1、513分析检测食品科学2008, Vol. 29, No. 08! 8 d F srAM;_E孙满义1,2，杨贤庆1，李来好1，岑剑伟1，郝淑贤1，戚 勃1，石 红1，周婉君1(1.中国水产科学研究院南海水产研究所，广东 广州 510300； 2.上海海洋大学，上海 200090)K1 ：本研究探索了养殖水体中孔雀石绿的高效液相荧光检测方法，通过正交试验获得最佳抽提方案，并对硼氢化钾的还原效果及方法 检测限进行了研究探讨。结果表明，抽提时间为 5min，样品与二氯甲烷的比例为 1:1，抽提两次的方案回收率最高； 0.002g硼氢化钾即能将孔雀石绿完全还原而又不引起孔雀石绿的降解。本方法在 0.
2、5800ng/ml 范围内具有很好的线性，相关系数 R 为 0.99977，最低检出限为 0.2 g/L。采用不同的水质进行验证，回收率在 86.8% 93.3% 之间，相对标准偏差 (RSD)为 3.15% 8.12%。本方法提取快捷、简便，适用于大批量的抽样检测，可检测出水样中痕量的孔雀石绿，为水产养殖环境提供可行的监测手段，为水体中孔雀石绿的检测标准的制定提供依据。1oM ：孔雀石绿；水体；硼氢化钾；高效液相荧光检测Study on Determination of Malachite Green in Aquatic Water by HPLC with Fluorescence De
3、tectorSUN Man-yi1,2， YANG Xian-qing1， LI Lai-hao1， CEN Jian-wei1， HAO Shu-xian1， QI Bo1， SHI Hong1， Zhou Wan-jun1(1.South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510300, China；2.Shanghai Ocean University, Shanghai 200090, China)Abstract ： HPLC with fluo
4、rescence detector method for the determination of malachite green (MG) and leucomalachite greenin aquatic w ater w as established. B y orthogonal test the optim al extraction technology w as establish. R eduction effect of K B H 4and limit of detection (LOD) of the method were studied. The optimal e
5、xtraction conditions are extraction time 5 min, volumeratio of sample to dichloromethane 1:1 and extraction times two. MG can be completely reduced by 0.002 g KBH4. Good linearrelationship ranges from 0.5 ng/ml to 800 ng/ml with correlation coefficient 0.99977. And the LOD is 0.2 g/L. The recovery r
6、atesrange from 86.8% to 93.3% with the relative standard deviations (RSD) of 3.15% to 8.12%. The method is suitable for the traceanalysis of MG in aquatic water owing to its high efficiency and convenience.Key words： malachite green； aquatic water； KBH4； HPLC with fluorescence detector中图分类号： O652.63
7、 文献标识码： A 文章编号： 1002-6630(2008)08-0513-04收稿日期： 2008-04-16基金项目：广东省质量安全专项项目作者简介：孙满义 (1982-)，男，硕士研究生，主要从事水产品加工及质量安全研究。 E-mail： * 通讯作者：杨贤庆 (1964-)，男，研究员，主要从事水产品加工及质量安全研究。 E-mail： 孔雀石绿是一种有效杀灭霉菌的燃料类药物，对真菌和寄生虫也有较好的疗效。目前在我国被广泛用于欧洲鳗、甲鱼、河蟹、罗非鱼、鳜鱼、鲢鱼等水霉病、小瓜虫、聚缩虫病的防治。因其价廉、易得、高效、用量少而被广泛用于水产养殖。孔雀石绿是三个芳香胺的聚合物，存在潜在
8、致癌、致畸、致突变作用。且孔雀石绿在鱼体及其他生物体内会经过代谢转化成无色孔雀石绿，其危害更大，残留时间也更长。有文献报道1孔雀石绿进入水体后，除了进入鱼体，部分存在水中，大部分被底泥吸附，污染池塘底质，所以孔雀石绿无论对鱼体还是对环境的危害都是不容忽视的。美国及欧盟国家都不允许孔雀石绿用于养殖鱼类。随着我国对水产品质量安全重视，对水产品危害因子、有毒有害物质的监控越来越多，要求越来越严格。关于孔雀石绿使用后在环境中残留以及这些残留药物在环境中会发生吸附、迁移、转化、降解等变化2，这些残留药物及其代谢物是否会重新回到未接触过药物的鱼类体内，对水生生物产生毒害作用，已经引起政府部门的2008,
9、Vol. 29, No. 08食品科学分析检测514关注，而这些研究都必须首先了解孔雀石绿及其代谢物在环境中的残留量。所以，本实验建立了高效液相色谱法 (HPLC)以检测水质中孔雀石绿及其代谢产物。1 材料与方法1.1 试剂乙腈、甲醇为色谱纯；二氯甲烷、冰乙酸、盐酸羟胺、对甲苯磺酸、氨水为分析纯；无水乙酸铵为优级纯；孔雀石绿、无色孔雀石绿：纯度 98。提取液：盐酸羟胺 3g，对甲苯磺酸 0.24g 溶于 100ml水中；硼氢化钾 (0.1mol/L)：称取 0.20g 硼氢化钾 (分析纯 )溶于 100ml 水中，现配现用；阳离子交换柱： PRS柱， 500mg、 3ml，使用前用 5ml 乙
10、腈活化；乙酸铵缓冲溶液 (0.125mol/L)：称取 9.64g 无水乙酸铵溶解于1000ml 水中，用冰乙酸调 pH 到 4.5；乙酸铵缓冲溶液(0.1mol/L)：称取 0.77g 无水乙酸铵溶解于 100ml 水中，用氨水调 pH 到 10；洗脱液：乙酸铵溶液 :乙腈 =1:1(V/V )，临用前配制；标准储备溶液：准确称取孔雀石绿标准品，用乙腈配制成 100 g/ml 的标准贮备液；标准中间溶液：吸取孔雀石绿和无色孔雀石绿的标准储备溶液，用乙腈稀释成 1 g/ml， 18避光保存，有效期为一个月。1.2 仪器与设备Agilent1100 高效液相色谱仪 美国安捷伦公司； MMV-10
11、00W 振摇器 上海安普公司；旋转 N-1000 蒸发仪 上海徕康有限公司； SUPELCO 固相萃取装置 广州仪科有限公司。1.3 液相色谱条件色谱柱： Water C18 柱 (250mm 4.6mm)；激发波长 265nm，发射波长 360nm；流动相 :乙腈 :乙酸铵 =80:20(V /V )；流速为 1.5ml/min；进样量为 50 l；柱温为 38。1.4 样品分析操作步骤提取：先将水样经滤纸过滤，除去固体杂质和色素。准确移取 20ml 水样于 100ml 分液漏斗，加入 2ml 提取液， 20ml 二氯甲烷，振摇 5min，静置，将二氯甲烷层移至 100ml 的梨形瓶，向分液
12、漏斗再加入 2ml 提取液、 20ml 二氯甲烷，振摇 5min，静置，合并二氯甲烷，将所收集到的二氯甲烷于 30条件下蒸干。净化：将 PRS 柱接到固相萃取装置上，先用 5ml的乙腈分两次活化柱，然后用 2ml 乙腈洗涤茄形瓶，洗液加入 1ml 硼氢化钾，轻轻振摇，过柱，再加入 2ml的乙腈洗涤茄形瓶，过柱，抽 PRS 柱近干，最后用洗脱液洗脱定容至 3ml。过 0.45 m 滤膜。供液相色谱测定。2 结果与分析2.1 硼氢化钾的还原效果06 年国标3在鱼肉前处理过程，为了将孔雀石绿完全还原，采用多次加入硼氢化钾，但使实验操作繁琐复杂。本实验过程中发现，硼氢化钾仅需少量就可以将孔雀石绿完全还
13、原，但加入过量反而会使孔雀石绿降解，因此本实验对硼氢化钾的还原效果进行了定量测定，找出硼氢化钾能够将孔雀石绿完全还原但不会因过量加入导致降解的范围。硼氢化钾上限值根据标准孔雀石绿的线性范围的最大值， 3ml 定容，得出 2.4 g 孔雀石绿被完全还原且不会导致降解的硼氢化钾的量；下限值根据本方法最低检出限来确定 0.005 g 被完全还原且不会导致降解的硼氢化钾的量。测定结果见表 1 。由表 1 可知：硼氢化钾在 15.0 g 0.005g 能够将2.4 g 孔雀石绿全部还原，且孔雀石绿不会降解；硼氢化钾在 1.0 1200g 能够将 0.005 g 孔雀石绿全部还原，且不会降解。综上，为了确
14、保孔雀石绿被完全还原且不被降解，硼氢化钾量为 15.0 1200g。2.2 取样量的确定孔雀石绿进入水体后，部分被鱼体吸收，大部分被底泥吸附，所以水中孔雀石绿及其代谢物的含量很少。如果采用紫外检测4-6，根据方法的不同最低检出限为 2 5g/L，不能满足痕量分析。本实验采用硼氢化钾还原，荧光检测孔雀石绿总量，灵敏度大大提高。由于本实验的检测对象为水质，所以需要一个较低的检测限，除了采用较高灵敏度的荧光检测器以外，力求在前处理方法中寻求一个更低的检测限。实验分别采用MG 总量 硼氢化钾 未被还原 MG 测得的 MG( g) 用量 ( g) 的量 ( g) 的量 ( g)2.4 2.4 0.360
15、 2.042.4 12.0 0.004 2.392.4 15.0 0.00 2.402.4 5000 0.00 2.412.4 8000 0.00 2.342.4 10000 0.00 2.222.4 50000 0.00 1.962.4 100000 0.00 1.842.4 200000 0.00 1.852.4 300000 0.00 1.83表1 硼氢化钾还原孔雀石绿所需量的确定Table 1 Dosage of KBH4 for reducing MG0.005 1.0 0.00 0.00510.005 40.0 0.00 0.00520.005 240 0.00 0.00490.0
16、05 1200 0.00 0.00500.005 1800 0.00 0.00470.005 2400 0.00 0.00450.005 3000 0.00 0.0045515分析检测食品科学2008, Vol. 29, No. 0810、 20、 50、 100ml 的取样量，进行旋转蒸发后最后定容至 3ml，不同取样量对应检出限如表 2 所示。取样量 (ml) 10 20 50 100最后定容体积 (ml 3 3 3 3检出限 ( g/L) 0.36 0.19 0.14 0.16表2 不同取样量所对应的检出限Table 2 Corresponding LODs of different s
17、ample volumes结果表明， 50ml 取样量的检测限为 0.14 g/L，但考虑实际情况，试剂需要量比较大，旋转蒸发过程耗时较长，且又增加试剂成本，所以本实验采用 20ml 的取样量。2.3 提取方案的设计通过采用正交试验来确定萃取时间、萃取比例以及萃取次数对回收率的影响，选取最优化的抽提方案，每个方案平行三次，求出平均值，回收率见表 3 。因素 A 时间 BB 比例 C 次数 回收率 (%)实验 11 1 141.实验 21 2 27实验 31 3 3 8.9实验 42 1 2 41实验 52 2 382.实验 62 3 1 65实验 73 1 37.9实验 83 2 1 41实验
18、 93 3 27.均值 1 65.000 71.133 67.333均值 2 87.800 77.200 81.067均值 3 75.467 79.933 79.867极差 22.800 8.800 13.734表3 不同抽提方案的对比Table 3 Comparison of different extraction programes本实验通过对抽提时间、二氯甲烷的量以及抽提次数进行正交试验，选取了最优化的抽提方案。实验表明，不同因素作用程度顺序：时间次数比例，最佳方案组合为： A 2B 1C 2，抽提时间为 5min，样品与二氯甲烷的量为 1:1，抽提次数为两次的方案回收率最高。抽提时间
19、对回收率的影响最大， 5min 为最佳抽提时间，随着时间的延长，回收率反而降低，说明随时间的延长孔雀石绿又重新回到水层，它在水层和二氯甲烷层之间的分配随时间的变化而不同；抽提次数影响次之，理论上次数越多回收率越高，但考虑实际操作，次数越多试剂耗量越大，操作更加繁琐，所以采用两次抽提；抽提比例对回收率的影响较小，但操作过程发现当二氯甲烷的量小于水的量时，分层不是很明显，且二氯甲烷层会出现很多气泡，需要静止较长时间才能够分层，所以最少应采用 1:1 的比例进行抽提。2.4 标准曲线及线性范围用孔雀石绿中间液配成标准工作曲线浓度系列为0.0005、 0.001、 0.05、 0.1、 0.2、 0.
20、5、 0.8 g/ml。一组标准溶液以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，做一标准曲线，求出相关系数和线性范围，曲线方程为Area=715.33212Amount+1.10913，相关系数 R 为 0.99977。孔雀石绿在 0.5 800ng/ml 范围内具有很好的线性。图 2为孔雀石绿的校正曲线，图 1、 3 分别为孔雀石绿的标准图谱和孔雀石绿加标图谱。此条件下峰形尖锐、对称，无干扰峰。图1 孔雀石绿标准谱图Fig.1 Standard spectrum of MG8765432102 4 6 8109.027LU时间 (min)图2 孔雀石绿校正曲线Fig.2 Calibration curv
21、e of MG60050040030020010000 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.73峰面积浓度 ( g/ml)765421图3 孔雀石绿加标色谱图Fig.3 Spectrum of blank water added with MG4.543.532.521.510.502468LU时间 (min)8.9482.5 准确度 (回收率 )准确量取池塘水、江水、海水样品各 20ml(准确至 0.01ml)，样品中分别加入浓度为 10、 100、 200ng/ml 的孔雀石绿标准溶液 1ml，分别相当于 0.5、 5、 10 g/L，轻轻摇匀。分别测定池塘水、江水、海水三
22、个添加水平的平均回收率及相对标准偏差，其结果见表 4 。2008, Vol. 29, No. 08食品科学分析检测516样品名称 空白添加量 测定平均值 回收率 RSD( g/L) ( g/L， n=6) (%) (%)0.5 0.45 90.2 5.62池塘水 0 5 4.34 86.8 3.4310 8.82 88.2 5.690.5 0.46 92.6 6.89江水 0 5 4.65 93.1 7.2210 8.97 89.7 5.850.5 0.47 93.3 8.12海水 0 5 4.55 91.0 7.0610 9.02 90.2 3.15表4 不同养殖水体的加标回收率测定结果Ta
23、ble 4 Recovery rates of MG in different spiked samples3 结 论3.1 提取所用试剂分析样品前处理过程加入对甲苯磺酸和盐酸羟胺，用二氯甲烷提取，对甲苯磺酸使孔雀石绿形成离子对，利于孔雀石绿很好的溶出；另外，孔雀石绿及其代谢产物隐色孔雀石绿在光照、氧气和高温的条件下容易发生去甲基化和氧化降解7，所以前处理过程中加入盐酸羟胺防止孔雀石绿发生变化。3.2 硼氢化钾浓度的分析由表 1 可以看出， 2.4 g 孔雀石绿被完全还原仅需要硼氢化钾 15 g，由此说明硼氢化钾的还原效果是非常好的； 2006 年国标在前处理时加入乙酸铵缓冲溶液、对甲苯磺酸，
24、这些物质都呈酸性，硼氢化钾在酸性条件下反应产生氢气，所以乙酸铵及对甲苯磺酸存在时，硼氢化钾还原效果比较差；另外，一些本底基质结构复杂，跟孔雀石绿结合比较紧密，且有的基质本身呈酸性，容易跟硼氢化钾反应，所以在前处理时加入硼氢化钾还原效果不好。为了避免上述问题，本实验先将孔雀石绿提取，然后再加入硼氢化钾还原，这样既能保证孔雀石绿能被完全还原，又避免了前处理过程中反复大量加入的麻烦。再在实际选择过程中，一方面考虑硼氢化钾浓缩后依然存在影响硼氢化钾还原效果的杂质，另一方面处于硼氢化剂溶液的配置方便性考虑，选择 0.002g，且这个量对低浓度孔雀石绿的降解影响不大。配制时，称 0.20g 硼氢化钾溶于
25、100ml 水，取 1ml加入，现配现用。3.3 最低检测限的确定方法的检测限是指在保证具有一定可靠性 (准确度和精密度 )的前提下，分析方法能测定出样品中某组分的最低浓度，色谱方法一般是根据信噪比推得。本标准采用 20ml 的取样量，最后定容至 3ml，空白样品三倍噪音对应的数值为 0.075 g/L。在样品中添加标准液浓度为 0.1 g/L 时，样品仍能给出大于三倍噪声的峰信号，但在此加标浓度下，其回收率偏差大，重复性差。从测定准确度和精密度以及仪器灵敏度等方面考虑，本方法在大大减少取样量的前提下，向样品中添加 0.2 g/L孔雀石绿时，其回收率 70%，相对标准偏差15%，具有较好的可靠
26、性。因此将 0.2 g/L 定为本方法的检测限。参考文献：1 MEYER F P, JORGENSEN T A. Teratological and other effects ofmalachite green on the development of rainbow trout and rabbitsJ.Trans Am Fish Soc, 1983, 112 (6): 818-824.2 KEYL H G, WERTH G. Stoukfurveranderungan chromosomen durchmalachitgrunJ. Naturwissenschaften, 1959, 46: 453-454.3 G B/T20361 2006 水产品种孔雀石绿和结晶紫残留量的测定高效液相色谱荧光检测法 S.4 SC/T 3021 2004 水产品中孔雀石绿残留量的测定 S.5 SN/T 1479 2004 进出口水产品中孔雀石绿残留量检测方法 S.6 GB/T 19857 2005 水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定 S.7 童玉贵 , 程群 .水产品中孔雀石绿检测的若干细节探讨 J. 实验室技术 , 2006(4): 28-30.
