滤纸3试剂：（1）2 HCl（2）标准抗坏血酸溶液 精确称量抗坏血酸（应为洁白色，如变为黄色则不能用）25mg，溶于 25ml 4HCl 中，移入 50ml 容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，贮于棕色瓶中，冷藏，最好临用前配制，此溶液每 ml 中含抗坏血酸 0.5mg， 。（3）0.01M 2,6二氯酚靛酚 准确称 0.25g 氧化型 2,6二
4、氯酚靛酚、0.21g 碳酸氢钠溶于 250ml 热蒸馏水中，稀释至 1000ml，充分振摇，装入棕色瓶内，置冰箱内过夜，临用前过滤，用标准 Vc 标定其浓度。置冰箱内冷藏（4）保存不得超过 3 天（最长约可保存一周） 。四、操作方法：一、标准液滴定取 5ml 标准抗坏血酸，用 2,6二氯酚靛酚溶液滴定，以生成为微红持续 15 秒不退为终点，另取 5 2HCl 作空白对照，滴定。计算 2,6二氯酚靛酚溶液的浓度，以每 ml 2,6二氯酚靛酚溶液相当于抗坏血酸的 mg 数来表示。二、提取1水洗干净整株新鲜蔬菜或整个新鲜水果，用纱布或吸水纸吸干表面水分。每一样品称取 10g 或 20g，放入研钵中，
5、加入 2HCl 一起研磨成匀浆，提取液通过 2 层纱布过滤到 50ml 容量瓶中，然后用 2HCl 冲洗研钵及纱布 34 次，最后用 2HCl 稀释至刻度线。2如果提取液含有色素，则倒入锥形瓶内加入 1 匙白陶土（高岭土） ，充分振荡 5分钟，滤纸过滤，白陶土吸附生物样品中的色素，有利于终点的观察。3取三角锥形瓶两个，各加脱色的提取液 5 或 10ml，用 2,6二氯酚靛酚溶液滴定，直至出现微红色 30 秒不退色为终点。记录两次滴定的 ml 数，取平均值。滴定必须迅速不要超过 2 分钟，因为在实验条件下，一些非 Vc 的还原物质其还原作用较迟缓，快速滴定可以避免或减少它们的影响。4另取 5 或
6、 10ml 2HCl 作空白对照，滴定。5按下式计算每 100g 样品中所含的 Vc 的毫克数。（V AV B）CT维生素 C 含量（mg/100 g 样品）DW 100式中：V A 滴定样品提取液消耗染料平均值（mL）VB 滴定空白消耗燃料的平均值（ml）C 样品提取液定容体积（50mL）3T 每 mL 染料所能氧化抗坏血酸的 mg 数D 滴定时吸取样品提取液体积（5 或 10mL）W 被检测样品的重量（5 或 10g）【备注】(1) 某些水果、蔬菜（如橘子、西红柿等）浆状物定容时泡沫太多，可加数滴丁醇或辛醇消泡。(2) 样品的提取液制备和滴定过程，要避免阳光照射和与铜、铁器具接触，以免抗坏
7、血酸被破坏。(3) 整个操作过程要迅速，防止还原型抗坏血酸被氧化。滴定过程一般不超过 2min。滴定所用的染料不应小于 1ml 或多于 4ml，如果样品含维生素 C 太高或太低时，可酌情增减样液用量或改变提取液稀释度。(4) 本实验必须在酸性条件下进行。在此条件下，干扰物反应进行得很慢。2% 盐酸有抑制抗坏血酸氧化酶的作用.(5) 干扰滴定因素有：若提取液中色素很多时，滴定不易看出颜色变化，可用白陶土脱色，或加 1ml 氯仿，到达终点时，氯仿层呈现淡红色。Fe2 可还原二氯酚靛酚。对含有大量 Fe2 的样品可用 8%乙酸溶液代替草酸溶液提取，此时 Fe2 不会很快与染料起作用。样品中可能有其它
8、杂质还原二氯酚靛酚，但反应速度均较抗坏血酸慢，因而滴定开始时，染料要迅速加入，而后尽可能一点一点地加入，并要不断地摇动三角瓶直至呈粉红色，于 15s 内不消退为终点。(6) 提取的浆状物如不易过滤，亦可离心，留取上清液进行滴定。（7）市售 2,6-二氯酚靛酚质量不一，以标定 0.4mg 抗坏血酸消耗 2mL 左右的染料为宜，可根据标定结果调整染料溶液浓度。五、思考题1该法测定抗坏血酸有何不足？2用 2%盐酸提取样品的目的是什么？参考答案1用本法测定抗坏血酸含量虽简便易行，可以一次测定大量的样品。但有下述缺点：第一，在生物组织内和组织提取物内，抗坏血酸还能以脱氢抗坏血酸及结合抗坏血酸的形式存在，
9、本法只能测定还原型抗坏血酸，不能测出具有同样生理功能的氧化型抗坏血酸和结合型抗坏血酸。第二，样品中的色素经常干扰对终点的判断，可预先用白陶土脱色，或加入 23ml 二氯乙烷，以二氯乙烷层变红为终点。第三，生物组织提取物和生物体液中常有其他还原性的物质，其中有些也可以在同样条件下使 2,6二氯酚靛酚还原脱色。2用 2盐酸制备样品提取液，可有效地抑制抗坏血酸氧化酶，以免抗坏血酸为氧化型而无法滴定。如果样品中有较多亚铁离子（Fe 2 ）时，亦会使染料还原而影响测定，这时应改为 8乙酸制备样品提取液。结果分析：( mg/100g )4西红柿：14.96，15.84，10.12；青椒：50.08，66.88，77.10，75.00；苹果：0.743，大蒜：6.16，8.8，10.12；西瓜肉：8.36；大葱：12-13；土豆：2-13；豆角：18.48；茄瓤：7.48；桃：4.84；豆芽：10；
