1、行政院國家科學委員會專題研究計畫成果報告 嗜熱耐鹼性生產木聚醣脢菌種篩選及其基因表現與應用 Isolation, identification, and application of bacteria and its respective gene encoding thermostable, alkalophilic xylanase 計畫編號： NSC92-2313-B-002-125 執行期限： 92 年 8 月 1 日 至 93 年 7 月 31 日 主持人： 柯淳涵 助理教授 國立台灣大學森林環境與資源學研究所 共同主持人： 汪淮 教授 國立台灣大學森林環境與資源學研究所 共同主持人
2、： 杜鎮 研究員 中央研究院植物學研究所 一、中文摘要 木聚醣酶能結合不同漂白程序，節省漂白藥劑、增進漂白效果，而細菌的木聚醣酶較為耐鹼，尤具應用價值。本計畫由台紙新營廠漂前黑液內，篩選出嗜熱性木聚醣降解菌株BL11，並針對 BL11 進行型態鑑定及生化特性分析。 16S rDNA 定序結果顯示， BL11為 Paenibacillus sp.，屬於格蘭氏陽性菌並具內孢子為好氧性菌株。最適生長條件之碳源為 Maltose、氮源為 Yeast extract。最佳生長溫度為 60。最佳生長 pH 為 5.5。在基質利用方面， BL11能分解主要之碳水化合物，而以Maltose 為基質時生長速率最
3、大。 本計畫以 Maltose 為碳源， Yeast extract 為氮源的 Basal medium 培養，進行酵素活性試驗。在 37、 pH 4.5至 9.5 環境下培養 2 至 72 小時，分別以粗酵素液，探討時間變化與 pH 值對酵素活性之影響。實驗結果可知，菌株 BL11 所分泌之木聚醣酶於第 4 小時， pH 為 8.5 時，可達最大酵素活性為 0.120U/ml。為提升木聚醣酶產量，本研究使用 1.0 % 樺木木醣及 1.0 % Yeast extract 培養，於 pH 8 時粗酵素液可達最大木聚醣酶活性為 13 IU/ml。以粗酵素液作前處理 (6 IU/ o.d. g p
4、ulp)後，對桉樹 LUKP 進行 DED 漂白，於第一段有效氯價 (Active Chlorine Multiple)為 0.1%時，即能提升白度為87.3，較對照組 84.4 有明顯的提升。BL11 木聚醣酶基因選殖初步結果得到一活性選殖株 pBCX1，經由 DNA定序及限制酶圖譜確認後，其木聚醣酶基因片段大小約 2.8K，並以活性染色法確認其活性蛋白大小約 40kD。 Abstract Xylanase can improve pulp bleachability and reduce chlorine chemical usage. The thermophilic xylan-deg
5、rading strain BL11 was isolated from a TPPC Hsing-Ying pulp mills oxygen deliginifaction washer prior to bleach section. Morphological identification and biochemical characterization were conducted for BL11. Strain BL11 was identified by 16S rDNA sequencing as a Paenibacillus sp. It is also a gram-p
6、ositive, endospore forming, and aerobic rod bacterium. The optimum growth conditions of carbon and nitrogen source were maltose and yeast extract. The optimum growth temperature and pH were 60 and 5.5. Strain BL11 could catabolize many kinds of carbohydrates, optimally with Maltose. Activities of xy
7、lanase and the family of cellulase from BL11 crude extract were analyzed to explore its potential for further application. Maltose and yeast extract were added to basal medium, and incubated at 37 for time period from 2 to 72 hours, with pH 4.5 to 9.5. The maximum xylanase activity (0.120 U/ml) was
8、achieved in at pH 8.5 for four hours. 二、前言 木聚醣酶 (Xylanase)能降解木聚醣，在生化工業上已廣泛的應用。可應用於家畜食物的添加物中，增加其食物的消化效率或在製作生麵團時，亦可添加木聚醣酶以方便處並增加麵包烘培的品質，以及紡織工業的應用。另外，對紙漿及造紙工業之漂白處理上，更是佔有重要的地位。 本計畫中，經由對菌種進行形態鑑定、定序，測定 BL11 之生長曲線，並探討不同氮源、碳源、溫度及 pH 值對菌種生長的影響、測試菌種對不同基質的分解效果等形態及生化特性之試驗，另外並對菌種產生之木聚醣酶及其他纖維素酶之酵素活性進行測試與分析。本研究並使用
9、 Birchwood 木聚醣誘導產生木聚醣酶，以粗酵素液作前處理 (6 IU/ o.d. g pulp)後，對桉樹 LUKP 進行 DED 漂白，並探討減少使用有效氯價的效益。 三、材料與方法 試驗菌株為自台紙新營廠的製漿部進行採樣，於其漂前黑液的部份採集得到。 (一 ) 菌種之篩選、培養 (二 ) 菌株形態特性之探討 (三 ) 菌種鑑定 -16S rDNA 定序 (四 ) 菌株生化特性之探討 (五 ) 酵素 DED 漂白 酵素前處理條件如下：漿濃： 10。反應時間： 3 小時。 Enzyme 劑量： 6 IU/ o.d. p.。 Buffer pH 8、反應溫度： 55 。 (六 ) BL1
10、1 木聚醣酶基因選殖 四、結果 (一 ) 菌種之純化、培養 本研究自台灣紙業股份有限公司新營廠之洗漿及漂白系統部份進行採樣，採樣之環境條件為溫度大於55、 pH 9.0-9.5，將所分離出的菌株以 Congo red stain 加以測試，其中，以菌株編號為 BL11 具有最佳的木聚醣分解效果。 將所得菌株於 LB 上以劃線法進行培養，每一個星期定時繼代，更換新的培養基，以利 BL11 的養分吸收。 (二 ) 菌種形態特性之探討 (1) 革蘭氏染色法 觀察結果可知， BL11 為革蘭氏陽性菌 (G(+)，如圖 1 所示。 (2) 菌落形態 菌株 BL11 在固態培養基上可生成 (圖 2)。再將
11、菌株經前處理後，以掃描式電子顯微鏡照相，得到菌株 BL11為桿菌，大小約為 0.4-0.7 m 1.0-2.0 m (圖 3)。 圖 1. BL11 之革蘭氏染色。 圖 2. BL11 之菌落形態 圖 3 BL11 菌株之掃描式電子顯微鏡照相 (三 ) 菌種鑑定 -16SrDNA 定序 經由 16S rDNA 定序後及親緣樹分析之後，本菌種應屬於Paenibacillus (圖 4)。 Bacillus chitinolyticusPaenibacillus pabuliPaenibacillus illinoisensisPaenibacillus sp. 38-2Paenibacillus
12、 sp. S39Paenibacillus sp. AG430Paenibacillus campinasensisPaenibacillus sp. strain 324Paenibacillus sp. A11Paenibacillus sp. isolate BL11Paenibacillus glucanolyticusPaenibacillus sp. isolate vortexPaenibacillus lactis strain MB1871Paenibacillus lactis strain MB1928Paenibacillus lactis strain MB2035P
13、aenibacillus sp. 61724Paenibacillus sp. 436-1Paenibacillus borealis isolate KK19Paenibacillus borealis isolate KK20Paenibacillus borealis isolate HM26Paenibacillus borealis isolate HM31Paenibacillus borealis isolate KN25Paenibacillus borealis isolate KN24Paenibacillus sp. 448-L5Paenibacillus azoredu
14、censearthworm gut bacterium MH21Paenibacillus maceransPaenibacillus thiaminolyticusPaenibacillus thiaminolyticus strain DSMPaenibacillus popilliaePaenibacillus popilliae strain ATCC14706(T)Paenibacillus popilliae strain NRRL B-4081Paenibacillus lentimorbusPaenibacillus sp. C-168uncultured bacteriumP
15、aenibacillus agarexedensPaenibacillus sp. LMG 20245Paenibacillus daejeonensisPaenibacillus polymyxaPaenibacillus polymyxa strain DSM36TPaenibacillus jamilaeBacillus polymyxaPaenibacillus sp. Cp_S316Paenibacillus polymyxa strain GBR-1Paenibacillus burgondiaPaenibacillus peoriaePaenibacillus kribbensi
16、sPaenibacillus peoriae strain DSM8320TPaenibacillus polymyxa isolate CF43Paenibacillus polymyxa isolate PMD230圖 4 BL11 16S rDNA 親緣樹 (四 ) 菌株生化特性之探討 (1) 最佳碳源 試驗結果可知菌株 BL11 在利用Maltose 為碳源，與其他四種碳源的生長結果相比較下，其比生長速率明顯較高，在 55下又比在 37下結果更明顯 (圖 5)。 0.1110.1340.0670.1130.1230.1980.1670.1150.1060.11200.10.20.3Gl
17、ucose Maltose Lactose Saccharose GlycerolSpecific growthrate(h-1)3755圖 5 BL11 菌株在不同碳源供給下之比生長速率 (2) 最佳氮源 試驗結果可知菌株 BL11 在利用Yeast extract 為氮源，與其他五種氮源的生長結果相比較下，其比生長速率明顯較高，在 55下又比在 37下結果更明顯 (圖 6)。 0.2170.1190.0650.1740.1110.0580.4890.4170.1090.3150.0720.06200.10.20.30.40.50.6Yeast extract Peptone Trypton
18、e NH4Cl KNO3 (NH4)SO2Specific growthrate(h-1)3755圖 6 BL11 菌株在不同氮源供給下之比生長速率 (3) 最佳生長溫度及 pH 值 試驗結果，發現菌株 BL11 在pH4.5-9.55 及溫度在 25-65之間均可生長，但在 pH 為 5.5、溫度為 60時，有最大的比生長速率，生長狀況最良好。 (4) 基質利用模式 試驗結果發現，菌株 BL11 對於大部分基質皆具分解能力 (表 1) 表 8 菌株對不同基質之利用性 Compounds BL11L-Arabinose + L(+)-Rhammose + D(+)-Cellubiose + D
19、(+)-Mannose + Glucose + Avicel + GlycerolMaltose + Raffinose + Lactose + Starch + CMC + Xylan +(5) 菌株呼吸作用試驗 (表 2) Enzyme BL11 觸酶 (Catalase) + 氧化酶 (Oxidase) - (6) 菌株蛋白質分解試驗 -吲哚試驗 BL11不具有將色氨酸水解為吲哚及焦葡萄酸的能力。 (7) 硫化氫 (H2S)試驗 BL11在代謝時不能產生硫化氫。 (8) 木聚醣酶活性測定 BL11在培養 4-8 小時，其活性即達到最大值，以 pH 8.5 具有最大的酵素活性 (圖 7)。
20、 Xylanase在不同 pH值之酵素活性00.020.040.060.080.10.120.140.160.180.22 4 8 12244872Time(hr)Xylanaseactivity(U/mL)pH4.5pH5.5pH6.5pH7.5pH8.5pH9.5圖 7 Xylanase 在不同 pH 值之酵素活性 (9) 酵素 DED 漂白 粗酵素液對桉樹 LUKP 作前處理後，對進行 DED 漂白，發現 BL11 粗酵素液對降低漂白各階段卡價及提升白度均有效益，如表九及表十所示，且黏度維持不變。 表 9 酵素前處理對降低卡價的效益 Stage ACM 0.1 0.2 0.3 0.4 0
21、.5 D1 4.31 3.02 2.67 2.23 2.12 XD1 3.99 3.14 2.23 1.96 1.92 E1 3.37 2.07 1.77 1.59 1.29 XE1 2.94 1.70 1.36 0.95 0.90 D2 0.94 0.78 0.70 0.69 0.29 XD2 0.77 0.65 0.30 0.28 0.00 表 10 酵素前處理對提升白度的效益 Stage ACM 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 D1 66.7 69.9 70.4 71 72.1 XD1 67.3 68.5 69.3 69.4 69.6 E1 69.5 72.5 74.1 74.6
22、 75.6 XE1 72.3 73.6 74.1 74.4 75.7 D2 84.4 86.1 87.2 87.3 88.4 XD2 87.3 87.4 87.8 88.1 88.6 (10) 木聚醣酶基因選殖 BL11 木聚醣酶基因選殖初步結果得到一活性選殖株 pBCX1，經由DNA 定序及限制酶圖譜確認後，其木聚醣酶基因片段大小約 2.8K，並以活性染色法確認其活性蛋白大小約40kD。 五、討論 由 漂前黑液槽所分離出來的 BL11，經由 Congo red 的菌落活性染色後，可以看見非常清楚的 clear zone，甚至不需要 congo red 染色及可看在含有木聚醣基直質的培養皿上看
23、見菌落周圍有相當大的 clear zone。因此可以確定本菌種有相當強的木聚醣酶活性。經由16S rDNA 定序的結果發現，本菌種為Paenibacillus 的一種，簡單命名為Paenibacillis sp. isolated BL11。本菌種為革蘭氏陽性菌，在較差的生長環境下可形成內孢子，待環境條件許可後，可繼續生長。而在親緣樹前後的菌種，經由查詢後，發現幾乎無應用木聚醣酶之研究，因此本研究有相當的可塑性。 最佳生長條件： Maltose 為最佳碳源； Yeast extract 為最佳氮源；最佳生長溫度方面，在 25-65之間均可生長，但以在 60時，生長狀況最良好；最佳 pH 部分，
24、在 pH 4.5-9.55 之間均可生長，但以在 pH 5.5 時，生長狀況最良好。 BL11 對於大部分基質皆具有分解能力，而對 Xylan 的分解效果極佳。BL11 在利用氧氣的時候，會產生過氧化氫 H2O2，對生物之酵素系統有害；但不具生成氧化酶之能力，可以此特徵與其他革蘭氏陽性菌加以鑑定區別。 BL11 不能產生色胺酸分解酵素，不具備將色氨酸水解為吲哚及焦葡萄酸的能力。且在代謝時不會產生硫化氫，表示其不能利用葡萄糖或乳糖發酵。 BL11 能相對在較短時間內，即可達最大酵素活性 (包括 endoglucanase、exoglucanase 、 -glucansidase 和xylanas
25、e)尤其是木聚醣酶，利用其具有高度木聚醣酶活性的影響，應用於製漿造紙中，進行漂白前處理的步驟，可降低化學漂白藥品的使用，有效減少污染所造成的危害，並利用其分解的能力，能進一步於農業或食品業等其他行業上的應用，進行有效開發、大量生產，增加整體效益。所以在利用上，能有較大的經濟效應與應用空間，且深具工業上的發展潛力，值得近一步深入探討與研究開發。 六、參考文獻 (1).汪淮、施照輝 (1998) 針葉樹硫酸鹽紙漿木聚醣酶與甘露糖分解酵素前處理對紙漿漂白性的影響。國立台灣大學農學院實驗林研究報告。 12(1)： 23-30。 (2).胡展誌 (2003) 以中溫菌進行盤固草固態發酵生產纖維素酶及蛋白
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