第卷第期年月生命科学.pdf

1、 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http:/第 卷 第 期年 月生 命 科 学 ,文 章 编 号 一 以 一 一 以基 因 功 能 研 究 方 法 的 新 进 展杜 玉 梅 , 左 正 宏厦 门 大 学 生 命 科 学 学 院 , 厦 门摘 要 随 着 生 命 科 学 的 发 展 , 研 究 领 域 的 不 断 开 拓 , 越 来 越 多 的 未 知 新 基 因 和 基 因 的 新 功 能 被 科 学家 们 发 现 , 研 究 这 些 未 知 新 基 因 的

2、功 能 和 己 知 基 因 的 新 功 能 成 为 了 极 其 重 要 的 一 项 内 容 。 本 文 对 基 因功 能 研 究 的 最 新 方 法 进 行 了 介 绍 。关 键 词 基 因 功 能 功 能 预 测 生 物 信 息 学中 图 分 类 号 一 文 献 标 识 码一 , 一, , ,年 , 诺 贝 尔 奖 获 得 者 。 第 一 次 提出 了 人 类 基 因 组 计 划 和 人 类 基 因 组 测 序 的 可 能 性 。 呼 旨 出 , 癌 症 和 其 他 疾 病 的 发 生 都 与 基 因有 关 , 并 指 出 测 定 人 类 整 个 基 因 组 序 列 的 途 径 和 重要 意

3、 义 。 年 , 人 类 基 因 组 计 划 正 式 启 动 , 在多 国 科 学 家 的 共 同 努 力 下 , 人 类 基 因 组 序 列 图 已 经完 成 , 生 命 科 学 的 研 究 己 进 入 后 基 因 组 时 代 , 基 因组 的 研 究 也 从 结 构 基 因 组 学 转 向 功 能 基 因 组 学 。 目前 , 更 大 的 挑 战 在 于 如 何 确 定 基 因 的 功 能 和 弄 清 全部 的 遗 传 信 息 , 这 将 是 世 纪 生 命 科 学 研 究 的 重 要领 域 。本 文 将 对 以 下 研 究 基 因 功 能 的 新 技 术 及 其 新 进展 作 一 综 述

4、 。基 因 的 生 物 信 息 学 分 析生 物 信 息 学 以 大 规 模 序 列 信 息 产 出 为 基 本 特征 , 除 了 对 人 类 基 因 的 测 序 外 , 还 包 括 了 多 种 模 式生 物 体 的 基 因 组 测 序 , 这 些 序 列 可 以 从 美 国 的 基 因库 , 、 基 因 组 序列 数 据 库 , 、 欧洲 的 分 子 生 物 学 实 验 室巧 , 和 日 本 的 数 据 库, 中 获 得 。 通 过 序 列 分 析 比 较工 具 如 、 , 可 以 对 基 因 序 列 资 料中 各 类 信 息 进 行 识 别 和 比 较 , 寻 找 序 列 之 间 的 同

5、源性 , 得 到 序 列 之 间 的 进 化 关 系 , 建 立 基 因 序 列 结 构和 功 能 的 关 系 。基 因 的 时 空 表 达 谱 分 析基 因 的 表 达 在 个 体 发 育 的 不 同 阶 段 以 及 在 个 体的 不 同 组 织 和 细 胞 类 型 中 均 不 相 同 , 即 基 因 表 达 的时 空 性 。 因 此 , 在 研 究 一 个 基 因 的 功 能 前 , 要 对基 因 的 时 空 表 达 谱 进 行 分 析 , 包 括 和 蛋 白 质两 个 水 平 上 的 基 因 表 达 谱 分 析 。水 平 的 表 达 谱 分 析 研 究 水 平 的基 因 表 达 谱 分

6、析 常 用 的 方 法 有 、 原 位收 稿 日 期 一 一 修 回 日 期 一 一基 金 项 目 国 家 自 然 科 学 基 金 项 目通 讯 作 者 一 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http:/生 命 科 学 第 卷杂 交 、 一 等 。 可 对 基 因 进 行 特异 和 定 量 的 检 测 , 但 测 定 效 率 不 高 , 灵 敏 度 也 低 ,不 能 检 出 微 小 的 基 因 表 达 量 , 同 时 实 验 中 使 用 的 放射 性 物 质 对

7、人 和 环 境 也 有 危 害 。 作 为 一 种 经 典 的 基因 表 达 量 分 析 方 法 , 依 然 被 广 泛 地 应用 。 原 位 杂 交 技 术 由 美 国 耶 鲁 大 学 和 盯 于年 首 先 创 立 , 广 泛 用 于 检 测 一 个 特 异 的在 某 一 种 生 物 体 或 者 组 织 、 细 胞 里 的 具 体 表 达 位置 , 对 待 测 核 酸 分 子 进 行 定 性 、 定 量 及 定 位 分 析 。一 主 要 有 半 定 量 一 、 实 时 定 量 一以 及 竞 争 性 定 量 一 半 定 量 一 操 作 简便 、 快 捷 , 但 精 确 度 不 高 , 多 用

8、于 快 速 初 步 分 析实 时 定 量 一 是 近 年 来 新 发 展 起 来 的 , 特 异 性强 、 自 动 化 程 度 高 竞 争 性 一 则 是 将 特 异 性的 目 的 序 列 同 已 知 浓 度 的 内 标 一 起 扩 增 。 通 过比 较 由 内 标 获 得 的 信 号 和 目 的 模 板 所 获 得 的 信 号 ,确 定 目 的 模 板 的 相 对 含 量 。近 年 来 发 展 了 一 些 新 方 法 , 如 表 达 序 列 标 签 串联 排 列 连 接, 和 。 是应 用 含 有 型 限 制 酶 位 点 的 寡 核 普 酸 引 物 , 产 生在 上 固 定 的 短 。 这

9、些 与 热变 性 有 关 的 一 锁 状 标 点 序 列 相 邻 , 因 此 可 串 联 成长 阵 列 , 然 后 通 过 高 通 量 测 序 识 别 、 分 析 。法 研 究 的 对 象 是 用 两 种 不 同 限 制 酶 消 化的 样 品 。 用 荧 光 标 记 的 引 物 扩 增 、 毛 细 管 电泳 分 离 这 些 标 记 的 片 断 , 然 后 同 时 测 定 每 个 片 断 的精 确 长 度 。 通 过 电 泳 比 较 两 个 样 品 中 每 个 点 的 强度 , 自 动 识 别 不 同 表 达 基 因 的 片 段 。 用 大 小精 确 的 片 段 和 片 段 旁 侧 序 列 查

10、询 特 定 物 种 的 数 据 库 ,得 出 片 段 信 息 , 而 旁 侧 序 列 由 限 制 酶 消 化 而 来 。 查询 数 据 库 包 括 转 录 子 的 “ ” 消 化 片 段 以 及 所有 预 测 的 基 因 片 段 。 这 种 预 测 称 为 “ ” ,可 瞬 时 显 示 基 因 表 达 差 异 的 临 时 列 表 。蛋 白 质 水 平 的 表 达 谱 分 析 蛋 白 质 水 平 上 的 表达 分 析 的 常 用 技 术 是 和 免 疫 组 化 等 。与 类 似 , 不 仅 可 以 进 行 定量 分 析 , 而 且 还 能 够 检 测 蛋 白 质 的 分 子 质 量 大 小 及其

11、 聚 体 形 式 。 免 疫 组 化 是 研 究 细 胞 内 蛋 白 质 定 位 、定 量 的 重 要 方 法 , 特 异 性 强 、 敏 感 性 高 、 能 够 准确 确 定 蛋 白 质 是 在 特 定 组 织 中 的 哪 些 细 胞 以 及 在 特定 细 胞 的 哪 个 部 位 中 表 达 。基 因 的 功 能 预 测在 对 基 因 功 能 进 行 实 验 验 证 之 前 , 可 先 对 基 因的 功 能 进 行 合 理 预 测 , 包 括 功 能 学 上 的 预 测 和 结 构学 上 的 预 测 。利 用 生 物 信 息 学 进 行 功 能 学 上 的 预 测 通 过 信号 肤 序 列

12、预 测 分 析 , 初 步 判 定 基 因 的 亚 细 胞 定 位后 , 可 对 其 蛋 白 质 的 基 本 理 化 性 质 , 如 氨 基 酸 组成 、 等 电 点 等 进 行 分 析 。 再 在 已 知 的 氨 基 酸 序 列 的基 础 上 , 分 析 预 测 其 高 级 结 构 。 之 后 采 用和 程 序 进 行 序 列 同 源 性 分 析 , 若 新 确 定 的蛋 白 质 与 已 确 定 的 蛋 白 质 显 示 出 结 构 和 功 能 上 的 相似 性 和 同 源 性 , 则 可 以 从 已 知 基 因 的 功 能 来 预 测 未知 的 基 因 的 功 能 。 通 过 对 蛋 白 质

13、 结 构 数 据 库 的 检 索比 较 , 可 初 步 确 定 新 基 因 是 否 属 于 某 一 基 因 家 族 或超 家 族 的 新 成 员 , 然 后 运 用 和 软件 来 进 行 多 重 序 列 比 对 和 分 子 进 化 分 析 , 利 用 这 个基 因 家 族 中 已 知 基 因 的 结 构 、 功 能 和 它 在 生 物 体 中的 作 用 , 来 预 测 未 知 基 因 的 结 构 与 功 能 。从 结 构 学 方 面 预 测 基 因 的 功 能 通 过一 或数 据 库 可 以 进 行 蛋 白 质 功能 域 的 分 析 , 对 推 测 新 基 因 的 功 能 提 供 有 价 值

14、的 信息 。 再 利 用 衍 射 和 磁 共 振 的 方 法 , 对 蛋 白 质 的 分子 结 构 进 行 推 导 和 探 索 , 了 解 分 子 之 间 的 识 别 机 制和 生 化 反 应 的 原 理 , 也 可 以 预 测 蛋 白 质 的 功 能 。基 因 功 能 的 实 验 学 验 证在 对 基 因 的 功 能 进 行 合 理 的 预 测 后 , 需 要 通 过实 验 来 进 行 研 究 和 验 证 。 通 常 的 研 究 策 略 是 将 基 因导 入 到 一 个 细 胞 或 个 体 中 , 通 过 该 基 因 在 体 内 的 表达 情 况 , 观 察 细 胞 生 物 学 行 为 或

15、个 体 表 型 遗 传 性 状的 变 化 , 从 而 鉴 定 基 因 的 功 能 。 主 要 的 方 法 有 基 因敲 除 和 敲 入 技 术 以 及 人 工 染 色 体 技 术 等 。 此 外 , 一些 新 的 技 术 , 如 反 义 技 术 、 技 术 、 基因 诱 捕 技 术 和 微 阵 列 分 析 等 也 得 到 了 广 泛 的 应 用 。基 因 敲 除 和 敲 入 技 术 基 因 敲 除 是 应 用 同源 重 组 原 理 发 展 起 来 的 一 门 技 术 。 年 , 首 次证 实 的 哺 乳 动 物 细 胞 中 同 源 重 组 的 存 在 奠 定 了 基 因敲 除 的 理 论 基

16、础 。 年 , 首 次 建 立了 完 整 的 细 胞 基 因 敲 除 的 小 鼠 模 型 。 此 后 的 几年 中 , 基 因 敲 除 技 术 得 到 了 进 一 步 的 发 展 和 完 善 ,目 前 已 成 为 一 种 较 理 想 的 改 造 生 物 遗 传 物 质 的 实 验方 法 。 与 基 因 敲 除 相 反 , 基 因 敲 入 是 通 过 同 源 重 组的 方 法 , 将 基 因 的 编 码 序 列 用 另 一 基 因 的 编 码 序 列进 行 替 换 的 技 术 。 通 过 基 因 敲 入 , 可 以 让 基 因 在 体内 表 达 、 研 究 其 功 能 也 可 以 与 之 前 的

17、 基 因 进 行 比较 , 看 其 是 否 具 有 相 同 的 功 能 。 传 统 的 方 法 只 能 在 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http:/第 期 杜 玉 梅 , 等 基 因 功 能 研 究 方 法 的 新 进 展基 因 组 中 插 入 较 小 的 片 段 。 和将 含 有 片 段 的 、 转 座 因 子 转 入 到 质 粒 里 , 质 粒能 够 较 转 座 因 子 自 身 更 稳 定 地 携 带 大 片 断 。这 种 方 法 可 将 到 的 敲 入

18、 果 蝇 基 因组 。 这 一 突 破 使 生 物 学 家 向 果 蝇 体 内 敲 入 大 片 段 的成 为 可 能 。人 工 染 色 体 的 转 导 质 粒 载 体 不 仅 承 载 能 力 有限 , 且 表 达 水 平 低 、 缺 乏 组 织 特 异 性 等 。 因 此 ,克 隆 大 片 段 常 用 酵 母 人 工 染 色 体 、 细 菌人 工 染 色 体 等 。 它 们 不 仅 可 产 生 较 高 的 表 达水 平 和 组 织 特 异 性 , 还 可 精 确 地 调 节 重 组 。 自 世纪 末 , 又 出 现 了 一 种 全 新 的 载 体 系 统 人 类 人 工染 色 体 。 与 其

19、他 基 因 载 体 相 比 , 能 携 带包 含 完 整 基 因 或 多 个 基 因 以 及 基 因 的 所 有 外 显 子 和 附近 染 色 体 区 域 的 调 控 区 的 大 片 段 , 为 目 的 基 因提 供 了 一 个 与 其 在 正 常 染 色 体 上 一 致 的 环 境 , 保 证了 转 基 因 在 正 常 细 胞 中 时 空 性 的 表 达 。 同 时 ,不 整 合 到 基 因 组 中 , 从 而 不 产 生 宿 主 基 因 组 本 身 的插 入 突 变 和 转 基 因 沉 默 等 现 象 , 能 够 使 基 因 表 达 的时 限 增 长 。 等 就 将 这 种 非 插 入 型

20、 的 载体 成 功 应 用 于 人 端 粒 逆 转 录 酶 的 研 究 。反 义 技 术 反 义 技 术 包 括 三 类 反 义 寡 核 昔酸 、 核 酶 和 小 干 扰 。 反 义 寡 核 普 酸 包 括 反 义和 反 义 。 年 , 利 用 人 工 合成 的 与 劳 氏 肉 瘤 病 毒 的 互 补 的 来抑 制 增 殖 , 阻 止 了 使 鸡 红 细 胞 癌 变 , 使其 成 为 研 究 反 义 的 第 一 人 。 目 前 反 义 用于 基 因 功 能 研 究 效 果 较 好 , 也 可 用 自 动 合成 仪 很 方 便 地 合 成 , 但 因 合 成 后 的 未 修 饰 寡 核 营 酸对

21、 核 酸 酶 的 抵 抗 力 较 弱 , 不 易 透 过 细 胞 膜 , 与 靶 序列 的 亲 和 力 也 较 低 , 故 经 常 需 要 修 饰 。 反 义则 是 通 过 与 靶 形 成 较 稳 定 的 二 聚 体 来 抑 制 靶基 因 的 表 达 , 其 作 用 机 理 可 能 在 复 制 、 转 录及 翻 译 水 平 上 抑 制 靶 基 因 的 表 达 。 核 酶 是 一 类 具 有催 化 活 性 的 特 殊 的 分 子 , 具 有 高 度 专 一 内 切 核酸 酶 活 性 。 单 个 核 酶 分 子 可 以 结 合 多 个 分 子并 使 之 在 特 定 部 位 断 裂 , 而 核 酶

22、本 身 具 有 不 易 受攻 击 的 较 稳 定 的 空 间 结 构 , 使 得 催 化 效 率 比反 义 高 。 核 酶 己 经 成 功 地 应 用 于 培 养 细 胞 中 基因 表 达 的 阻 断 , 主 要 靶 基 因 包 括 、 、和 等 。 小 干 扰 可 通 过 双 链介 导 特 异 性 的 降 解 靶 , 导 致 转 录 水平 或 转 录 后 水 平 的 基 因 沉 默 。 年 , 。 和, ,在 研 究 秀 丽 新 小 杆 线 虫 的盯 基 因 功 能 时 最 先 发 现 这 种 现 象 , 但 直 到年 , 等 “ 才 解 释 了 这 种 现 象 , 他 们 发 现 将注 入

23、 线 虫 后 可 以 有 效 地 引 起 序 列 特 异 性 的 基因 抑 制 , 并 将 这 种 转 录 后 水 平 的 基 因 沉 默 机 制 称 为。 广 泛 存 在 于 自 然 界中 , 其 高 度 的 序 列 专 一 性 和 高 效 的 干 扰 能 力 , 可 以使 特 定 的 基 因 表 达 降 低 或 沉 默 , 是 研 究 基 因 功 能 的强 有 力 的 工 具 。 等 利 用 降 低 和 亡的 表 达 , 同 时 通 过 位 点 的 突 变 和 缺 失 , 从 而验 证 了 反 应 位 点 和 结 合 位 点 在 调 节人 类 基 因 基 底 活 性 中 的 作 用 。而

24、成 熟 的 而 长 约 一 ,是 一 类 重 要 的 内 源 性 单 链 的 非 编 码 小 分 子 ,可 调节 与 其 序 列 互 补 的 表 达 。 年 , 由等 在 线 虫 中 首 次 发 现 。 在 不 同 物 种 间 具有 高 度 的 保 守 性 , 表 达 具 有 细 胞 或 组 织 特 异 性 , 与细 胞 的 生 长 、 增 殖 、 分 化 和 衰 亡 等 相 关 。 它 可 以在 转 录 和 翻 译 水 平 来 抑 制 基 因 的 表 达 。 根 据 最 近 的研 究 推 测 , 目 前 已 经 有 多 达 个 基 因 可 以 通 过进 行 调 节 , ” 。 等 在 研 究

25、 猪 胎儿 血 红 蛋 白 中 印 的 干 扰 效 应时 , 结 合 技 术 和 一 检 测 技 术 , 来进 一 步 验 证 和 研 究 的 干 扰 效 应 。 可 以 说 ,而 技 术 和 一 检 测 技 术 的 结 合 , 使 得 基因 功 能 的 研 究 技 术 得 到 了 新 的 发 展 。基 因 诱 捕 技 术 和 基 因 诱 捕 数 据 库 基 因 诱 捕 技术 是 近 几 年 发 展 起 来 的 , 是 基 因 打 靶 技 术 的 进 一 步发 展 , 已 成 为 研 究 基 因 功 能 及 分 析 其 生 物 学 现 象 的重 要 工 具 。 其 基 本 原 理 是 通 过

26、物 理 、 化 学 、 生物 等 方 法 , 将 带 有 外 源 基 因 的 载 体 导 入 细胞 中 , 使 内 源 基 因 突 变 , 并 在 被 诱 捕 序 列 启 动 子 的转 录 控 制 下 表 达 插 入 的 报 告 基 因 常 为 新 霉 素 或 半 乳糖 普 酶 基 因 以 鉴 定 突 变 。 无 启 动 子 、 增 强 子 的报 告 基 因 在 细 胞 中 通 过 同 源 重 组 得 到 重 组 子 后 ,分 析 不 同 发 育 阶 段 、 不 同 组 织 器 官 中 报 告 基 因 的 表达 情 况 , 可 以 研 究 重 组 部 分 内 源 基 因 的 表 达 特 性 。

27、基 因 诱 捕 载 体 在 整 合 位 点 可 利 用 内 源 基 因 调 控 元 件模 仿 内 源 基 因 表 达 , 使 其 表 达 终 止 , 从 而 可 以 阐 明 内源 基 因 的 功 能 , 因 此 广 泛 应 用 于 基 因 功 能 的 研 究 。等 利 用 该 技 术 来 研 究 与 软 骨 分 化 相 关 因子 的 作 用 。 目 前 , 公 共 投 资 的 大 规 模 基 因 诱 捕 计 划在 一 些 国 家 开 展 , 基 因 诱 捕 也 臻 于 完 善 , 基 因 诱 捕组 织 也 逐 渐 增 多 。 近 年 来 , 全 世 界 主 要 的 基 因 诱 捕组 织 联 合

28、 成 立 了 国 际 基 因 诱 捕 联 盟 , 并 为 此 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http:/生 命 科 学 第 卷开 发 了 一 个 以 用 户 为 导 向 的 网 站, 其 目 的 在 于 集 中 接 纳 所 有 可 以 公 共获 得 的 基 因 诱 捕 资 源 。 数 据 库 及 网 站 的 建立 标 志 着 大 规 模 小 鼠 基 因 诱 捕 的 一 个 重 大 进 展 。 通过 基 因 诱 捕 计 划 的 世 界 性 合 作 , 发 展 了

29、 标 准 化 的 鉴定 及 注 释 程 序 用 以 进 行 诱 捕 数 据 分 析 , 为 基 因 功 能研 究 人 员 在 第 一 时 间 提 供 了 资 讯 平 台 。微 阵 列 分 析 微 阵 列 而 拼 是 近 年 来 发 展起 来 的 可 用 于 大 规 模 快 速 检 测 基 因 差 异 表 达 、 基 因组 表 达 谱 、 序 列 多 态 性 、 疾 病 相 关 基 因 的 一项 研 究 基 因 功 能 的 新 技 术 , 于 年 由 等首 次 开 发 出 。 它 包 括 微 阵 列 和 芯 片 , 其原 理 为 将 成 千 上 万 条 片 段 、 表 达 序列 标 签 等 按

30、横 行 纵 列 方 式 在 固 相 支 持 物 上 有 序 点样 。 检 测 时 , 先 用 来 自 不 同 生 理 状 态 和 发 育 阶 段 的作 为 模 板 , 以 放 射 性 同 位 素 或 荧 光 标 记 的为 底 物 反 转 录 合 成 , 再 用 所 得 与微 阵 列 或 芯 片 进 行 杂 交 , 然 后 通 过 计 算 机 对 结果 进 行 判 读 和 处 理 , 从 而 判 断 待 测 样 品 中 基 因 是 否存 在 或 者 存 在 多 少 。微 阵 列 分 析 是 一 种 新 的 大 规 模 检 测 基 因 表 达 的技 术 , 具 有 高 通 量 分 析 的 优 点

31、。 采 用 微 阵 列 分 析 ,可 以 进 行 或 表 达 水 平 的 高 效 快 速 的 检测 【 , 。 微 阵 列 分 析 打 破 了 以 往 “ 一 种 疾 病 一 个 基因 ” 的 研 究 模 式 , 通 过 对 个 体 在 不 同 生 长 发 育 阶 段或 不 同 生 理 状 态 下 大 量 基 因 表 达 的 平 行 分 析 , 研 究相 应 基 因 在 生 物 体 内 的 功 能 , 阐 明 不 同 层 次 多 基 因协 同 作 用 的 机 理 , 已 成 为 后 基 因 组 时 代 生 命 科 学 研究 强 有 力 的 工 具 。展 望基 因 功 能 的 研 究 是 科 学

32、 研 究 的 重 要 内 容 , 也 是一 项 复 杂 的 工 程 。 除 了 以 上 的 研 究 方 法 外 , 还 有 许多 其 他 的 方 法 可 用 于 基 因 功 能 的 研 究 。 在 实 际 工 作中 , 研 究 者 需 要 根 据 具 体 情 况 制 定 某 一 特 定 基 因 功能 的 研 究 方 案 , 且 对 一 个 特 定 基 因 功 能 进 行 全 面 、系 统 的 研 究 。 相 信 通 过 广 大 研 究 者 的 努 力 创 新 、 国际 间 的 广 泛 合 作 以 及 新 技 术 新 方 法 的 开 创 和 应 用 ,还 会 有 更 多 更 好 的 方 法 出

33、现 。 在 不 久 的 将 来 , 我 们能 够 更 全 面 了 解 基 因 组 的 功 能 , 完 成 生 命 周 期 表 的制 作 , 认 识 人 类 基 因 组 中 约 万 个 基 因 是 如 何 在 人类 的 生 长 、 发 育 、 疾 病 、 衰 老 、 死 亡 等 过 程 中 发挥 功 能 及 相 互 协 调 , 解 密 生 命 的 奥 秘 。【 参 考 文 献 【, , 一【 , , , , , , , , 一【 ,尸 , , 一【 垃 , , , 一一 脚, 一, , 科 一【 , 对 了 止, , 一【 , , ,一, , 一【 , , , , 一【 , , 王 面 , 能, 而 , , 一【 脸 , , , , 一【 , , , 一【 , ,王 , , 一【 峋 , , 一【 , 儿 ,川, ,一 , , , ,一【 , , ,一一 一一 立 产 , 一【 , , ,一 一 介, , 科 一