1、 2008, Vol. 29, No. 08食品科学分析检测526 d F srAM;_E 杨贤庆1，孙满义1,2，李来好1，岑剑伟1，吴燕燕1，戚 勃1，石 红1(1.中国水产科学研究院南海水产研究所，广东 广州 510300； 2.上海海洋大学，上海 200090)K1 ：在使用 2006 年国家标准 GB/T20361 2006 水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定高效液相色谱荧光检测法的过程中，分析前处理、净化、检测各个环节所遇到的问题，并研究硼氢化钾的还原效果。液液萃取过程中采用离心取代分液漏斗分液，同时做出一些相应的简化。本改良方法通过对罗非鱼、对虾和鳗鲡三种水产品的测定结果显示，
2、回收率在 80.7% 109.8% 之间，相对标准偏差 (RSD)为 0.967% 9.169%。1oM ：孔雀石绿；荧光检测；实验条件Improvement on Determination of Malachite Green in Fishery Products by HPLC with Fluorescence DetectorYANG Xian-qing1， SUN Man-yi1,2， LI Lai-hao1， CEN Jian-wei1， WU Yan-yan1， QI Bo1， SHI Hong1(1.South China Sea Fisheries Research In
3、stitute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510300, China；2.Shanghai Ocean University, Shanghai 200090, China)Abstract ： In the use of China national standard Determination of malachite green and gentian violet residues in fishery products-high performance liquid chromatography with fluo
4、rescence detector (GB/T20361 2006), the problems concerning pretreatment,purification and detection were analyzed. The reduction effect of KBH4 was studied. Centrifugation was adopted for separationinstead of separatory funnel in liquid-liquid extraction process. Meanwhile some corresponding operati
5、ons were simplified. Thedetermination results of tilapia, shrimp and eel by the improved method showed that the recoveries range from 80.7% to 109.8%with the relative standard deviations (RSD) from 0.967% to 9.169%.Key words： malachite green； fluorescence detection； experimental conditions中图分类号： O65
6、2.63 文献标识码： A 文章编号： 1002-6630(2008)08-0526-04收稿日期： 2008-04-18基金项目：广东省质量安全专项作者简介：杨贤庆 (1963-)，男，研究员，主要从事水产品加工及质量安全研究。 E-mail： 孔雀石绿 (malachite green， MG)是一种带有金属光泽的绿色结晶体，又名碱性绿、盐基块绿、孔雀绿，是一种三苯基甲烷型染料，易溶于水、乙醇和甲醇。孔雀石绿以往仅在制陶业、纺织业、皮革业、细胞化学染色剂和指示剂等方面使用，后来它又被用作驱虫剂、杀菌剂和防腐剂。自 20 世纪 30 年代以来，许多国家曾经采用孔雀石绿杀灭鱼类体内外寄生虫和鱼
7、卵中的霉菌，它对鱼类水霉病、烂鳃病、小瓜虫病以及寄生虫病等的控制非常有效；另外孔雀石绿对治疗鱼身碰撞刮伤相当有效，可以防止细菌感染，避免伤口溃烂、扩散。从上世纪 90 年代开始，国内外研究学者陆续发现，孔雀石绿具有较多副作用，孔雀石绿及其代谢产物隐色孔雀石绿会使水生生物皮肤组织发生轻度炎症，使脊椎、头、背鳍等部位畸变1，卵染色体发生异常2，对哺乳动物有高致癌、致畸、致突变作用，所以被许多国家纷纷禁止使用。为了防止滥用孔雀石绿，许多国家也都制定了相应的法规措施及检测标准。目前对孔雀石绿的检测主要有高效液相紫外或可见光检测，但这种方法灵敏度较低；另外还有液质联用，虽然有较低的检测限，但是仪器价格昂
8、贵，技术要求较高。 GB/T20361 2006 水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定高效液相色谱荧光检测法3是用硼氢化钾将孔雀石绿还原为隐色孔雀石绿，采用荧光检测器检测，这个方法大大降低了检测限，可以满足对欧盟及日本出口的条件。我们在采用国标实验过程中将发现的问题进行了总结，并简化了一些步骤。527分析检测食品科学2008, Vol. 29, No. 081 材料与方法1.1 试剂乙腈 (色谱纯 )；甲醇 (色谱纯 )；无水乙酸铵；冰乙酸；盐酸羟胺；氨水；一缩二乙二醇；二氯甲烷；对甲苯磺酸；酸性氧化铝 (粒度为 80 100 目 )；中性氧化铝小柱 (500mg， 3ml，使用前用 5ml
9、乙腈活化 )；阳离子交换柱 (PRS 柱， 500mg， 3ml，使用前用 5ml 乙腈活化 )； 孔雀石绿、无色孔雀石绿 (纯度 98%)； 0.1mol/L 硼氢化钾 (称取 0.27g 硼氢化钾溶于 50ml 水中，现配现用 )；提取液 (盐酸羟胺 3g，对甲苯磺酸 0.24g，乙酸铵 0.48g溶于 100ml 水中 )；乙酸铵缓冲溶液 (0.125mol/L：称取 9.64g 无水乙酸铵溶解于 1000ml 水中，用冰乙酸调pH 到 4.5)；乙酸铵缓冲溶液 (0.1mol/L：称取 7.71g 无水乙酸铵溶解于 1000ml 水中，用氨水调 pH 到 10)；洗脱液 (乙酸铵溶液
10、(pH10):乙腈 =1:1，临用前配制 )；标准储备溶液 (100 g/ml：准确称取孔雀石绿标准品，用乙腈配制成 100 g/ml 的标准贮备液 )；标准中间溶液 (1 g/m l：吸取孔雀石绿和无色孔雀石绿的标准储备溶液，用乙腈稀释成 1 g/ml， 18避光保存，有效期为一个月 )。1.2 仪器与设备Agilent1100 高效液相色谱 美国安捷伦公司；MMV-1000W 振摇器、匀浆机 上海安普公司； N-1000旋转蒸发仪 上海徕康有限公司； SUPELCO 固相萃取装置 广州仪科有限公司；离心机 湖南湘仪仪器公司。1.3 液相色谱条件色谱柱： WATER C18 柱 (250mm
11、 4.6mm)；激发波长 265nm，发射波长 360nm；流动相乙腈 :乙酸铵溶液 (80:20)；流速为 1.5ml/min；进样量为 50 l；柱温为 38。1.4 样品分析操作步骤1.4.1 提取准确称取 5.00g 样品于 50ml 的离心管内，依次加入10ml 提取液， 10ml 乙腈， 11000r/min 匀浆 20s，再向离心管中加入 5.0g 酸性氧化铝，振摇 5min， 4000r/min离心 10min，上清液转移至 100ml 的离心管内。另取一离心管盛 10ml 乙腈洗涤匀浆机刀头，将洗涤液并入第一离心管，沉淀物用玻璃棒捣碎，重复上述操作。上清液合并至 100ml
12、的离心管，再向 100ml 的离心管加入 2ml二甘醇， 20ml 二氯甲烷，振摇 5min，然后 4000r/min离心 10min，取下层液体至 100ml 磨口的三角瓶中，上层再加入 15ml 二氯甲烷，振摇 5min， 4000r/min 离心10min，合并二氯甲烷层， 35旋转蒸发至近干。1.4.2 净化将 PRS 柱子接到固相萃取装置上，上端接中性氧化铝柱，先用 5ml 的乙腈分两次活化柱子，转移提取液到柱上，然后用 4ml 乙腈分两次洗涤茄形瓶，每次 2ml，洗液加入 0.1ml 硼氢化钾，轻轻振摇，依次过柱，弃去中性氧化铝柱，抽 PRS 柱近干，最后用 3ml 洗脱液洗脱，过
13、 0.45 m 滤膜，供液相色谱测定。2 结果与分析2.1 硼氢化钾还原效果的探讨国标中，在鱼肉前处理过程，为了将孔雀石绿完全还原，多次加入硼氢化钾，使实验操作繁琐复杂，为了确定硼氢化钾的还原效果，根据标准孔雀石绿的线性范围的最大浓度， 3ml 定容，得出 2.4 g 孔雀石绿被还原所需要硼氢化钾的量。MG 总量 硼氢化钾 未被还原 MG 被还原 MG( g) 用量 ( g) 的量 ( g) 的量 ( g)2.4 2.4 0.360 2.042.4 12.0 0.004 2.392.4 15.0 0.00 2.402.4 24.0 0.00 2.40表1 硼氢化钾还原效果的研究Table 1
14、Reduction effect of KBH4如表 1 所示， 2.4 g 孔雀石绿被完全还原仅需要硼氢化钾 15 g，由此说明硼氢化钾的还原效果是非常好的，但硼氢化钾在酸性条件下反应产生氢气，所以在乙酸铵缓冲液体系下，还原效果很差。另外，如果硼氢化钾在对甲苯磺酸之后加入，硼氢化钾也会与对甲苯磺酸发生反应，因为对甲苯磺酸呈弱酸性。本实验，采取在浓缩后加入 0.1ml 的硼氢化钾还原，而避免在前处理酸性环境下加入，影响其还原效果，从而避免了前处理过程中多次加入的繁琐。2.2 洗脱液中乙酸铵的 pH 值对洗脱效果的影响MG的量 ( g) 0.1 0.1 0.1 0.1pH 4.5 6 8 10回
15、收率 (%) 93.1 97.9 99.2 103.5表2 不同pH值的乙酸铵对洗脱效果的影响Table 2 Effects of eluant pH on recovery rate of MG如表 2 所示，洗脱液中乙酸铵的 pH 值是相当重要的，在碱性条件下，柱子与孔雀石绿的吸附作用最弱，采用 Varian 的 PRS 柱，用 pH10.0 乙酸铵溶液效果最好。但每个品牌的柱子都有自己的特性，尽管是同一个牌子不同批次的 PRS 柱都会存在差异，所采用的洗脱液 pH值都是不同的。所以柱子使用前，先用标准品来验证一下，确定洗脱液 pH 值，这样才能保证目标物完全被洗脱下来。另外，试剂操作过程
16、中，样品过柱和洗脱时，流速不能太快，否则样品或洗脱液不能跟柱子充分的接触，导致回收率偏低。2.3 标准曲线及线性范围用孔雀石绿中间液配成标准的工作曲线浓度系列为2008, Vol. 29, No. 08食品科学分析检测5280.001、 0.01、 0.05、 0.1、 0.2、 0.5、 0.8 g/ml。以峰面积 (A)为纵坐标，浓度 (C)为横坐标，作标准曲线，求出相关系数和线性范围。曲线方程为：A=715.33212C+1.1091312，相关系数为 0.99977。孔雀石绿在 0.1 800ng/ml 范围内具有很好的线性。孔雀石绿标准工作曲线如图 1 所示。图2 孔雀石绿标准图谱F
17、ig.2 Standard spectrum of MG353025151050024 689.015荧光强度(LU)时间 (min)图3 样品加标图谱Fig.3 Spectrum of blank sample fortified with MG1086420024 689.002荧光强度(LU)时间 (min)2.4 准确度 (回收率 )准确称取罗非鱼肉、鳗鲡鱼肉、对虾肉各 25 份作为检测样品，每份 5.00g(称准至 0.01g)。其中 24 份肌肉样品中分别加入浓度为 5、 25、 250、 1250ng/ml 的孔雀石绿标准溶液 1ml，用玻棒搅匀，静置 30min，按上述前处理方
18、法和检测方法来检测，另外一份为空白对照。按照公式进行计算：回收率 (%)=(处理前加入标准样品的测定值空白测定值 )/ 添加孔雀石绿的量 100。测得的回收率及相对标准偏差如表 3 所示。样品添加水平 测定平均值 回收率 RSD( g/kg) ( g/kg)(n=6) (%) (%)1.0 1.079 107.9 9.169罗非鱼5.0 4.831 96.6 4.12150 50.650 101.3 0.967250.0 201.833 80.7 2.081.0 1.009 100.9 7.349对虾5.0 4.776 95.5 3.93250 45.575 91.2 3.000250.0 2
19、42.125 96.9 2.3151.0 1.098 109.8 7.337鳗鱼5.0 4.824 96.5 3.16950 44.600 89.2 2.433250.0 211.167 84.5 2.269表3 样品加标的回收率Table 3 Recovery of MG in spiked sample2.5 检测限的确定不同的取样量，方法的检出限也不同，本实验采用 5g 的取样量，最后 3ml 定容，以 3 倍噪音信号为最低检出浓度，求出最低检出限。标准液浓度 3 50( g/kg)检出限 0.272( g/kg)信噪比 551.63讨 论3.1 提取所用试剂分析样品前处理是在 pH 为
20、 4.5 的乙酸铵缓冲体系下用乙腈提取，同时加入对甲苯磺酸和盐酸羟胺，对甲苯磺酸促使孔雀石绿形成离子对，有利于其更好的溶出；加入盐酸羟胺是防止孔雀石绿发生变化，因为孔雀石绿及其代谢产物隐色孔雀石绿在光照、氧气和高温的条件下容易发生去甲基化和氧化降解。3.2 酸性氧化铝对提取效果的影响匀浆后要加入酸性氧化铝，再进行震荡，其作用主要是防止脂肪的溶出以及提高离心沉淀的效果。其颗粒大小和加入量会影响回收率，高油脂含量的水产品可多加一些，低油脂含量少加一些，一般为 5 10g 能确保实验效果，实验过程中，分别加入 5、 8、 10g，结每根色谱柱的填料成分以及结构都不尽相同，所以在实验前要确定最佳实验条
21、件，实验过程中通过改变流动相配比、进样量、流速三个参数，来选择最优化的参数。本实验选用乙腈 :乙酸铵溶液 (80:20)，流速为1.5ml/min，进样量为 50 l，柱温为 38，峰性较好，对称因子为 0.901，孔雀石绿标准图谱以及加标图谱分别为图 2 、 3 。图1 孔雀石绿校正曲线Fig.1 Calibration curve of MG60050040030020010000 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.87峰面积浓度 ( g/ml)65432529分析检测食品科学2008, Vol. 29, No. 08果显示没有明显差别。其大小不均或较大，则在反提
22、取时易造成乳化现象，即凝胶，使下层液体含有乳白色的糊状物质，影响下一步的旋转蒸发。实验发现，80 100 目的效果最好。但有些鱼类含脂肪比较多，酸性氧化铝不能完全控制脂肪的溶出，所以在萃取过程中，脂肪溶于二氯甲烷中，呈现乳白色糊状，且分层不明显，旋转蒸发时，由于有脂肪的存在不能够蒸干。实验操作过程中如果出现乳化现象，或者不分层，可以加一些硫酸钠，加速分层，分层以后，二氯甲烷位于上层，或者采用离心的方法来取代分液漏斗分液。3.3 样品浓缩温度的影响旋转蒸发时 45蒸得太快，孔雀石绿会被带出，影响回收率， 25蒸发的速度太慢，所以实验选择 35。旋转蒸发不能蒸太干，蒸发太干、蒸发时间太长或蒸发温度
23、太高都会导致回收率降低。另外，旋转蒸发过程中也常常会出现白色泡沫且易暴沸冲出，暴沸原因是提取液中含有一定量的蛋白质。解决办法为在提取液移入浓缩瓶前过一无水硫酸钠柱，再浓缩，如此就起到了过滤杂质的作用，同时还可吸附水分，消除了浓缩暴沸和定容的分层现象，浓缩的速度更快且不会留有残液4。参考文献：1 MEYER F P, JORGENSEN T A. Teratological and other effects ofmalachite green on the development of rainbow trout and rabbitsJ.Trans Am Fish Soc, 1983, 11
24、2 (6): 818-824.2 KEYL H G, WERTH G. Stoukfurveranderungan chromosomen durchmalachitgrunJ. Naturwissenschaften, 1959, 46: 453-454.3 G B/T20361 2006 水产品种孔雀石绿和结晶紫残留量的测定高效液相色谱荧光检测法 S.4 童玉贵 , 程 群 . 水产品中孔雀石绿检测的若干细节探讨 J. 实验室技术 , 2006(4): 28-30.5 SC/T 3021 2004 水产品中孔雀石绿残留量的测定 S.6 SN/T 1479 2004 进出口水产品中孔雀石绿残留量检测方法 S.7 GB/T 19857 2005 水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定 S.8 GB/T 20361 2006水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定高效液相色谱荧光检测法 S.
