1、传染性单核细胞增多症患者不同标本 EBV-DNA检测的临床价值 陈世知 谢运兰 梅严花 庄稚佳 重庆医科大学附属第二医院检验科分子诊断中心 摘 要: 目的 探讨血浆、外周血单个核细胞 (PBMC) 、咽拭子的EBV-DNA载量对 16岁以 上传染性单核细胞增多症 (IM) 患者的诊断价值。方法 回顾性分析 130例16 岁以上疑似IM患者血浆、PBMC和咽拭子3种标本 EBV-DNA载量检查结果。结果 61例临床和实验室确诊 IM中, 血浆标本检出 16例, EBV-DNA检出率为 26.22%;31例检测PBMC 的患者 EBV-DNA检出率为 61.29%;37例咽拭子 EBV-DNA 检
2、出率为83.78%。血浆、PBMC、咽拭子以一项或多项阳性为依据的联合检测, EBV-DNA 检出率100.00%。结论 通过血浆、PBMC、咽拭子EBV-DNA的联合检测可 提高16 岁以上IM阳性检出率, 为临床提供更多的病原学诊断和治疗依据。 关键词: 传染性单核细胞增多症; 血浆; 外周血单个核细胞; 咽拭子; 作者简介:陈世知, 女, 副主任技师, 主要从事临床分子诊断工作研究。 Clinical value of different samples of EBV-DNA detection in patients with infectious mononucleosis CHEN
3、 Shizhi XIE Yunlan MEI Yanhua ZHUANG Zhijia Molecular Diagnostic Center, Department of Clinical Laboratory, Second Affiliated Hospital of Chongqing Medical University; Abstract: Objective To investigate the diagnostic value of plasma, peripheral blood mononuclear cell (PBMC) and throat swab EB virus
4、 (SBV) load in the patients with infectious mononucleosis (IM) aged over 16 years old.Methods The detection results in 130 patients with suspected IM aged over 16 years old of 3 different samples of plasma, peripheral blood mononuclear cell (PBMC) and throat swab EB virus (SBV) load were analyzed re
5、trospectively.Results Among 61 cases of IM verified by clinic and laboratory, 16 cases of IM were detected by plasma sample, the detection rate of EBV-DNA was 26.22%;in 31 cases of PBMC detection, the EBV-DNA detection rate was 61.29%;in 31 cases of throat swab detection, the EBV-DNA detection rate
6、was83.78%.The EBV-DNA detection rate of the combined detection with one indicator or multiple indicators positive of plasma, PBMC and throat swab as the basis was 100.00%.Conclusion The combined detection of plasma, PBMC and throat swab can improve the positive rate in the patients with IM aged over
7、 16 years old, which can provide more bases for pathogenic diagnosis and treatment for clinic. Keyword: infectious mononucleosis; plasma; peripheral blood mononuclear cell; throat swab; 传染性单核细胞增多症 (IM) 是由EB病毒 (EBV) 引起的急性感染性疾病, 有 发热、咽峡炎、淋巴结肿大、肝脾肿大、肝功损害、皮疹等临床特点, 儿童多见, 我国35岁儿童EBV有一定自限性, 成人IM绝大多数有高热, 可持
8、续23周, 以 多系统损害为主, 绝大多数除有上述症状外, 可并发间质性肺炎、肝炎、心肌炎 或胃肠道出血等, 皮疹分布在躯干缺乏特异性表现, 数目较少, 一般在病程 1 周以后出现, 易误诊为药疹, 症状与体征的多样性和不典型性使临床误诊率较 高1。传统的实验室诊断检测方法变异范围大, 难以实时反映EBV 存在的真实 情况。 随着荧光定量聚合酶链反应的普及, 病毒核酸的检测以其采样方便, 检测 方法简单、快速、灵敏、可靠的特点在临床上广泛应用, 为病毒感染性疾病的诊 断治疗提供了可靠的病原学依据, 同时也提高诊断的准确率2-3。研究者通过 回顾性分析130例 16岁以上疑似IM患者血浆、外周血
9、淋巴细胞 (PB-MC) 及咽 拭子标本EBV-DNA的载量, 以评价不同标本类型检测结果的临床价值。 1 资料与方法 1.1 一般资料 选取2013 年4月至 2016年9月重庆医科大学附属第二医院住院收治临床确诊 IM病例 61例 (病例组) , 男32例, 女29例, 年龄1659岁, 非EBV 感染相关 疾病69 例 (对照组) , 男34例, 女35例, 年龄1661岁。病例组和对照组间性别和年龄比较差异无统计学意义 (P0.05) 。诊断标准: (1) 具有典型临床表 现和体征, 如发热、咽峡炎、淋巴结肿大、肝脾肿大、皮疹等; (2) 外周血常规 变异淋巴细胞大于 10%; (3)
10、 EBV衣壳抗原 IgM (EBV-VCA-IgM) 阳性。 (1) 中 任何3 项且同时具备 (2) 、 (3) 中的任一项即可诊断3。 1.2 方法 1.2.1 标本采集 患者均于清晨空腹采集静脉乙二胺四乙酸 (EDTA) 抗凝血2mL, 用天津灏洋人 淋巴细胞分离液分离 PBMC, 离心分离血浆, 咽拭子 (尽量多的采集两侧腭弓、 咽部及扁桃体上的上皮细胞和分泌物) 用1mL 生理盐水洗脱, 离心取沉淀, 再 次用生理盐水洗涤离心, 取沉淀-20保存待检。 1.2.2 DNA 提取 采用北京鑫诺美迪 EBV核酸定量检测试剂盒, 提取方法按试剂盒说明书进行。 1.2.3 荧光定量聚合酶链反
11、应 按上述试剂盒扩增, 包括阳性标准品、 临界阳质控品、 阴性对照品, 阳性对照品, 以EBV 基因组 BamH1W 基因 (EBV复制特异基因) 设计特异性引物和探针4-6, 荧光探针序列为FP5-TGT CTT GGC CCT GAT CCT GAG-3。引物序列为 F5-CGG CAG TGG ACC TCA AAG AAG-3, P5-AGG ACG AGG ACG AGG AGG CGG AAG A-3。 扩增条件:尿嘧啶-DNA 糖基化酶反应372min, 953min 预变性, 然后 9415s6035s 共40个循环, 最后251 min。样本DNA核酸纯化之后, 使 用百乐C
12、FX96荧光定量聚合酶链反应仪定量检测各样本的 EB-DNA拷贝数, 检测 步骤、结果判断, 以及质控方法按试剂盒说明。该试剂盒灵敏度为 1.010copies/mL, 结果判断:定量结果大于 500copies/mL为检出。 1.3 统计学处理 采用SPSS22.0 软件进行统计分析, 计量资料组间比较采用 t检验, 率的比较采 用检验。检验水准 =0.05, P0.05) 。3种类型标本联合检 测EBV-DNA检出率分别与血浆、PBMC比较差异有统计学意义 (P0.05) 。 表1 两组临床标本的 EBV-DNA检出率比较 下载原表 表2 3 种标本在 IM 不同并发症中EBV-DNA检出
13、率比较 下载原表 3 讨论 EBV属于 -疱疹病毒亚科淋巴浅隐病毒属双链 DNA病毒, 嗜淋巴细胞性, 又名 人类疱疹病毒4型。EBV感染时DNA可呈线性并复制, 宿主细胞裂解, 引起特异 性细胞毒T淋巴细胞 (CTL) 的免疫应答, CTL 的免疫应答为EBV感染后临床症 状的主要原因, 也可以为潜伏状态, 病毒基因组两端的末端重复序列相互连接 形成环状游离体, 病毒 DNA环化后, 迅速进入潜伏期, 并随宿主细胞复制而复 制, 在机体免疫功能降低或使用免疫抑制药物的情况下再发感染;少数情况下, 出现缺损性感染, 在感染细胞中可以发现不完整的病毒基因组, 并能够利用细 胞间的传递方式进行扩散
14、。EBV主要感染口咽部上皮细胞和 B淋巴细胞, 也可引 起肺炎、非嗜肝病毒性肝炎, 严重的可引起嗜血细胞综合征。对免疫缺陷者可感 染T淋巴细胞、平滑肌细胞等。通过唾液、飞沫、输血传播等方式传播, 其中接 吻是主要的传播方式。 成人IM 初期症状与普通病毒感冒症状差异不大, 由于患者的免疫功能、自觉症 状与耐受程度不一样, 患者初次就诊的时间上存在较大的差异。临床上 EBV-DNA 检出率各不相同7-9。本研究发现, IM的整个进程中咽拭子的 EBV-DNA拷贝数 检出率较高, 检出率为83.33%, 虽然慢性持续性EBV感染病例咽拭子也可检出, 但拷贝数相对较低10。外周血EBV-DNA检出率
15、为 26.22%与于谨铭等11研究 结果相同。咽拭子的 EBV-DNA检出率明显高于血浆, 结果与陈晓宇等7报道一致。这与EBV首先侵入口咽部上皮细胞、唾液腺的管状上皮和扁桃体隐窝, 并不 断增殖浸润有关。PBMC 的EBV-DNA检出率66.67%高于血浆, 结果与杨柳等8 研究结果一致。可能与局部细胞裂解释放的 EBV颗粒感染上皮细胞下循环内的 B 淋巴细胞, 感染的 B淋巴细胞随后进入全身血流和整个淋巴网状系统相关。 发生嗜血细胞综合征和EBV引起的非嗜肝病毒性肝炎的患者血浆的EBV-DNA检出 率为50.00%, 比未发生的患者高。可能与这些患者的感染细胞裂解的程度比未 发生者严重,
16、病毒释放入血较多有关。3种类型标本联合检测对于 EBV 感染引起 的非嗜肝病毒性肝炎的 EBV-DNA检出率达到 100.00%。建议不明原因的肝炎患者 同时送检3种类型标本以明确是否 EBV感染导致。由于标本量的限制, EBV引起 的肺炎和嗜血细胞综合征因未送检咽拭子和淋巴细胞导致联合检测的 EBV-DNA 检出率为50.00%。陈晓宇等7研究显示, EBV 感染咽拭子的阳性率为 51.60%, 提示不明原因的成人肺炎患者检测咽拭子 EBV 的诊治价值。 EBV感染引起的病毒血症与机体的免疫状态、病毒的复制及感染局部细胞裂解的 状态相关, 对感染 12周后就诊的患者, 由于不同个体产生的病毒
17、抗体量的不 同, 对病毒的中和能力不同, 血浆的EBV-DNA 检出率相对低很多, 淋巴细胞和 咽拭子标本中EBV-DNA检出率明显高于血浆。研究结果提示, IM局部感染的状 态与淋巴细胞的感染状态密切相关。联合检测的 EBV-DNA检出率分别与血浆、 PBMC比较差异有统计学意义 (P0.05) , 提示联合检测提高病毒的检出率及诊 断的准确率。根据血清学调查, 由于机体免疫功能的差异, 咽部和淋巴细胞的 EBV存在时间长短不一, 对IM恢复期血清EBV-DNA低或阴性的患者选择咽拭子 或淋巴细胞EBV-DNA检测, 联合EBV抗体的检测结果及临床症状来提高诊断准确 率更为重要12。 根据E
18、BV的感染途径及生活史, 同时采集血浆、 PBMC和咽部的上皮细胞样本, 不 仅提高了IM的EBV-DNA检出率及IM诊断的准确率, 而且对感染的时期、 预后及 其他EBV 感染相关疾病的诊断和治疗方式的选择提供依据。 目前国内外文献检索 对EBV-DNA检测的方法中 3种联合检测的临床意义未见报道。 由于实验方法学及 病例选择、入组和排除标准、仪器及检测方法、样本类型、EBV-DNA 基因片段选 择的不同, 研究结果的报道不一。研究者发现 EBV-DNA复制相关基因检测能为 IM的诊断治疗提供了实时的病原学证据, 结合血清的抗体结果可为临床诊治提 供依据。这3种标本采集方便、操作较为简单、费
19、时不多、结果准确可靠, 临床 医生和患者易于接受。由于本研究标本量的限制, 希望以后能进一步深入研究。 参考文献 1陆晓茜, 高举.慢性活动性 EBV 感染诊治进展J.中国小儿血液与肿瘤杂志, 2013, 18 (5) :198-213. 2李金明.实时荧光 PCR技术J.北京:人民军医出版社, 2007:291-298. 3邓晓凤.成人传染性单核细胞增多症 44例临床分析J.四川医学, 2011, 32 (12) :1931-1933. 4QIU J, LAWSON D A.EBV microRNA BART 18-5p targets MAP3K2to facilitate persist
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