1、2008年第2期Vo118 No2 检验检疫科学INSPECTION AND QUARANTINE SCIENCE 婴儿食品中阪崎肠杆菌检测方法的改进 杨万颖祝仁发 李传礼赖心田 杨国武 (深圳市计量质量检测研究院，广东深圳，518131) 摘要：目前常用的阪崎肠杆菌的分离鉴定方法存在许多不足。通过改进目前常用方法，使得选择性大大提高， 可疑菌落易于识别检测周期缩短，可检测出仅含1个阪崎肠杆菌的接种样品。改进方法与原标准方法的定性验证 实验结果一致，定量重复实验结果良好。用改进方法开展市场上婴幼儿奶粉、婴幼儿补充食品中的阪崎肠杆菌污染 情况调查，婴幼儿奶粉中阪崎肠杆菌检出率为73，婴幼儿补充食
2、品中阪崎肠杆菌检出率为25。 关键词：阪崎肠杆菌；检测 质量调查 中图分类号：TS2521 ROVE匝NT IN DETECTIoN OF Enterobacter sakazaldi IN ANT FoOD YANG Wanying ZHU Renfa LI Chuanli LAI Xintian YANG Guowu (ShenzhenAcademyofMetrology andQualityInspection，Shenzhen，Guangdong，51813l，China) Abgtraet：There are many deficiencies in the general meth
3、od of isolation and identification of Enterobacter SakazakiiIn this study，the modified method to detect Enterobacter Sakazakii had exceedingly higher sensitivity than the former oneUsing the new mhod，the suspected colony was easy to be recognized，the test time was needed only 5 days and even the ino
4、culated sample containing l cfu of Enterobacter Sakazakii could be detectedThe results of the qualitative validation test of the modified method were in compliance wim mat of the former oneand the quantitative duplication test had obtained favorable resultsInvestigation by the modified method for th
5、e contamination situation of babY milk powder and baby supplementary food in the market had demonstrated that the detection rates of Enterobacter Sakazakii in milk powder and supplementary foods for infants and young children were 73and 25respectively Key words：Enterobacter sakazakii，Detection，Quali
6、ty investigation 1前言 阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakff)存在于婴儿奶 粉及含乳的婴JDi!it,方食品中，可导致婴儿脑膜炎、败 血症、坏死性小肠结肠炎，发病婴儿的死亡高达80lj1。 因此对婴儿奶粉及制品中阪崎肠杆菌进行监测十分重 要。E1前还没有阪崎肠杆菌检测的国家标准，一般采 用的方法是2002年FDA的推荐方法闭。2005年我国 虽颁布了SNT16321行业标准，其分离培养阪崎肠杆 菌的方法也基本沿用了FDA的推荐方法。这两个方法 所需时间长，分离平板(VRBGA)的选择效果不明显， 可疑菌落不易识别，给检测技术人员带来极大的工作 量与不确定性
7、。因此，对阪崎肠杆菌分离培养方法进 行改进十分必要。 2材料与方法 2、1菌株 阪崎肠杆菌标准株(45001)购自中国药品生物制 品检定所，非阪崎肠杆菌(大肠杆菌、沙门氏菌、志 贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、单核细胞增生李斯 特氏菌、金黄色葡萄球菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆 菌、普通变形杆菌、奇异变形杆菌共l0株)购自中国 药品生物制品检定所或由本室保存。 22试剂 肠道增菌肉汤(EE肉汤)、VRBGA分离培养基、 胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)、脑心琼脂购自北京陆桥生 物技术有限公司；药敏纸片购自杭州天和微生物试剂 有限公司；抗生素购自Amresco公司，API20E生化试 剂条、氧化酶试剂购自生物
8、梅里埃公司。 VC选择性显色培养基配方：脑心浸粉380g、氯 化钠5og、5一溴一4氯一3一吲哚一aD葡萄糖苷01g、 万古霉素4mg、头孢噻吩01mg、琼脂粉15g、蒸馏水 1000 mL。 23方法 前增菌、增菌、分离培养及判定方法同SN T16321。从增菌液中分离阪崎肠杆菌时使用VC选择 39 维普资讯 http:/ INSPECTION AND QUARANTINE SCIENCE检验检疫科学 Vo118 No2 2008年第2期 性显色培养基，培养条件为36MC、24：2h，可疑菌 落呈蓝绿色、圆形、直径1-2mm。 鉴定试验：从每个VC选择性显色培养基平板挑 选可疑菌落，同时进行
9、革兰氏染色、氧化酶试验、 TSA色素形成实验、API20E生化鉴定实验。其它同 SNT16321。 3结果 31 VC选择性显色培养基的选择性 将阪崎肠杆菌和10株非阪崎肠杆菌涂布在VC选 择性显色培养基上，37培养24h，结果发现阪崎肠 杆菌能生长，而10株非阪崎肠杆菌中，除产气肠杆 菌有生长外，其他9株非阪崎肠杆菌均未生长。产气 肠杆菌虽有生长，但菌落呈土黄色，与阪崎肠杆菌菌 落容易区分。 32改进方法检测实际样品的灵敏性 为观察改进后的方法检测实际样品的灵敏性，人 工定量污染阪崎肠杆菌到奶粉样品，用VC选择性显 色培养基和SNT 163212005中的VRBGA平板进行 对照检测。过程如
10、下：取新鲜培养的阪崎肠杆菌菌液 依次10倍稀释至10 ，每个稀释度同时做菌落计数； 取8个无菌三角瓶，分别加入10g奶粉样品(已确认 无阪崎肠杆菌)和90mL无菌水，再分别添加lmL不 同稀释梯度的菌液(稀释度从10 10圳)，37C培养 18h；取10mL培养液到90mL EE增菌肉汤，37C培养 18h；接种增菌液到VC显色平板及VRBGA平板各1 份，37C培养18h；取可疑菌落进行API20E生化鉴 定。检测结果表明，VRBGA平板上有杂菌生长，而 VC选择性显色培养基成功抑制了杂菌，增强了特异 性。实验表明，使用VC选择性显色培养基可检测 出仅含1个阪崎肠杆菌的接种样品，显示了良好的
11、灵 敏性。 3_3定性验证实验 用改进方法定性检测了14份奶粉样品(样品接种 量为100g)，结果3份样品检测出阪崎肠杆菌，见表 1。同时，用SNT163212005标准方法，得到同样结 果，见表2。表明改进后的阪崎肠杆菌分离培养方法 简便、快速，结果准确、可靠，在实践中可行。 34定量重复性实验 ， 选用阪崎肠杆菌阳性的奶粉样品，用改进方法来 定量检测其中的阪崎肠杆菌，重复5次，以分析其重 复性。结果分别为23、21、23、23、20个kg，表明 实验重复性良好。 3,5市场上婴幼儿食品中的阪崎肠杆菌污染情况调查 用改进方法定量检测婴幼儿食品中的阪崎肠杆 40 菌，开展市场上婴幼儿奶粉、婴幼
12、JLITM充食品中的阪 崎肠杆菌污染情况调查。从市场上随机购买了55份 婴幼儿奶粉，有4份样品检测出含有阪崎肠杆菌，检 出率为73；从市场上随机购买了20份婴幼儿补充 食品，有5份样品检测出含有阪崎肠杆菌，检出率为 25。婴幼儿补充食品中阪崎肠杆菌的污染水平远高 于婴幼儿奶粉。 4讨论 2002年美国FDA推荐分离培养方法步骤大致为： 预增菌(1d)避择性增菌(1d)避择性平板(VRBG) 分离(1-2d)一可疑菌落产生色素能力的检测(2d)一 形态学观察一API 20E生化鉴定(1d)一结果汇报，全 过程一般需要9d以上。原因是方法的选择性太低， 可疑的阪崎肠杆菌菌落不容易识别，需依次将非阪
13、崎 肠杆菌排除，才能进行后面的实验。而用本研究建立 的检测方法，因VC显色选择性平板的选择性大大提 高，可疑的阪崎肠杆菌菌落易于发现，样品通过无菌 水预增菌、EE肉汤增菌处理后，接种到VC选择性显 色培养基，可直接挑选蓝绿色菌落同时做生化鉴定、 革兰氏染色、氧化酶实验、TSA显色实验，全过程只 需要5d。 在VC选择性显色培养基中，万古霉素主要是抑 制革兰氏阳性菌，头孢噻吩是广谱抗生素，对革兰氏 阳性菌和革兰氏阴性菌都有一定抑制效果，但阪崎肠 杆菌对它们耐药。因此选择这两种抗生素组合起到了 很好的抑制杂菌作用。虽仍然有少数杂菌(如产气肠 杆菌等)无法抑制，但在培养基中添加了显色剂后， 能生长的
14、杂菌菌落基本上不会呈显蓝色，可与阪崎肠 杆菌菌落区分，从而进一步增强了选择性。由于目前 市场中显色剂价格昂贵，为了降低成本，实验时可不 在选择性培养基中添加显色剂，分离效果一样，只是 可疑菌落的识别可能会受到一点点影响。 在基础培养基中加入5一溴一4氯一3一吲哚一a一葡萄 糖苷，是利用阪崎肠杆菌的 一D一葡萄糖苷酶活性使 阪崎肠杆菌菌落在显色培养基上成蓝绿色菌落。但其 他一些细菌在显色培养基上也能产生相似颜色，如伤 口埃希氏菌、克氏柠檬酸杆菌在显色培养基上产生蓝 绿色菌落，非脱羧勒克氏菌菌落中心呈蓝色四。可见单 靠显色剂并不能达到区分阪崎肠杆菌和杂菌的目的。 这一点在实际工作中也得到证实。 原
15、阪崎肠杆菌分离培养方法用VRBGA平板来分 离阪崎肠杆菌，该培养基含有酵母粉、蛋白胨、葡萄 糖等成分，营养非常丰富，阪崎肠杆菌在该培养基上 疯狂生长成片状，常掩盖了杂菌的存在，不利于可疑 维普资讯 http:/ 2008年第2期Vo11 8 No2 检验检疫科学INSPECTION AND QUARANTINE SCIENCE 菌落的分离，易导致下一步鉴定的失败。而本研究建 立的VC选择性显色培养基，营养适中，且包含适当 浓度的抗生素，能抑制阪崎肠杆菌的过度生长但不影 响其检出水平，菌落大小适度，菌落形态规则，菌落 之间有明显间隙便于挑选。 婴儿奶粉污染阪崎肠杆菌的原因是由于婴儿奶粉 及配方婴
16、儿食品在加工过程中需加入各种不耐热的营 养成分，不是完全无菌的产品，3nT_过程中的加热处 理也不能让产品彻底灭菌，成品中仍可能残留部分来 自于原料的阪崎肠杆菌。阪崎肠杆菌还可能来自厂房 4卜 维普资讯 http:/ INSPECTION AND QUARANTINE SCIENCE检验检疫科学 Vo118 No2 2008年第2期 水产品中沙门氏菌的分离与血清学鉴定 王云华龙丽坤蔡先全林娜伍朝晖 (中山出入境检验检疫局，广东中山，528400) 摘要：目的】探索如何准确并快速地进行水产品中沙门氏菌的血清学鉴定。方法】将经过VIDAS SLM初 筛、API鉴定为沙门氏菌阳性的菌株按照国标方法进
17、行血清学分型鉴定。 结果】从9个水产品样品中分离出9株沙 门氏菌，其中沙门氏菌B群3株、cl群4株、D群l株、其他群l株。结论】用沙门氏菌阳性菌株的营养肉汤增 菌液的菌苔沉淀来进行血清学分型鉴定是一种很好的辅助方法，有助于提高沙门氏菌血清学鉴定的效率和准确性。 关键词：沙门氏菌；API；血清学鉴定 中图分类号：TS2541 ISOLATIoN AND SEROLO( CAL IDENTIFICATIoN OF Salmonella IN AQUATIC PRODUCTS WANGYunhuaLONGLikunCAIXianquanLINNa、rUZhaohui (Zhongshan Entry
18、-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Zhongshan，Guangdong，528400，China) Abstract：To identi the salmonella strains accurately and rapidlythe VIDAS SLMApI and serological identification methods were used for serological identification in accordance with the stipulations in related China National Stan
19、dardIn this PapeF，9 stains of salmonella from 9 aquatic product samples were isolated in which 3 ale members of B Group4 of C l Group1 of Dl Group and l of othel“Group respectivelyIt was a good auxiliary method to use the salmonea positive precipitate ofthe enrichment fluid for the serological ident
20、ification of salmonella stains to get higher efficiency and accuracy Key words：Salmonea。API method。Serological Identification 1前言 沙门氏菌属于肠杆菌科细菌。该属细菌分布广 泛，抗原结构复杂，菌型繁多，是重要的人畜共患病 的病原体。根据沙门氏菌菌体抗原(O抗原)和鞭毛 抗原(H抗原)的不同，将沙门氏菌描述成许多不同 的血清型。随着科学技术的发展，新的沙门氏菌不断 被发现，沙门氏菌WhiteKauffmann抗原表也在不断 地更新。最新一期抗原表中共收录沙门氏菌2463
21、个 血清型。其中，沙门氏菌B群的鼠伤寒、C群的猪霍 乱和D群的肠炎沙门氏菌是引起食物中毒最常见的病 原体 。因此，进出口食品的沙门氏菌检测在食品安 全方面关系重大。 目前，沙门氏菌的快速检测方法有VIDAS SLM检 测、常规PCR检测、实时荧光PCR检测等。但是， 快速检测仅能缩短检测周期、提高检出率，并不能完 全取代传统的生理生化培养法。沙门氏菌阳性菌株一 环境、奶粉消毒后添加微量元素的过程或配方粉的冲 调期。研究证明，阪崎肠杆菌在婴儿配方粉中可长期 存活。阪崎肠杆菌增殖能力很快，如37、1921min 就可分裂一代。对阪崎肠杆菌进行危害性评估发现， 与对照相比，25放置6h该菌的相对危险
22、性可增加 30倍，放置10h可增加30000倍。因此，即使婴儿配 方粉中只有极微量的阪崎肠杆菌污染，在配方粉食用 前的冲调期和储藏期，该菌也可能会大量繁殖 。婴 儿配方粉中微量的阪崎肠杆菌(03个 )污染， 也能导致感染的发生。因此，政府主管部门应督促企 业加强婴幼儿相关食品中的阪崎肠杆菌污染控制的 工作。 42 参考文献 【1MNazarowec-White，JMFarberbEn terobac ter sakazakii：a re- viewInternational Journal of Food Microbiology，1997，(34)：103- l13 【2http：wwwcf
23、sanfdagovIsolation and Enumeration of Enterobac ter sakazakii from Dehydrated Powdered Infant Formula(USFood and Drug Administration，Center for Food Safety and Applied Nut- tion，july 2002，Revised August 2002) 【3C Iversen，P Druggan，S ForsytheA selective differential medium for enterobacter sakazakii，a preliminary studyFood Microbiol， 2004(96)：133139 【4J裴晓燕，刘秀梅阪崎肠杆菌的生物学性状与健康危害中国食品 卫生杂志，2004，(16)6：550-553 维普资讯 http:/
