水中总菌落数检测方法－滤膜法(niea e20557b).pdf

1、水中總菌檢測方法膜法 中華民國 102 4 月 16 日環署檢字第 1020030379 號公告 中華民國 102 5 月 8 日環署檢字第 1020037762 號函勘誤 自中華民國 102 6 月 15 日生效 NIEA E205.57B 一、方法概要 本方法係使用膜過水樣，於 35 1 以 m-HPC 培養基培養48 3 小時後，計水中好氧及兼性厭氧營菌。 二、適用範圍 本方法適用於 飲用水 及地面水體、地下水體、廢水、污水、放水之總菌檢測。 三、干擾 （一） 水樣中含有抑制或促進細菌生長的物質。 （二） 檢測使用的玻璃器皿及設備含有抑制或促進細菌生長物質。 （三） 濁過高之水樣造成膜孔

2、隙阻，或造成細菌菌瀰漫生長（ Spreading）而影響水樣檢驗的觀察及結果的判。 四、設備 （一） 筒： 100 至 1000 mL 之筒。 （二） 吸管：有 0.1 mL 刻之 10 mL 無菌玻璃吸管或無菌塑膠吸管，或無菌微吸管（Micropipet) 。 （三） 稀釋瓶：100 至 1000 mL 能耐高溫高壓滅菌之硼矽玻璃製品。 （四） 錐形瓶：200 至 1000 mL 能耐高溫高壓滅菌之硼矽玻璃製品。 （五） 培養皿：硼矽玻璃製品或市售無菌塑膠培養皿，大小為 60 15、50 12 mm 或其他適當大小。 （） 採樣容器：容 120 mL 以上無菌之硼矽玻璃或塑膠有蓋容器，或市售

3、無菌袋。 （七） 過裝置：能耐高溫高壓滅菌的玻璃、塑膠、陶瓷或鏽鋼等材質構成之無隙縫杯，藉鎖定裝置、重或磁固定於底座。 第 1 頁，共 8 頁（八） 冰箱：溫能保持在 4 2。 （九） 水浴槽：溫能保持在約 50。 （十） 抽氣幫浦：壓差宜為 138 至 207 kPa。 （十一）膜：使用直徑 47 mm、孔徑 0.45 m 且有格線的無菌膜。 （十二）鑷子：前端平、內側無波紋，使用前浸泡於 95% 酒再以火燄燃燒滅菌。 （十三）培養箱：溫能保持在 35 1。 （十四）高壓滅菌釜：溫能保持在 121（壓約 15 lb/in2或 1.05 kg/cm2）滅菌 15 分鐘以上。 （十五）高溫乾熱烘

4、箱：如用 於玻璃器皿等用具之滅菌，溫須能保持在170 10 達 2 小時以上。 （十）天平：待測物重大於 2 g 時，須能秤至 0.01 g；待測物重大於 2 g 時，須能秤至 0.001 g。 （十七）無菌操作檯：正壓式無菌操作檯或 垂直循環負壓式無菌操作檯（ Class II 生物安全櫃）。 （十八）pH 計：確達 0.1 pH 單位。用於內含瓊脂培養基之 pH 值測定時，應搭配表面電極（Surface probe ）。 五、試劑 本方法所使用的化學藥品須為試藥級以上，培養基為微生物級製品。 （一） 試劑水：導電在 25 時小於 2 mho/cm（ S/cm）。 （二） 培養基 m-HPC

5、 瓊脂培養基（或稱 m-SPC 瓊脂培養基），依下配方配製培養基，或使用市售商品化的培養基均可。 蛋白腖（Peptone ） 20.0 g 明膠（ Gelatin） 25.0 甘油（ Glycerol） 10.0 mL 瓊脂（ Agar） 15.0 g 試劑水 1 L 第 2 頁，共 8 頁將甘油以外之成份混合，以 1 N 之氫氧化鈉溶液調整 pH 值至 7.1 0.2，加熱溶解後加入甘油， 121 高溫高壓滅菌 5 分鐘。待卻至約 50 時，於無菌操作檯內分裝至無菌培養皿中，使培養基厚約 2 至 4 mm。室溫下靜置凝固後，保存於 4 2，保存期限為 14 天。可根據檢測需求，依配方比配製培

6、養基。 （三） 無菌稀釋液 1. 磷酸二氫鉀儲備溶液 取 3.4 g 磷酸二氫鉀（ KH2PO4）溶 於 50 mL 之試劑水中，俟完全溶解後，以 1 N 之氫氧化鈉溶液調整其 pH 值為 7.2 0.1。然後加試劑水至全為 100 mL ，滅菌（過滅菌或 121 高溫高壓滅菌 15 分鐘以上）後，儲存於冰箱中備用。 4 2 下保存期限為 6 個月（註 1） 。可根據檢測需求，依比配製。 2. 氯化鎂儲備溶液 取 8.1 g 水氯化鎂 （ MgCl26H2O）或 3.8 g 無水氯化鎂，先溶於少試劑水中，俟完全溶解後，再加試劑水至全為 100 mL，滅菌（過滅菌或 121 高溫高壓滅菌 15

7、分鐘以上）後，儲存於冰箱中備用。 4 2 下保存期限為 6 個月（註 1） 。可根據檢測需求，依比配製。 3. 無菌稀釋液 分別取 10 mL 氯化鎂儲備溶液和 2.5 mL 磷酸二氫鉀儲備溶液，加入試劑水至全為 2000 mL，混搖均勻後，分裝於稀釋瓶中，經 121 高溫高壓滅菌 15 分鐘以上，作為無菌稀釋液備用。如欲用於水樣稀釋，分裝之無菌稀釋液滅菌後體積須為 90 2.0 mL。 4 2 下保存期限為 6 個月（註 1）。可根據檢測需求，依比配製。 、採樣與保存 （一） 採微生物檢測之水樣時，應使用清潔並經滅菌之玻璃瓶、無菌塑膠容器或市售無菌採樣袋，且於採樣時應避免受到污染。水樣含有餘

8、氯時，應使用內含代酸鈉錠劑之 無菌採樣袋，或於無菌容器中加入適無菌之代酸鈉以中和餘氯（採取加氯之廢水時，每 第 3 頁，共 8 頁100 mL 之水樣如加入 0.1 mL 之 10% 代酸鈉，可中和之餘氯約為 15 mg/L 。採取含氯之飲用水水樣時，每 100 mL 之水樣如加入 0.1 mL 之 3% 代酸鈉，可中和之餘氯約為 5 mg/L）。 （二） 飲用水採樣前應清潔手部，出水口以火烤或以 70% 至 75% 酒消毒。所採水樣應具有代表性。 （三） 運送時水樣溫應維持在小於 10 且得凍結，實驗室內保存溫應維持在 4 2。 （四） 水樣應於採樣後 24 小時內完成水樣過步驟（七、步驟（

9、五），並置入培養箱中培養。 （五） 水樣以能做完所需檢驗為，但得少於 100 mL。 七、步驟 （一） 水樣在進檢測或稀釋之前必須劇搖晃 25 次以上，以使樣品充分混搖均勻。 （二） 視水樣中微生物可能濃範圍進水樣稀釋步驟。使用無菌吸管吸取 10 mL 之水樣至 90 mL 之無菌稀釋液中，形成 10 倍稀釋之水樣，混合均勻。而後自 10 倍稀釋水樣，以相同操作方式進一系適當之 100、 1000、 10000 倍等稀釋水樣，並混搖均勻。進稀釋步驟時，均需換無菌吸管。水樣稀釋步驟如圖 1 所示（註 2 ）。 （三） 以無菌鑷子夾起無菌膜，放在無菌過裝置之有孔平板上，小心將杯固定。加入適無菌稀釋

10、液，以測定過裝置是否配置妥當。 （四） 以無菌吸管吸取 10 mL 的原液及（或）各稀釋水樣至無菌過器中過。原液及（或）各稀釋水樣皆需進二重複。過後，再以 20 mL 以上之無菌稀釋液沖洗杯。 （五） 沖洗過後，將杯移開，儘速以無菌鑷子取出過後之膜置於培養基上。膜應與培基完全貼合，以免產生氣泡。 （） 培養皿倒置於培養箱內，於 35 1 下培養 48 3 小時 （註 3）。 （七） 欲進另一個水樣時，應換無菌過器（杯）。亦可將過器（杯）以火烤後至接近室溫重複使用。 第 4 頁，共 8 頁（八） 計各稀釋培養皿中所產生的菌並記之。菌太多造成計困難時，則以菌太多無法計 （ Too numerous

11、 to count；TNTC）表示。但各稀釋培養皿之菌均超過 200 個，則可記菌太多無法計，應選取最接近 200 個菌之同一稀釋的個培養皿進菌計 ，確實無法計時應重新採樣檢測。 （九） 步驟（二）至（五）須在無菌操作檯內操作。 八、結果處 （一） 原液及各稀釋水樣中，僅有 一個稀釋的二重複培養皿之菌均在 20 至 200 個之間，則選取該稀釋之個培養皿，以下公式計算總菌，單位為 CFU/mL (Colony forming units/mL) ： )D/()D/(YX)mL/CFU(過體積過體積體積總和選取培養皿之水樣實際和選取培養皿之菌總總菌+=註： D：選取培養皿之稀釋 X、 Y： D

12、稀釋的個培養皿之菌 （二） 結果與八、（一）所述符 ，則以下方式計算總菌： 1. 原液及各稀釋水樣中，僅有一個稀釋的一個培養皿之菌在 20 至 200 個之間，則選取該稀釋之個培養皿，以上述八、（一）公式計算。 2. 各培養皿之菌均小於 20 個，則選取菌最接近 20 個之同一稀釋的個培養皿，以上述八、（一）公式計算。 3. 各培養皿之菌均在 20 至 200 個之間，則選取菌最接近 200 個之同一稀釋的個培養皿，以上述八、（一）公式計算。 4. 有個稀釋的二重複培養皿之菌均在 20 至 200 個之間，或個稀釋各有 1 個培養皿之菌在 20 至 200 個之間，則選取個稀釋共 4 個培養皿

13、，以下公式計算： 第 5 頁，共 8 頁)D/()D/()D/()D/(YXYX)mL/CFU(22112211過體積過體積過體積過體積體積總和選取培養皿之水樣實際和選取培養皿之菌總總菌+=註：D1、D2：選取培養皿之稀釋 X1、 Y1： D1稀釋的個培養皿之菌 X2、 Y2： D2稀釋的個培養皿之菌 （三） 據表示：計算所得之總菌小於 1（含 0） ，以 1 CFU/mL表示；總菌小於 100 時，以整表示（小位四捨五入）；總菌為 100 以上時，只取位有效字（四捨五入）。 （四） 檢測紀須註明採樣時間、培養起始及終時間、培養基名稱、培養溫及各稀釋原始據等相關資。 九、品質管制 （一） 微生

14、物採樣人員及檢測人員應具備微生物基本訓及知。 （二） 每批次採樣時，應進運送空白。 （三） 每 10 個樣品應執 1 個方法空白樣品分析，每批次樣品少於 10 個，則每批次仍應執 1 個方法空白樣品分析。 （四） 用於結果計算之二重複據，其對 差值可超出密管制考範圍 （計算方式考環境微生物檢測通則細菌 （ NIEA E101）（註 4），除非二重複之菌均小於 20。 （五） 新購入之培養基，每批號均須進培養基品質測試（測試方式詳環境微生物檢測通則細菌（ NIEA E101）。 （） 本方法培養所得之細菌可能具有感染性 ，檢測後之培養基及器皿應經高溫高壓滅菌處。 十、密及準確 十一、考資 Ame

15、rican Public Health Association, American Water Works Association & 第 6 頁，共 8 頁Water Environment Federation. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 22nd ed., Method 9215D, APHA, Washington, D. C., USA, 2012. 註 1：溶液如出現物或混濁，則可繼續使用。 註 2：水樣如須稀釋，建議於稀釋後 30 分鐘內完成檢測步驟，以免造成細菌死亡或增生，影響實驗

16、結果。 註 3：培養箱底層應放置水盤，或將培養皿放置於密閉容器中培養，以避免培養前後培養基之水份散失超過 15%。 註 4：本文引用之公告方法名稱及編碼 ，以環保署最新公告者為準。 圖 1、水樣稀釋步驟 第 7 頁，共 8 頁表 1、總菌計算實明 培養皿中之菌 原液 10 mL 稀釋 10 倍 (原液 1 mL) 稀釋 100 倍 (原液 0.1 mL)總菌(CFU/mL) 考 TNTC； TNTC 175； 162 20；19 1.7102八、（一） TNTC； TNTC 59；53 6； 4 56 八、（一） TNTC； TNTC 211； 209 23；19 2.1102八、（二） 15； 3 0； 0 0； 0 1 八、（二） 2TNTC； TNTC 202； 203 18；19 2.0102八、（二） 3TNTC； TNTC 200； 198 20；25 2.0102八、（二） 4註：TNTC 表示菌太多，計困難；畫雙底線字表示用於結果計算 第 8 頁，共 8 頁