磷脂酶c 与生殖.pdf

1、第 10 卷 第 7 期 中华男科学杂志 Vol. 10 No. 72004 年 7 月 National Journal of Andrology Jul. 2004综 述磷脂酶 C 与生殖顾爱华 综述 ; 周作民 , 沙家豪 审校(南京医科大学生殖医学实验室 , 江苏 南京 210029 )摘要 : 磷脂酶 C(PLC)是磷脂酰肌醇信号转导途径中一个关键酶。目前确认的哺乳类 PLC 共有 PLC2 、 PLC2 、 PLC2 、 PLC2 和最近新发现的 PLC2 5 种亚型 ,12 种同工酶。不同亚型的结构、调控和组织分布各有差异。 PLC 在调控信号转导通路中的特性使其在顶体反应、卵子

2、激活中发挥了巨大的作用。本文综述了 PLC 家族 5 种亚型的结构、调控机制及 PLC在男性生殖领域的相关内容 ,包括 PLC引起卵子发生 Ca2 + 振荡、激活卵子、促进胚胎发育等 ,并进一步探讨了 PLC在临床上可能的应用前景。关键词 : 磷脂酶 C ; 信号转导 ; 顶体反应 ; Ca2 + 振荡 ; 精子因子中图分类号 : Q492 ; Q55 文献标识码 : A 文章编号 : 100923591 (2004) 0720538205 Phospholipase C and ReproductionGu Aihua , Zhou Zuomin , Sha JiahaoLaboratory

3、 of Reproductive Medicine , Nanjing Medical University , Nanjing , Jiangsu 210029 , China ( Gu AH , ZhouZM , Sha JH)Correspondence to : Sha JiahaoAbstract : Phospholipase C ( PLC) is a key enzyme in phosphatidyl inositol turnover during signal transduction. The 12 mammalian PLCisozymes identified to

4、 date can be divided into five subtypes , 2type , 2type , 2type , 2type and 2type , with extensive difference in structure ,regulatory mechanism and tissue distribution. PLC plays important roles not only in sperm acrosome reaction but also in egg activation. Thepresent studies are reviewed on the s

5、tructure , regulation and function of PLC , especially its function in male reproduction , including triggeringCa2 + oscillations in eggs to activate the eggs and helping embryo development. And the prospect of the clinical application of PLC is discussed.Natl J Androl , 2004 , 10 ( 7) : 5382542Key

6、words : phospholipase C ; signal transduction ; acrosome reaction ; Ca2 + oscillations ; sperm factor磷脂酶 C (phospholipase C , PLC) 是磷脂酰肌醇信号转导途径中一个关键的酶。当机体内激素、神经递质、生长因子等分子激活其受体时 ,导致 PLC水解磷脂酰肌醇 24 ,52二磷酸 PI(4 ,5) P2 产生 2 种第二信使 三磷酸肌醇 (inositol triphosphate , IP3)和二酰甘油 ( diacylglycerol , DAG) 。 IP3 引起胞内

7、Ca2 +动员 ,而 DAG则激活蛋白激酶 C ( PKC) 。由于PI(4 ,5) P2 直接调控细胞的许多功能 ,如细胞骨架重构、胞吐作用和细胞通道活性等 ,因而通过 PLC 等酶类来严格调控 PI(4 ,5) P2 ,对于维持机体内环境稳定是很必要的 1 。近年来研究表明 ,PLC 在男性生殖领域中也具有十分重要的作用。835 收稿日期 :2003212212 ; 修回日期 : 2004204209基金项目 : 国家自然科学基金 (30170485) ,国家 973 项目 ( G1999055901)作者简介 : 顾爱华 (19772) ,女 ,江苏南京市人 ,硕士研究生 ,从事组织胚胎

8、学及生殖医学专业。通讯作者 : 沙家豪 1995-2004 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.1 PLC的结构、调控及组织分布目前 ,在哺乳类已确认 12 种 PLC 同工酶 ,根据其不同的结构和调控机制分为 5 大类 : 、 、 、 和最新发现的 PLC2 ,PLC2 有 1 4 4 种亚型 ,PLC2 有 1 和 2 2 种亚型 ,PLC2 有 1 4 4 种亚型 2 。根据酵母菌、粘菌等一些低等真核生物仅含有单一的 亚型 ,不难推测较高等真核生物中出现的 PLC2 、PLC2 、 PLC2 亚型是由

9、PLC2 原型进化而来 3 ,但植物中存在 PLC2 提示其在进化中似乎更早于 PLC2亚型 4 。 PLC各亚型的进化关系如图 1 所示。1. 1 PLC的结构 PLC 分子为单链结构 ,每种 PLC同工酶都包括保守结构域和不同亚型间的特殊结构域。图 1 PLC各亚型的进化Figure 1. Dendrogram illustrating phylogeny of mammalian PLC se2quences1. 1. 1 保守结构域 包括 C2 结构域、 EF 手型结构域和 PH 结构域。还有两个高度保守的催化结构域 ,分别称为 X区和 Y区。X、 Y区域 各含有约 170 个、 26

10、0 个氨基酸残基。不同亚型间 XY 区的序列同源性为 33 %43 % ,同一亚型间同源性高达 79 %。当酶蛋白折叠后 ,此两区靠近形成催化活性中心 5 。PH结构域 位于 PLC 的氨基末端 ,约含 100个氨基酸残基。 PH 结构域多存在于膜表面相关蛋白 ,因而它可能具有链接结合作用 ,将信号蛋白拴系到膜表面 3 。EF手型结构域 位于 PH、 X 区之间 ,它含有螺旋 2环 2螺旋结构 3 。 EF 手型结构即 Ca2 + 结合区域 ,其形态结构类似人手拳头伸开示指与拇指 ,E 螺旋相当于示指 , F 螺旋相当于拇指 ,两者伸出成直角 ,其根部弯曲的中指相当于螺旋之间的环 ,Ca2 +

11、 正好位于 3 指形成的凹陷中 ,因此可以牢固、特异地结合 Ca2 + ,为向下游传递信号打下良好的基础。 EF手型结构紧邻 X、 Y催化结构域 ,似乎不仅起到 Ca2 +的“调节开关”作用 ,更有可能是酶的催化核心的组成部分。已证实 ,该区域缺失可导致哺乳类 PLC2 1活性的完全丧失 6 。C2 结构域 位于 Y结构的羧基末端下游部分 ,约 120 个氨基酸残基长度。在 PLC2 中 ,被认为与 Ca2 + 结合有关。 PLC2 、 的 C2 结构域羧基端序列较短 ,行使某种识别或调控功能 ;而在 PLC2 (13)中 ,C2 与羧基端延伸结构形成的 450 个残基的尾序列 ,通过 C2

12、结构域特定结合到 GTP2 q 部位 ,被 G蛋白亚基激活 3 。1. 1. 2 特殊结构域 同亚型的磷脂酶有其特殊的功能结构域 。如 : PLC2 亚型包括另一 PH 结构域 ,被 SH结构域分成两半。 PLC2 在 Y区结构域下游有较长的尾序列 ,而此序列在 和 亚型是极短的 ,甚至是不存在的。 PLC2 的结构比较特殊 ,最近发现人的 PLC2 有相对分子质量 ( Mr) 分别为 260 000和230 000 的选择性剪接序列 7 ,8 。 PLC2 氨基末端有Ras 鸟嘌呤核苷酸交换因子 (Ras2GEF) 样的结构域 ;羧基末端有 Ras 结合位点 RA , Mr为 260 000

13、的序列有 1 个 RA 结构域 , Mr为 230 000 的序列有 2 个结构域 RA1 和 RA22 。而 PLC2 是否含有 PH 结构域和 EF 手型结构域 ,还存在争议 1 ,2 。新发现的PLC2 是 PLC 家族中最短的 1 种亚型 ,其结构特点是缺少 PH结构域 4 。1. 2 PLC的调控机制 PLC 家族不同亚型间的结构各异 ,从而启动不同的调控机制 , 实现其在信号转导通路中复杂、精密、各异的调控功能。 PLC2 亚型的调控是通过与 G蛋白耦合实现的 9 ,而 PLC2亚型的调控作用与蛋白酪氨酸激酶 ( PTK) 有关。细胞受到刺激后 ,受体酪氨酸激酶 ( TK) 活化

14、,它特异性地识别含 SH2 结构域的蛋白质 (包括 PLC2 和PI3K激酶 ) ,并将蛋白质序列中的酪氨酸磷酸化 10 。PLC2 亚型的调控机制还不明确 ,但它是 PLC 家族中对 Ca2 +最为敏感的亚型 2 ,11 。 PLC2 亚型主要受G蛋白家族 G 12 与 Ras 的调控 ,这与它特殊的 Ras2GEF、 RA 结构域密切相关。新发现的 PLC2 的作用与 IP3 有关 ,其调节机制有待进一步研究。1. 3 PLC 的组织分布 Northern 印迹、 Western 印迹及免疫组化分析结果显示 ,PLC 广泛分布于机体各组织 ,见表 1。PLC2 多分布于神经系统 ,在卵子中

15、也有表达。基因敲除的 PLC2 12/ 2小鼠多死于癫 发作 ,而 PLC2 42/ 2小鼠则出现明显的视觉缺陷及共济失调的鸭步。 PLC2 在脑、肺及一些肿瘤 (乳癌、结肠直肠癌 )935第 7 期 顾爱华 等 磷脂酶 C与生殖 1995-2004 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.中高表达 ,与 亚型一样 ,在卵子中也可发现 PLC2 。 PLC2 还广泛存在于胚胎 ,尤其是背主动脉及四肢。基因敲除的小鼠显示 PLC2 与胚胎发育及免疫系统相关。 PLC2 在脑、心、肺、骨骼肌及睾丸中广泛表达。 PLC

16、2 2/ 2雄鼠出现明显的不育或少育 ,提示其与生殖功能相关 1 。而 PLC2 仅特异分布于睾丸组织 19 。表 1 人 PLC各亚型的组织分布与功能Table 1. The tissue distribution and function of human PLC isozymesIsozyme Locus Distribution Function in the knockout micePLC2 1 20p12 Brain(cerebrum ,hippocampus) ,adrenal gland ,lung ,parotid gland Inducing epilepsy (inhi

17、bitory neuron) 12PLC2 2 15q15 Hematopoietic cells (neutrophil , platelet) Chemoattractant2induced superoxide production13PLC2 3 11q13 Brain , liver , parotid gland , platelet 2opioid2mediated response 14PLC2 4 20p12 Brain (cerebellum , retina) Visual response 15 ,ataxia 12 PLC2 1 20q12213. 1 Lung ,

18、thymus , brain (neuron) Embryonic lethality16PLC2 2 16q24. 1 Spleen , thymus , lung B cell development 17PLC2 1 3p22221. 3 Brain , heart , lung , testis , skeletal muscle , spleen unknownPLC2 2 2p Brain unknownPLC2 3 17q21 Skeletal muscle , heart , brain unknownPLC2 4 2q35 Testis , brain , skeletal

19、muscle Acrosome reaction in sperm18PLC2 10 Lung , liver , heart , skeletal muscle unknownPLC2 12p12 Testis Fertilization , egg activation and embryo development 192 PLC与生殖的相关性2. 1 在精子顶体反应中的作用机制 当获能精子接近或结合透明带 ( ZP) 时 ,会发生顶体反应 (acro2some reaction ,AR) ,释放精子顶体内的水解酶 ,支持精子穿过放射冠和 ZP ,直至与卵子融合完成受精。由于精子 AR 过

20、程与体细胞的胞吐作用相似 ,可以将体细胞的信号转导机制 ,尤其是 PLC 介导的信号转导通路引入 AR 的研究。多数学者认为精子膜上至少存在两类透明带受体 ( RZP) 20 ,一类是激活PLC2 1 的 Gi 蛋白耦联受体 ;另一类是与 PLC2 耦联的受体。 ZP3 与 RZP 结合并使受体激活 ,启动了 PLC介导的信号转导通路。前者通过调节腺苷环化酶(AC) ,提高细胞 cAMP 水平 ,由此激活蛋白激酶 A(PKA) ,进而激发蛋白酪氨酸磷酸化作用 21 。激活的 PKA 还作用于顶体外膜的电压依赖 Ca2 + 通道 ,使顶体内钙库的 Ca2 + 释放 22 。低浓度释放的 Ca2

21、+ 激活 PLC ,再催化 PIP2 降解为 DAG和 IP3 ,打开精子质膜上的电压依赖钙通道 ,IP3 也可参与释放胞内存储的 Ca2 + ,进一步提升 Ca2 + 浓度 ,引起第二个胞内Ca2 + 浓度高峰 23 。精卵的最初识别激活了 PLC 介导的信号通路 ,通过第二信使 IP3 和 DAG的级联放大作用 ,迅速提升精子细胞内的 Ca2 +浓度 ,最终导致了 AR20 。Fukami 等 18 证实 ,在 ZP 介导的 AR 中 ,精子中的 PLC2 4 起到了关键的作用。该实验敲除了小鼠体内编码 PLC2 4 亚型的第 2 5 个外显子 ,建立了PLC2 42/ 2小鼠模型。 PL

22、C2 4 基因的敲除并未影响PLC其他亚型的表达 ,但导致 PLC2 4 蛋白在睾丸、附睾、精子的缺失。 PLC2 4 + / + 和 PLC2 42/ 2小鼠外表均健康 ,并且组织学检查显示后者在脑、肝、肾、心脏等器官并无显著异常 ,然而 PLC2 42/ 2小鼠的生育能力却遭受了严重的损害 ,雄性尤甚。表现在小鼠杂交实验中 ,雄性 PLC2 4 + / 2与雌性 PLC2 4 + / 2受孕率为90 % ;雄性 PLC2 4 + / 2与雌性 PLC2 42/ 2为 77. 8 % ;而雄性 PLC2 42/ 2与雌性 PLC2 42/ 2则是 35. 2 %。另外 ,在与正常卵子的体外受

23、精 ( IVF) 实验中 : PLC2 4 + / + 精子组 ,6 h 内 97. 7 %的卵排出第二极体 ,24 h 内 92. 3 %的卵进入 2 细胞期 ;PLC2 42/ 2精子组 6 h 内 7. 5 %的卵排出第二极体 ,24 h 内 56. 9 %的卵进入 2 细胞期。但是在卵细胞胞质内单精子注射 ( ICSI) 实验中 , PLC2 4 + / +与 PLC2 42/ 2两组的第二极体、 2 细胞的生成几乎相同。这提示了 PLC2 4 是通过 ZP 而影响受精的。进一步将 ZP 与精子共孵育 15 min 后 ,正常精子有 45. 3 %发生 AR ,而 PLC2 42/ 2

24、组仅有 16. 3 %经历了AR。表明 PLC2 4 在 ZP 介导的 AR 及精卵融合中发挥重要作用。2. 2 可能为 “精子因子” 20 世纪 70 年代 ,在海胆045 中华男科学杂志 2004 年 7 月 第 10 卷 1995-2004 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.和脊椎动物中就已证明卵子激活是其胞内 Ca2 + 库动员的结果 ,Ca2 + 信号的传播在卵子激活中起十分重要的作用。哺乳动物受精时 ,精子激活卵子引起卵子胞内发生持续数小时的反复性的短暂的 Ca2 + 浓度升高 ,这就是 Ca2

25、 + 振荡。通常 ,未受精卵子胞质中的Ca2 +浓度维持较低水平 (1027 1028 mol/ L) ,而胞内钙库的 Ca2 +浓度高达 1 mmol/ L ,为明确受精后卵细胞内 Ca2 + 浓度升高的原因 ,生殖生物学家进行了不懈的努力。研究显示 ,哺乳动物精子胞质提取物中存在某些可溶的蛋白因子 ,生物学家称为精子因子(sperm factor ,SF) ,卵内注射这些 SF 可使卵子发生Ca2 + 振荡 ,与受精引起的 Ca2 + 振荡极为相似。而此SF 在海胆、蛙的卵子中同样引起 Ca2 + 释放和 IP3 的升高。近年的实验资料表明 ,SF 具有肌醇特异性的PLC活性 ,可以在较低

26、的 Ca2 + 浓度下水解 PI (4 ,5)P224 ,25 。受精时 ,精子中的 PLC 活性经检测比其他组织内 PLC要高出两个数量级 ,并且只需单个精子就能提供足量的 PLC 来引起 Ca2 + 振荡 26 。而这种振荡又可以被 PLC的特异性抑制剂 U73122 所抑制。“精子因子”显微注射爪蟾卵时 ,可以检测到 IP3 和Ca2 + 浓度的明显升高 27 。这一切都支持了 PLC 可能是 SF 的假设。但也有实验表明 ,猪精子提取物的确存在 PLC2 、 、 亚型 ,只是该提取物过层析柱分离后 ,没有一种亚型能引起卵子内的 Ca2 + 振荡。PLC2 3、 4 及重组的 PLC 4

27、2Alt1 ,包括近年发现的PLC2 均不能引起 Ca2 + 振荡 ,由此看来 ,SF 似乎不包括任何已知的 PLC28 。究竟 PLC是否为“精子因子” ,它的哪种亚型组成“精子因子” ,一直是近年来研究的热点和争论的焦点。2002 年 ,有人在小鼠睾丸中发现了一种新的精子特异的 PLC 亚型 ,即 PLC2 4 。它缺少 PH 结构域 ,是 PLC 家族中最短的一个亚型。小鼠 PLC2 卵内注射引起的 Ca2 + 振荡与受精时相似 ;而精子提取物内去除了 PLC2 ,Ca2 + 振荡不能发生 ;另外 ,单个精子中 PLC2 的含量足以激活卵子完成 Ca2 +振荡以及其后的早期胚胎发育 ;但

28、 PLC2 亚型切除了 PH结构域并无上述功能。说明 PLC2 是结构和功能独立的新型的PLC ,很可能是科学家一直寻找的“精子因子” 4。目前 ,实验分离得到人和猿猴的 PLC2 的全长序列 ,与小鼠 PLC2 相比 ,3 者序列结构高度保守 (人与猿同源性 90 %以上 ,人与小鼠 70 %以上 ) 19 。这正解释了灵长类精子的 PLC2 能引起啮齿类动物卵子发生 Ca2 + 振荡的原因 ,同时也满足“精子因子”能激活许多异种卵子的特性。进一步研究显示 ,人类 PLC2 仅在睾丸特异表达 ,在精子提取物中极易检测到。人 PLC2 引起振荡的最小量为 0. 02 0. 2 g/ ml ,较

29、猿猴及小鼠低了 1 2 个数量级 ,表明人 PLC2 的酶活性更强 19 。推测原因 ,主要是结构基础和环境因素决定的。结构上 ,人类 X2Y连接序列更短 ,减少了氨基酸数目 ,导致了等电点的改变 (小鼠 5. 3 ,猿 7. 8 ,人 9. 3) ,从而改变酶的活性。另一方面 ,人类卵子体积较小鼠卵大得多 ,精子 PLC2 浓度被稀释 ,自然要求其酶活性显著提高。PLC2 的生理学活性不仅体现在受精、卵子激活方面 ,它对胚胎发育也有不可忽视的作用。适量的PLC2 浓度促进卵子分裂 ,有利于早期胚胎向囊胚期发育。而高浓度的 PLC2 会引起 Ca2 + 振荡频率过高 ,虽可激活卵子 ,却导致胚

30、胎发育停滞在 2 细胞期 ,最终引起胚胎的死亡或培育后期的发育异常 4 。这一发现增进了人们对生命科学理论的认识。3 展望PLC作为磷脂酰肌醇信号转导途径中一重要的酶 ,其分类、结构、调控机制以及功能一直是生物学家普遍关注的领域。近年来 , PLC 各亚型的相继发现 ,丰富了人们对 PLC家族的认识 ,尤其是 PLC在男性生殖领域的深入研究 ,不仅揭示了 PLC 在 AR、卵子激活中的作用机制 ,更揭开了科学家研究了多年的“精子因子”的神秘面纱。PLC2 的发现及功能研究提示其在受精、卵子激活及其后的胚胎发育中的重要作用。临床上 ,合理应用人类 PLC2 ,对于提高 IVF、 ICSI及核转移

31、技术的卵子激活率将带来根本性的改变。 PLC2 的发现也有助于诊断由于缺乏 PLC2 基因或该基因缺陷导致的男性不育。既然确定了精子的 PLC2 蛋白与男性不育有关 ,我们可进一步研究此蛋白在精卵激活中的作用 ,及其对男性生殖功能的调节机制。相信不久的将来 ,男性避孕药的革新策略及胚胎干细胞治疗男性不育的新疗法 ,都会随着对 PLC 的研究进展而变得可能。参考文献1 Fukami K. Structure , regulation , and function of phospholipase CisozymesJ . J Biochem , 2002 , 131(3) :2932299.2

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