1、西北大学学报(自然科学版) 2008年1O月，第38卷第5期，Oct，2008，Vo138，No5 Journal of Nohwest University(Natural Science Edition) 利用昆虫一杆状病毒表达系统制备HPV16E6蛋白 郑 瑾，任 斐，余翔，来宝长，王一理 (西安交通大学生物医学信息工程教育部重点实验室西安交通大学疫苗研发中心，陕西西安710061) 摘要：目的 利用昆虫一杆状病毒表达系统高效表达HPV16E6蛋白。方法 将HPV16E6基因克 隆入供体质粒pFastBacHTb，然后再重组入杆状病毒基因组；用带有目的基因的杆状病毒转染昆虫 (Sf-9)
2、细胞，27培养72 h，收集被转染细胞，SDSPAGE，Westernblot分析鉴定表达蛋白。结果 SDSPAGE分析显示所表达蛋白分子量约为24KD，Westernblot结果表明表达产物为HPV16E6蛋 白。结论利用昆虫杆状病毒表达系统获得HPV16E6蛋白的高效表达。 关键词：昆虫杆状病毒表达系统；重组DAN技术；HPV16E6 中图分类号：R373 文献标识码：A 文章编号：1000-274X(2008)05-0775-04 子宫颈癌是严重威胁妇女健康的恶性肿瘤之 一，已证实宫颈癌的发生与高危型人乳头瘤病毒 (Human Papillomavirus，HPV)感染关系密切，特别 是
3、HPV16和18型感染与宫颈癌发生的关系已十分 明确 。 高危型HPV E6，E7蛋白是HPV的主要转化蛋 白 J。E6蛋白可与抑癌基因产物p53蛋白结合形 成复合物，并通过泛素一蛋白酶体系统降解，从而阻 断p53蛋白对细胞周期的负调控功能，这可能是E6 蛋白诱导细胞发生转化和永生化的主要机制 J。 E6蛋白降解p53的活性部位位于其N一末端的34 62位氨基酸所形成的保守区域 J。E6蛋白C一 末端比较保守，第106115位氨基酸是p53蛋白的 结合部位。E6蛋白是一种多功能蛋白，它还能激活 端粒酶，使正常细胞永生化，E6蛋白的锌指区和中 央区为激活端粒酶所必须，且与降解p53的关键区 是相
4、互独立的 j。 获得具有天然结构与功能的高危型HPVE6蛋 白，对于研究其细胞转化机制以及宫颈癌患者对E6 蛋白的免疫反应类型和水平均十分重要。本实验采 用昆虫一杆状病毒表达系统对HPV16E6基因进行 高效表达，获取目的蛋白，用于相关的研究，现报道 如下。 1材料和方法 11实验材料 实验中所用的细菌菌株DH10Bac，pGEx4T HPV16E6质粒(含HPV16E6基因)，pFastBacHTb 载体，Sf-9细胞均由本实验室保存。 puReTapTM Ready-ToGo TM Beads为安法玛西 亚公司产品，胎牛血清为杭州四季青公司产品，Grace S培养基，CELLFECTINE
5、及PVDF膜为Invitrogen公 司产品，HPV16E6单克隆抗体为Merck公司产品，辣 根过氧化物酶标记的抗鼠IgG为DAKO公司产品， HPV16E6特异性引物及M13pUC引物由西安沃尔 森生物技术有限公司合成，LB培养基，琼脂糖凝胶电 泳所用试剂等均为国产分子生物级。 12实验方法 121 pFBHPV16E6供体重组质粒的构建 以 BamH1+Xhol消化pGEX-4THPV16E6质粒，得到 HPV16E6基因片段，经琼脂糖电泳回收纯化后连接 至杆状病毒表达系统的pFastBacHTb载体，构建成 重组质粒pFBHPV16E6。 收稿日期：2008-03-26 基金项目：教育
6、部博士点基金资助项目(20070698097) 作者简介：郑瑾(1973一)，女，陕西西安人，西安交通大学讲师，博士，从事预防性肿瘤疫苗研究。 通讯作者：王一理(1958)，男，陕西大荔人，西安交通大学教授，博士生导师，从事肿瘤免疫研究。 西北大学学报(自然科学版) 第38卷 122重组杆状病毒辅助表达载体的转座反应及 提取重组Bacmid DNA 首先将重组质粒pFB HPV16E6转入lO01xL DH10Bac感受态细胞，使之 与存在于DH10Bac感受态细胞中的杆状病毒基因 组发生转座反应，然后将菌液涂布于Luria Agar选 择性平板(40C水浴融化15 gLLB固体培养基，加 人
7、下列物质至终浓度分别为：卡那霉素005 mgL， 庆大霉素0007 mgL，四环素001 mgL，Xgal 02 mgL，IPTG 004 mgL)，37倒置培养48h观 察蓝白斑的生长情况。从上述Luria Agar选择性平 板上挑取数个白斑，悬于2 mL选择性LB培养液中 (卡那霉素005 mgL，庆大霉素0007 mgL，四环 素00l mgL)，37，200 rmin，振摇培养24 h。取 15 mL菌液提取重组Bacmid DNA，提取方法详见 产品说明书。 123 PCR检测HPV16E6基因在Bacmid DNA的 整合以制备的重组Bacmin DNA为模板，分别以 M13pUC
8、上下游引物(M13pUC上游引物：5 CCC AGT CAC GAC Gr丌GTA AAA CG 3 ；下游引物：5 AGC GGA TAA CAA 1Trrr CAC ACA GG 3 )和 HPV16E6特异性引物(上游引物：5 ATG CAC CAA AAG AGA ACT GC 3 ；下游引物：5 CAG CTG GGT TTC TCT ACG TGT TC 3 )进行PCR扩增，鉴定E6 基因在重组杆状病毒中的整合。PCR循环参数为 95，30s，55，30s，72，180s，循环35次，72C延 伸10 min。取5uLPCR产物行l0 gL琼脂糖凝胶电 泳，对产物进行鉴定。 12
9、4 用重组Bacmid DNA转染Sf-9细胞及重组 杆状病毒的收获在35 mm培养皿中分别接种约9 10 个Sf-9细胞，每平皿中含2 mL完全培养液， 27培养至少1 h，使细胞完全贴壁。在无菌Ep pendoff管中配置A液(5LBacmid DNA加95 L 无菌去离子水)和B液(6LCELLFECTINE加94 无菌去离子水)。轻轻混匀A液和B液，室温放 置30 min。将Sf-9细胞用无血清、无抗生素的 Grace S培养液洗涤3次，弃尽上清，逐滴加入AB混 合液，补加08 mL无血清、无抗生素的Grace S培养 液，27培养5 h后，弃上清，换2 mL完全培养基， 27C过夜。
10、次日，换GraceS维持培养液，继续培养 48 h。收集培养上清，500g离心10 min，分装上清 作为原毒种，4C避光保存。 125 HPV16L1蛋白的表达和鉴定 Sf-9细胞接 种病毒后继续培养72 h，收集病毒感染细胞，加入适 量PBS重悬细胞(5X10。mL)，然后加入等量2 SDS凝胶加样缓冲液，混匀后置沸水中5 min，取2O L样品进行12SDSPAGE及Westernblot检测。 方法简述如下：将蛋白电转至042 m PVDF膜上， 然后用50 gL脱脂奶室温封闭1 h，再与抗 HPV16E6单克隆抗体1：1000稀释，室温孵育过夜， 所用二抗为辣根过氧化物酶标记的抗鼠I
11、gG，1： 2500稀释后与PVDF膜室温孵育1h，TBST洗涤3 次后DAB显色观察。 2 结 果 21 pFB-HPV16E6供体重组质粒的构建及鉴定 以BamH1+Xhol消化pGEX-4T-HPV16E6质 粒及pFastBaeHTb载体质粒，将回收的HPV16E6 片段连接至线性化的pFastBacHTb，经BamH1+ Xhol酶切及PCR鉴定所插入的E6片段大小约为 500 bp，与E6基因预期大小(477 bp)一致，DNA序 列测定与Genbank中HPV16E6基因序列(NC一 001526)完全一致。 22 PCR检测HPV16E6基因在Bacmid DNA的 整合 以p
12、FBHPV16E6质粒转化DHlOBac感受态细 胞，48 h后可见选择性平皿上有大量单菌落生长， 将随机挑选的白斑再次划线接种，尽数长出白斑，说 明所挑菌落均为含有外源基因的重组Bacmid DNA。 挑取一白斑提取重组的HPV1 6E6 Bacmid DNA进行 PCR鉴定，使用HPV16E6特异性引物所得产物大 小在500 bp左右，与E6基因大小基本一致。以 M13pUC上下游引物进行PCR扩增，在3 000 bp 左右处出现特异性扩增条带，这是由于pFastBac Htb质粒的Tn7转座子之间2 430 bp，再加上 HPV16E6基因片段，则大小为2 907 bp，而阴性对照 和以
13、未重组Bacmid DNA为模板，HPV16 E6特异性 引物进行PCR扩增的产物，未发现任何条带，结果 见图1(1为DNA Marker 3；2为阴性对照；3为以 500 图1 PCR检测HPV16E6基因在Bacmid DNA的整合 Fig1 Identification of recombinant Bacmid DNA contai ning HPV16E6 gene with PCR 第5期 郑瑾等：利用昆虫一杆状病毒表达系统制备HPV16E6蛋白 pFB。HPV16E6为模板，HPV16E6特异性引物进行 PCR；4为以Bacmid DNA为模板，HPV16E6特异性 引物进行PC
14、R；5为以重组Bacmid DNA为模板， M13pUC引物进行PCR)。这些结果说明 HPV16E6基因成功地整合人杆状病毒基因组。 23 HPV16E6蛋白的表达及免疫学鉴定 以含HPV16E6基因的Bacmid DNA转染Sf-9 细胞，27C培养48 h后可观察到细胞病变，镜下可 见细胞变圆，肿大，折光性增强，细胞逐渐脱落。而 正常对照细胞无此变化。收集转染细胞培养上清为 原毒种。用适量重组杆状病毒原毒种感染昆虫细 胞，72 h后收集细胞，提取细胞蛋白。经SDSPAGE 观察可见重组病毒感染的Sf-9细胞，与正常细胞和 杆状病毒感染的细胞相比，大约在24 kDa处出现一 特异性条带，比
15、预期结果21 kDa略大，结果见图2 所示(1为蛋白Marker；2为转染Bacmid DNA的Sf- 9细胞；3为转染重组Bacmid DNA的Sf-9细胞；4 为正常Sf-9细胞)。本试验所表达的E6蛋白，经 Western blot证实可与抗HPV16E6单克隆抗体产生 特异性反应，而且，在21kDa处还有一条非常弱的 条带，我们分析这是未经过翻译后修饰的E6蛋白， 结果见图3(1为蛋白Marker；2为正常Sf-9细胞；3 为转染Bacmid DNA的Sf-9细胞；4为转染重组 Bacmid DNA的Sf-9细胞)。说明所建立的重组杆 状病毒可表达目的蛋白，而且所表达的E6蛋白具 有良
16、好的抗原性。 K T 】 2 3 4 98 64。 5O 36。 2 一 l6一 图2 HPV16E6蛋白在Sf-9细胞中的表达(SDSPAGE) Fig2 Expression of HPV16E6 protein in Sf-9 cells 3讨论 HPV感染是一种性传播性疾病，已经证实高危 型HPV感染与宫颈癌之间的关系 同时发现高危 HPV感染亦与子宫内膜癌、外阴癌、喉癌、口腔癌、 肺癌、食管癌及膀胱癌等恶性肿瘤有关 。因此， HPV已成为严重危害人类健康的重要病原体。深 50 36。 4 图3 HPV16E6蛋白免疫印迹鉴定结果 Fig3 Westernblot analysis o
17、f HPV16E6 protein ex pressed by transfected Sf-9 cells with anti- HPV16E6 McAb 人研究HPV病毒，寻找预防和治疗HPV感染的有 效途径，是保证广大妇女健康的需要。 为了进一步研究HPV感染与宫颈癌的关系，以 及比较宫颈癌患者针对病毒蛋白的免疫状态，本文 利用昆虫杆状病毒表达系统对HPV16E6蛋白进行 表达。杆状病毒(Baeuloviruses)是一种高产量的真 核基因表达载体，在昆虫细胞内，杆状病毒表达的外 源基因产物可以得到各种翻译后修饰，包括磷酸化、 糖基化、酰胺化、信号肽切割、蛋白质的裂解等。因 此，当杆状病
18、毒表达哺乳动物包括人来源的蛋白时， 用该表达系统比用原核表达系统更容易获得有正确 结构和修饰的活性蛋白。目前，这一表达系统已被 广泛地应用于重组蛋白的合成 7 J。 本实验利用昆虫杆状病毒表达系统成功的表达 了HPV16E6蛋白，所表达蛋白(24 KD)比预期蛋白 (21 KD)略微大一些，可能是由于蛋白质翻译后修 饰的影响，但并不影响表达蛋白与其抗体的结合能 力，我们曾经用杆状病毒表达系统表达过HPV16L1 蛋白，电泳显示类似现象，但所表达的L1目的蛋白 仍表现出特定的生物特性和免疫学活性H 。 该试验所获得的纯化蛋白，为检测HPV16阳性 宫颈癌患者血清抗E6，E7蛋白的抗体滴度，宿主对
19、 HPV16细胞免疫反应提供了有用的抗原，进而为寻 找预防和治疗HPV感染的策略提供有意义的信息。 参考文献： 1PARKIN D M，PISANI P，FERLAY JEstimates of the worldwide incidence of 25 major cancers in 1990JInt J Cancer，1999，80：827-841 2TSAO S W，WANG X，LIU Y，et a1Establishment of two immortalized nasopharyngeal epithelial cell lines using SV40 large T and
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24、eologyNew York：CRC (编辑徐象平) Press，1997：341-364 ：7 陈伟业，肇慧君，王喜军，等重组杆状病毒表达牛B Expression of HPV16E6 protein with insect-baculovirus expression system ZHENG Jin，REN Fei，YU Xiang，LAI Baochang，WANG Yi-li (The Key Laboratory of Biomedical Information Engineering of National Administration of Education，Center
25、 for Vaccine Development， Xi arl Jiaotong University，Xi an 710061，China) Abstract：Aim To produce HPV16E6 protein with insectbaculovirus expression systemMethods HPV16E6 gene was cloned into donor plasmid pFastBacHTb，then recombinanted to baculovirus genomeSf-9 cells were in fected with recombinant b
26、aculovirus containing the target gene coding HPV16E6 protein fusion with 6His tag ter being cultured for 72 hours at 27 oC，the post infected eeHs were harvestedThe expressed protein was revealed and confirmed by SDSPAGE and Western blotResults The expressed HPV16E6 protein with 24KD was revealed by
27、SDSPAGE，and was confirmed by Western blotConclusion HPV1 6E6 protein has been efficiently expressed with insect baculovirus system Key words：insectbaeulovirus Expression System；Recombinant DNA Technics；HPV1 6E6 学术动态 耿国华教授等3人荣获教学名师奖 教育部公布了第四届全国高等学校教学名师奖评选结果，在全国100名获奖教师中，我校信息科学与技 术学院博士生导师耿国华教授获此殊荣。在此前的第四届陕西省普通高等学校教学名师评选活动中，我校 文博学院赵丛苍、化学系高胜利教授被评为陕西省普通高等学校“教学名师”。 高等学校教学名师奖于2003年开始由教育部首次设立，目前，我校共有3人获国家级教学名师奖，13 人荣获省级“教学名师”称号，体现了我校教师爱岗敬业、教书育人的良好精神风貌，也是对近年来我校教学 工作的充分肯定。 (薛鲍)
