1、朱鹩的随机扩增多态DNA分析与种内亲缘关系研究+刘斌1韩之明2刘 彦2李福来1(1北京动物园北京，100044)(2北京师范大学生物学系北京100875)擅要：利用随机扩增多态DNA技术对朱鹩Nuooinia nippon 8个个体进行了随机扩增多态DNA分析。用20个lObp的随机引物对每只朱鹦的基因DNA进行扩增，共得到168个扩增片段，其中共有片段为102个。根据聚类分析所得到的树状图确定了8只朱黯的亲缘关系。这为进一步构建全部朱鹗个体的谱系关系圈打下了基础，有利于制定更有效的朱鹪保护计划。关键词：朱鹳基因组DNA随机扩增多态DNA朱鹎属鹳形目鹦科朱鹩属，是世界瞩目的濒危鸟类，已被列为国
2、家一级重点保护动物。中国自1981年在陕西省洋县重新发现世界仅存的野生朱鹦种群以来，在当地开展了一系列的保护工作。1986年在北京动物园建立了“朱鹦养殖中心”。开始对朱翳进行易地保护，并开展了“朱鹪人工饲养和繁殖基础研究”和“朱鹦增殖研究”。在这12年中，不但从野外获取的6只朱鹦全部健康成长起来，而且通过人工育雏，北京动物园朱鹦人工种群已达17只，并在不断扩大。为了保证笼葬个体更好地繁衍后代和保持遗传多样性，需要了解笼养个体间的亲缘关系，以便建立朱鹦人工种群谱系。随机扩增多态DNA(Randomly Amplified Polymorphic DNA，RAPD)技术是一种以寡聚核苷酸为机引物进
3、行聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)，然后通过观察扩增产物电泳后带形来分析DNA多态性的方法，具有快速、灵敏、简便等特点，特别适用于研究预先不了解任何分子生物学特性的种类。目前RAPD方法已广泛应用于动物遗传多样性的研究，但运用此方法研究鸟类的还比较少，尚未运用此法对朱鹦进行研究。由于未曾对朱鹩进行过分子生物学研究，故采用RAPD技术分析其种内关系是最适合的。本文首次运用RAPE)技术对8只朱鹦个体的基因组DNA多态性进行了分析，初步确定了它们之间的亲缘关系。1材料和方法11实验材料北京动物园人工饲养的8只朱鹦，肱静脉取血，分装后置一20“C冰箱备用。
4、北京市市政管理蛋员会、北京市园韩局资助项目o7612裔盐法摄取模板DNA采用珞加修改的文献2方法：在15ml离心管中吸人25pl解冻融化的血液样品，用含10mmolATrisHCl、10mmolA NaCl、3 mmoll MgCl2的RBS液(pH75)洗涤2次，1 000rmin离心(上海安亭科学仪器厂TGL一16B高速台式离心机)5min。加入4009L含10mrnol1TrisHCl、40mmol1NaCl、2mmolIEDTA、1NP一40(Sigma公司)的抽提液(pH8O)，混匀后加入蛋白酶K(Merch公司)溶液至终质量浓度D(K)=200tagrrd，55消化过夜。加入190
5、txl已预热至55的5molANaCl至终浓度为15molA，缓慢混匀，待冷至室温后，加入1倍体积的氯仿溶液(含4异戊醇)抽取10min，10 000rmin离心10min；取出上层液体再加人氯仿溶液抽提5 rain，10 000rmin离心10rain。取出上层液体加入2倍体积的冰无水乙醇，用微量移液吸头将DNA缠起，在70乙醇中洗涤后移入洁净的离心管中，空气干燥。DNA干燥后加入适量双蒸水50充分溶解。紫外分光光度计检铡聊姐含量，将样品稀释至相同浓度，分装保存于一20冰箱备用。13模板DNA的PCR反应采用略加修改的文献2的方法。131 RAPD引物实验使用20个10bp的随机引物OPCm
6、I一20(Operon公司)，其序列见表1。衰1随机SI牺及序列引骑 序列 引物 序列OPG一01 5CTACGGAGGA3 OPG一11 5TGC0口了H)GT3OPG一02 5“CK?AZACTGAGG3 OPG12 5CAGC玎=AOGA3OPG一03 5GALA3 OPG一13 5CHla)，：A3OFC-一04 SAGCGqTCTG3 OPG一14 5GGATGAGACC3OPG一05 5CTGAGACCnA3 OIK2-一15 5。ACTEOBACTC3。OFG一06 SGTGCCrACC3 OPG一16 5AG03删C岵一07 5GAA删3 C)PG一17 51GAocA3。OP
7、G 08 5TCACGq(rAC3 OPG一18 5-R3TG3OPG一09 5CTGACGTCAC3 OPG一19 5GTCA删Cb一10 5AGCG(X2GTCT3 OPG一20 5TCHCn二AG3+132 PCR反应体系 反应部体积为25td，其中含10mmolITrisHCI(pH80)，50rnmolAKCl，15mmolAMgCl2；4种dNTP各160胛nolI；随机引物8pmol；30ng基因组DNA；10单位TaqDNA聚合酶(北京鼎国生物技术发展中心)；反应混合物用20d灭菌石蜡油(Sigma公司)覆盖。133 PCR反应条件94变性50s，37复性50s，72延伸80s
8、，共进行40个循环(PCR仪为北京六一仪器厂WD9402型)。14扩增产物的琼脂糖凝胶电泳扩增产物经含005溴化乙锭的14的琼脂糖凝胶电泳，DNA分子量标准为77PBR322BstN I，电泳缓冲液为05xTBE，恒压4Vcm电泳约3h，紫外透射仪(北京科普仪器厂)上观察照片。15数据处理利用SPSSPC+软件包，采用系统聚类法(hieraehical cluster)对RAPE)结果进行分析，由获褥的相关系数矩阵(correlation similarity oofficient matrix)构建树状图(dendmgram)o2结果从RAPD结果可以看出17个随机引物已将8只朱鹦个体区别开
9、没有发现任何两个个体拥有完全相同的RAPD产物。围2 8只朱鹏基因组DNARAPD数据的遗传距离树状蠲AH：觅图1注由于国内外应用R蚶】D技术对鸟类亲缘关系的研究很少，应用于朱鹘尚为首次。本实验所用8只束鹪中有6只是从野外获取的，我们对它们之间是否有亲缘关系以及亲缘关系的远近都不了解。为了观察实验的可靠性，我们有意识地把实验范围扩大，即除了从野外获取的6只朱鹦外又增加了两只人工繁殖的幼鸟(“蓝蓝”和“天天”)，它们均为雌鸟“青青”的后代。通过对RAPD结果进行聚类分析得到的相关系数矩阵和树状图，可以确定8只朱鹘个体的亲缘关系： “欣欣”与“华华”，“天天”与“青青”，“窈窈”与“阳阳”的亲缘关
10、系较近，其次是“欣欣”与“平平”，“蓝蓝”与“天天”的关系较近。此结果显示“青青蓝蓝”和“天天”三者亲缘关系很近，这证明了应用m址，D技术对朱鹛亲缘关系研究所得的结果是可信的。衰2 OPG专l物获得的8只朱璃核DAN的RAPD裹型数据引物 乞塔 引物 个体(AH) 引物 &嚣 引物 个体(AH)0PG06oPG060P(瑚OPG06OPC070PG070pG07OPG070PG07oPG07OP删OpG070pGD70PG07OPG07OPG07oP007OpG08OPG08OPG08OPG08OPG08OPG08OPC08OPG09OPG09OPG09oPG09OPG09OPG09OPG09
11、OPG09OPG090PG090PG09oPGl0oPGlOoPGl0OPGlOOPGl0oPGl00PGl40PGl4oPGl4OPGl4唧140pGl4OPGl4oPGl4oPGl40m15oPGl5ofBl5oPGl5CB15OPGl713PGl70】G170m17OPGl7OPGl7oPGl7OPGl8OpGl8OPGl813PGl8oPGl80PGl8OPGl9C峙190pGl9OPGl90PGl9oPGl9OPGl9C疆G19oPGl9oFG200PG200PG20OPG20OPG20塑墅 !竺墨! !竺监! !堕型 !*AH见圉1注。79I111I1111l11111011l01
12、l1l町l1l11nl111il111l1111lO111O1l1l01l111lUii；i；i】i】，】，Pl【I篇篇篇竺=器揣篇篇怒裟怒裟怒黜lllll11ll11ll11111l0lDll11】1】i】，ii【0)l1l1l11111l111ll11111C】1】1】(，】1iHii【I【，1111l1ll11l1l1ll1l1O10111ll1l】11】“r=矾怒裟怒船裟高怒裟怒裟器=蒿=怒=罴黼赫赫燃瓢燕黼戮赫瓣瓣=黧罴=罴盂篇罴罴=焉黧黧黧黧=黧=一nnu“nnnn“儿nnnnnn叭加nu腻脱川吼川n川n叫nn裟黜怒嚣=勰嚣茹裟怒勰裟篇怒裟燃黼黼罴黼黼黼燕黼瓣慕溅然黼黼瓣戮黼戮黼黼
13、黼瓣燃燃墨=黧慧罴黧茹器=黧=嚣嚣嚣慧=罴罴罴一襄3 8只朱鹅基固组DANRAPI)数据的相关系数矩阵*AH见田1注o1981年在中国陕西省洋县重新发现朱鹦后，在陕西朱鹦保护观察站对自然界种群进行保护的同时，还于1990年成立了陕西朱鹳救护饲养中心，对朱鹩进行救护饲养及人工繁殖。随着朱鹘数量的增加，也发现了残疾幼鸟的连续出现，我们认为近亲繁殖是出现此类现象的主要原因，而近交衰退的存在将对种群长期存活具有决定性的影响。遗传漂变使种群每个世代损失1(2M)的遗传多样性(N。为有效种群大小)，雨小种群的基因突变率比损失率低几个数量级。由于北京动物园的笼养朱鹦个体仅有17只，均为从野外获取的6只朱鹦的
14、子1代而子2代尚未诞生。这个小群体的频繁近交会导致这些朱鹦后代生活力和生殖潜力的下降，以及遗传多样性的大量丧失。我们可以应用RAPD技术来确定所有笼养朱鹳个体的谱系关系，然后选择亲缘关系较远的子1代个体配对，这样既可以维持群体的杂合度，又有利于后代的存括和繁殖。由于最初发现朱鹦时未能对各巢区的离巢幼鸟进行环志，所以现存朱鹦间的谱系关系比较混乱。我们还可应用RAPD技术进一步研究野生朱鹗种群和陕西朱鹊救护饲养中心人工种群，确定它们之间的谱系关系。然后每年有计射地把人工繁殖的雏鸟与野生雏鸟进行交换，或者陕西朱鹦救护饲养中心与北京动物园繁殖中心互相交换幼鸟。这样既可使朱鹪种群基因库进行交流，又可试验
15、和研究人工繁殖的朱鹪在野生环境中的生存能力为将来人工种群的野化放飞奠定基础。这个策略可以为保护濒危野生动物提供有用的借鉴。主要参考文献李福来，刘斌史森明等1994朱鹞迁地保护研究生物多样性，2(1)：2428|hSM，Rhymer JM，Heekd DG population differentiat曲in ranckmaly anplifiedpolymorphic DNA of redcochdedwoodpeckers Pitdes boreatisMol E耐t994。3；581595F1dher RC，Fuller G，Ld遮DB Genetic structure of曲dang叮
16、ed clapper mll(Rallus Longir唧tris)populations in southernCaliforniaConseru Bi011994。9(5)：1234-1234N峨r JR Goto RM，Led迫DB吐81 RAPD nmlysis r删钮k low g曲etic variability in the dd蛐gHed lightfooted claOoerr“l似Ecot 19965(4)：463472SambrookJFriteeh ES。Maniatis T Molecular cbniI】g：A hbora幻ry rmnual 2nd ed New
17、York：Cold Spring HarborLdJoratory Press，1989hr小R，脚岫hGFEffective population size，genetic variation，and tuze in附t啪mMnIn：SouleMEed碥出e pc口ularion for eonsel-tion姆Univesity Press，1987。87-123RANDOMLY AMPLIFIED PoLYMORPHIC DNAANALYSIS AND THE INTRASPECIFIC RELATIONSHIPOF RESTED IBIs(NIPPONIA NIPPON)IJu Bin
18、l Han zhi坷I谚Liu Yan2 Li Fulail(1BeijingZoo，Beijing100044)(2 Department ofBiotoaS，Beljing Normal Uniuersity，Beijing，100875)Abstract：Randomly amplified polymorphic DNA(RAPD)was used to investigate geneticrelationships of 8 crested ibises(Nipponia nippon)Twenty arbitrary primers were used toamplify gen
19、omic DNA of each ibisAmong them，17primers had clear and distinct RAPDpatterns in each amplification168 amplified fragments were generarted by RAI D and 102fragments were shared bv the 8ibisasHierachical dtaster analysis of出e RAPD data was used tocaIculate the similarity coefficients by spinpc+progra
20、mmeBased oil the correlation similaritycoefficient matrix，a dendrogram wag constructedThe dendrogram indicates the relationships ofthe 8 crested ibisesThis study provides the basis for constructing the relationship dendrogram ofall individuals，which is hd#uI in working out a better conservation planKeywords：Nipponia nippon，genomie DNA，randomly amplified polymorphie DNA
