1、实验 2 淀粉酶活力的测定【摘要】本次试验目的在于通过实际的操作与观察，掌握酶活力测定的方法以及巩固分光光度计的使用。根据淀粉酶催化淀粉水解产生的葡萄糖、麦芽糖等还原糖能够与 3,5-二硝基水杨酸作用，生成棕红色的 3-氨基-5-硝基水杨酸，通过分光光度计测定棕红色溶液的吸光度值，并与标准葡萄糖-吸光度值曲线进行对比，即可知道实验中生成的还原糖的量，从而测定酶活。比对试验结果，发现本组的实验数据与别组的存在一定差别，本次实验所得结果欠佳。【材料与设备】如表 1 所示表 1 淀粉酶活力测定实验材料设备一览表试剂 仪器玻璃器皿稀释 200 倍的淀粉酶原液风光光度计 试管（16 根葡萄糖溶液恒温水浴
2、锅 移液枪，枪头洗脱峰 1.2.3电磁炉移液管3,5-二硝基水杨酸 试管架1%淀粉溶液【实验步骤】1. 葡萄糖标准曲线的测定（1）取 7 支试管，按如下表 2 所示，加入试剂表 2 葡萄糖标准曲线加样表管号试剂1 2 3 4 5 6 7葡萄糖标准液（ml） 0 0.1 0.3 0.5 0.7 0.9 1.0蒸馏水（ml） 1.0 0.9 0.7 0.5 0.3 0.1 03,5-二硝基水杨酸（ml） 1.0(2)将各管摇匀，置于沸水浴(3)取出试管，冷却近室温，加入 8ml 蒸馏水（4）以 1 号管为对照，测定各管在 540nm 下的吸光度，并记录2.酶活力的测定（1）四组样品（稀释 200
3、倍的酶原液、洗脱峰 1、洗脱峰 2、洗脱峰 3）分别按照如下表 3 操作进行，即每个样品测两管，对照组缓冲液只需测定一管表 3 酶活力测定加样一览表编号操作项目1-1 1-2 缓冲液添加酶液（ml） 0.1 0.1 0.13,5-二硝基水杨酸（ml） 0 0 1.01%淀粉溶液(ml) 0.9 0.9 0.9酶解反应 40,10min 100,5min3,5-二硝基水杨酸（ml） 1.0 1.0 0沸水浴 5min定容 加入 8ml 蒸馏水（2）将各管摇匀后，于 540nm 下测定吸光度值，并记录【实验结果】1. 原始数据记录(1)葡萄糖标准曲线的测定：原始数据记录如表 4 所示表 4 测定葡
4、萄糖标准液吸光度原始数据记录表试管号 1 2 3 4 5 6 7葡萄糖含量(ml) 0 0.1 0.3 0.5 0.7 0.9 1.0A540 0 0.155 0.169 0.278 0.366 0.521 0.596（2）酶活力测定：原始数据记录如表 5 所示表 5 酶活力测定原始数据记录表样品 稀释 200 原酶液洗脱峰 1 洗脱峰 2 洗脱峰 3 缓冲液试管编号 原-1 原-2 1-1 1-2 2-1 2-2 3-1 3-2 1吸光度值A5401.213 1.130 0.319 0.397 0.811 0.809 0.398 0.369 0.2782. 数据处理（1） 葡萄糖标准曲线的绘
5、制y = 0.0968x + 0.029100.10.20.30.40.50.60.70 1 2 3 4 5 6葡 萄 糖 含 量 （ umol）吸光度值 系 列 1线 性 (系 列 1)所以，葡萄糖标准曲线方程为 y=0.0968x+0.0291 （1）（2） 酶活力的测定以洗脱峰 2 的一组数据为计算示例：平均吸光度 A1=(0.811+0.809)/2=0.8065纯吸光度 A2=0.8065-0.278=0.5285 带入式子（1） 即 0.5285=0.0968x+0.0291解得 x=5.16umol所以实验中 0.1mol 洗脱峰生成还原糖的物质的量为 n=5.16umol本实验
6、中规定每 min 生成 1umol 的还原糖为 1U所以 0.1ml 洗脱峰 2 的酶活为 5.16/10=0.516U1ml 洗脱峰 2 的酶活力为 0.516*10=5.161U/ml其余计算结果汇于下列表 6 中表 6 酶活力测定实验结果记录表样品 稀释 200 原酶液 洗脱峰 1 洗脱峰 2 洗脱峰 3酶活力（U） 8.93 0.53 5.16 0.79【讨论】1. 经过本次实验，基本掌握了酶活力测定的一种方法，也更加熟练的对分管光度计进行了操作。实验当中，有一些需要注意的地方：首先，要严格控制实验的酶解反应时间以及温度，因为温度和反应时间是影响酶活性的关键因素此外，由于加入的底物淀粉
7、中本身也含有葡萄糖，所以实验需要设置对照组，来扣除底物中葡萄糖对实验结果的影响。2. 在与别的组对比的过程中发现，本次实验结果数据波动很大，缓冲液所测得的数据结果偏小，可能原因是 5min 煮沸的时候未控制在沸点，变成 5min 加热至沸的情况，造成反应不彻底。洗脱峰 1 和洗脱峰 3 的数值与别组相比，偏小比较多，可能原因是加热过程发生问题，也可能是试剂在添加的过程中出现了管内气泡，造成实际加入的试剂量减少，从而引起误差。3. 除了采用上述的生糖法来测定之外，在实际当中还有其余方法可以选择，一是测定底物淀粉的消耗量；二为色原底物分解法，三是酶偶联法 【1】 。其中，方法一中的碘-淀粉比色法是
8、最为常用的方法，该方法是根据淀粉遇碘变蓝的原理而设计的，在底物淀粉浓度已知且过量的条件下，反应后加入碘液与未被催化水解的淀粉结合成蓝色复合物。其蓝色的深浅与未经酶促反应的空白管比较成比例，从而计算出淀粉的量，推算出淀粉酶活力【结论】此次实验存在着一定的操作误差，误差来源主要是对反应时间的控制，在恒温水浴时间到后，没有立即取出试管再加入 3,5-二硝基水杨酸，而是直接在水浴锅当中加入了水杨酸再取出试管，这样就于无形中增加了水浴的时间，从而造成了实验误差。从实验看出，各样品的活力各不一样，说明酶的活力除了受实验中的温度，时间等的控制外，还有许多其他的影响因素，从而导致最终测得的酶活是不一样的。【参考文献】【1】周景祥，王桂芹，于涛.蛋白酶和淀粉酶活性检测方法探究【J】.中国饲料.2001,(11).
