1、山东大学生命科学学院2005级生物技术基地班 200719 1 土壤中磷细菌的分离、纯化与鉴定 谭树堂 陶琳 田骁 （山东大学生命科学学院国家基地班 济南 250100） 【摘要】 本实验从山东大学生命科学学院生物实验田取得土样进行解磷细菌的分离和筛选。实验分 离出六株解无机磷的细菌，菌落形态极为相似，经革兰氏染色，鉴定为同一种菌。但是溶磷圈不是很大， 可能是解磷能力不是很强。挑选其中一株细菌进行形态、生理生化性状的测定和分析，鉴定出本菌株属于 盐杆菌属（Halobacterium） 。 【关键词】 土壤 磷细菌 分离 纯化 Isolation and Identification of Ph
2、osphatesolubilizingBacteria ABSTRACT: We take the soil from the field of Life College of Shangdong University to isolate phosphatesolubilizing bacteria. In our experiment we get six kinds of bacteria, which in fact are the same kind of bacteria acording to Gramdying in our experiment. Though its pho
3、sphatesolubilizing ability is limited, we are still very happy to use it to improve our soil. We choose one kind to do some experiments, identifying it to Halobacterium KEY WORD: soil, phosphatesolubilizing bacteria, isolation, identification 目前我国约 75%的土壤缺磷,磷是限制作物生 长的主要因素之一. 特别是北方石灰性土壤,虽然 全磷含量很高,均在
4、0.570.79 g/kg 之间,但由于 土壤中存在大量的游离碳酸钙,大部分磷形成难溶 性的磷酸钙盐,能被作物吸收利用的有效磷含量很 低.因此,如何开发和有效利用这部分被土壤固定 的磷是目前我国农业生产中急需要解决的问题. 土壤中存在着一些微生物能够将难溶性的磷 酸盐转化为可利用形态,这些微生物称为解磷微生 物 (phosphate solubilizing microorganisms, PSM). 解磷微生物能依靠自身的代谢产物或与其 它生物协同溶解土壤中的难溶无机磷,从而在磷素 转化中起着重要作用. 因此解磷微生物的研究一 直受到科学家的重视,期望以接种剂的途径(即制 成微生物肥料)提高
5、土壤难溶性磷的有效性和磷肥 的利用效率.微生物肥料是指一类含有活的微生物 的特定菌剂，其功能是通过微生物的生命活动，促 进土壤中的物质转化，改善作物营养，刺激和调控 作物生长，防治作物病虫害,从而达到作物增产的 目的。本文就本次实验筛选的某一株解磷细菌进行 了纯化并通过生理生化方法对其进行鉴定。 【材料与方法】 1.1 材料 1.1.1土样的采集 本试验分离和筛选解磷细菌的土样采自生院 试验田。 1.1.2 培养基的制备 1.1.2.1 磷细菌选择性培养基 葡萄糖 7H2O . （） 4H2O () 10 1000 琼脂粉 1820g 1.1.2.2 糖发酵培养基 蛋白胨 2.0g KH2PO
6、4 0.3g NaCl 葡萄糖山东大学生命科学学院2005级生物技术基地班 200719 2 5.0g 20.0g 溴百里酚 0.03g 琼脂粉 57g H 2 O 1000ml pH 7.07.4 蛋白胨 2.0g KH2PO4 0.3g NaCl 5.0g 乳糖 20.0g 溴百里酚 0.03g 琼脂粉 57g H 2 O 1000ml pH 7.07.4 1.1.3 仪器和其他药品 带有玻璃珠装有 90mL 无菌水的三角瓶 （1 个） 、装有 9mL 无菌水的试管（4 支） 、无菌培养皿、无菌吸管、无菌三 角玻璃棒、分析天平、记号笔、接种环、 接种针、酒精灯、火柴。 1.1.4 试剂 无
7、菌水 革兰氏染色液 （结晶紫染液、 碘液、 95% 酒精、番红） 芽孢染色液（5%的孔雀绿水溶液、0.5 的番红水溶液） 过氧化氢水溶液 1.2 方法 平板涂布法 平板划线法 【实验步骤】 2.1 菌株的分离纯化 2.1.1 土壤悬液的制备 在含 100 ml 无菌稀释水和玻璃珠的锥形 瓶中加入土样 10g，振荡 10min，制成土壤悬浮液。 将土壤悬浮液作 10 倍递减稀释于各支试管中至适 当浓度。 （鉴于冬季温度较低，土壤中微生物含量 较少，只做以下稀释浓度：10 2 、10 3 、10 4 、10 5 ） 2.1.2 涂布平板 取最后 3 个稀释度，即 10 3 10 5 ，以平板 涂布
8、法（刮刀法）接种于合适的培养基，每个稀释 度做 3 个平行，并做一个空白对照。注意所用吸管 在每次吸取悬液时，应在稀释液中反复吹吸 3 次 5 次 ， 使悬液中微生物分布均匀 。 2.1.3 培养 待接种悬液被培养基吸收后，倒置于温箱 适温（2830）培养。 2.1.4 划线分离及纯化 挑取单菌落的部分培养物，在预先制备好 的平板上划线分离及纯化。 2.1.5 菌种的保藏 将纯化好的菌接种到预先制备好的斜面 上，培养数天后置于4冰箱中进行菌种的保藏。 2.2 形态和菌落鉴定 由于时间和精力的限制，在此只挑取其中一 种解磷能力较强的菌落进行菌落鉴定。 2.1.1 菌落形态 菌落呈圆形、边缘整齐、
9、厚实、中间隆起、 半透明状。 2.1.2 显微观察 经简单染色后进行显微观察，该菌为杆菌， 较小。 2.1.3 革兰氏染色 革兰氏颜色结果为阴性。 2.1.4 芽孢染色 芽孢染色结果为无芽孢。 2.3 生理生化鉴定 2.3.1 糖发酵与氧化实验 葡萄糖发酵实验结果为：未隔绝空气的试管 中有气泡产生，培养基变成黄色。隔绝空气的既不 产生气体，也不产酸。 乳糖发酵实验结果为：隔绝空气和未隔绝空山东大学生命科学学院2005级生物技术基地班 200719 3 气的培养基都既不产酸也不产气。 2.3.2 过氧化氢酶实验 将一滴 3%的过氧化氢溶液滴于涂在干净载 玻片上的菌苔上，结果有气泡产生，为过氧化氢
10、酶 阳性。 2.4 菌株的鉴定 按伯杰氏分类鉴定手册第九版鉴定该菌为 盐杆菌属的一种（Halobacteriumap.） 【讨论】 本实验从山东大学生命科学学院生物实验田土壤表层以下510cm取得土样， 经过分离与纯化实验得到 几种形态不同的菌落，但溶磷圈普遍不是很大，故分离出的解磷细菌解磷能力不是很强。挑取其中的一株 菌落进行纯化和鉴定，得到该菌落属盐杆菌属（Halobacterium）。通过文献的查阅得知盐杆菌属解磷能力 不是很强。无机磷解磷能力最强的应为假单胞菌属（Pseudomonas）,解有机磷能力最强的当属芽孢杆菌属 （Baclillus），其次为假单胞菌属（Pseudomonas
11、）。本小组的结果虽然没分离到解磷能力很强的菌株，但通 过本次实验我们初步掌握了从土壤中分离纯化所需微生物的方法，实验技巧也得到了进一步锻炼。解磷细 菌在农业生产中的重要性毋庸置疑，解磷细菌制成的一系列微生物肥料也初步显示出比较好的效果。但在 菌株保存过程中, 有些菌株会丧失解磷能力，在农业应用中也会出现同样的问题。故解决解磷细菌解磷能 力的稳定性上还要付出巨大努力。 【致谢】 衷心感谢庞老师本学期对我们的指导和引领。 感谢四组张庆同学在培培养基制备方面的帮助。 感谢苏静学姐为我们提供实验室所没有的磷酸钙。 【参考文献】 1.沈萍、范秀容、李广武主编.微生物学实验高等教育出版社 1999.6 2
12、. 李繁、 涂然 、陈三凤. 7 株解有机磷细菌的分离和鉴定 农业生物技术学报 Journal of Agricultural Biotechnology 2006,14 (4): 600605 3. 姚晓惠,刘秀花,梁峰. 土壤中磷细菌的筛选和鉴定 河南农业科学 2002 年第7 期 4. 王素英、陶光灿、谢光辉、沈德龙、李俊、路宝庆. 我国微生物肥料的应用研究进展 中国农业大学学 报 Journal of China Agricultural University 2003 ,8(1) : 1418 5. 郝晶、洪坚平、刘冰、张健. 石灰性土壤中高效解磷细菌菌株的分离、筛选及组合 应用与环境生物 学报 2006,12 (3) : 404408 Ch in J Appl Environ B iol = ISSN 10062687X
