1、第 9 卷第 1 期 过 程 工 程 学 报 Vo l . 9 N o . 1 2009 年 2 月 The Chinese Journal of Process Engineering Feb. 2009 收稿日期： 20080618， 修回日期： 20080821 基金项目： 国家高技术研究发展计划 (863)基金资助项目 (编号： 2007AA021306)；江苏省自然科学基金资助项目 (编号： BK2006178) 作者简介： 袁静 (1982)，女，江苏省南京市人，硕士研究生，生物化工专业；何冰芳，通讯联系人， Tel: 025-83587336, E-mail: . 以恶臭假单胞菌
2、发酵制备 D-氨基葡萄糖酸 袁 静， 孟 笑， 何冰芳 (南京工业大学制药与生命科学学院，江苏 南京 210009) 摘 要： 从土样中分离到 D-氨基葡萄糖酸高产菌株 GNA5，综合 Biolog 细菌自动鉴定系统与 16S rDNA 序列分析结果，鉴定为恶臭假单胞菌 (Pseudomonas putida). P. putida GNA5 能耐受较高浓度底物 D-氨基葡萄糖，可发酵积累 D-氨基葡萄糖酸 . 初步优化培养基为 (g/L)： D-氨基葡萄糖盐酸盐 30， 葡萄糖 5， 尿素 5, KH2PO42, MgSO47H2O 0.5, CaCO310, pH 7.0. 菌株 GNA5
3、 在该培养基中发酵 48 h 可制备 25.5 g/L 的 D-氨基葡萄糖酸，摩尔转化率达 93.91%. 自行筛选的 P. putida GNA5 显示了底物转化能力强及产物分解能力弱的特点，具有进一步产业化开发的潜力 . 关键词： D-氨基葡萄糖酸；氧化发酵；恶臭假单胞菌； D-氨基葡萄糖 中图分类号： TQ92 文献标识码： A 文章编号： 1009606X(2009)010123051 前 言 D-氨基葡萄糖酸 (D-Glucosaminic Acid, D-GlcNA)，化学名为 2-氨基 -3,4,5,6-四羟基己酸，是一种很有应用前景的调味料1，可以作为抗病毒、抗肿瘤手性氨基酸衍
4、生物等的合成原料2,3. 该物质生物相容性好，其金属离子配合物具有潜在的医用价值4,5. 现有报道的 D-GlcNA 的制备方法有 3 种，均以 D-氨基葡萄糖 (D-glucosamine, D-GlcN)为原料，化学氧化法6选择性差、收率较低；酶转化法采用葡萄糖氧化酶耦联过氧化氢酶制备 D-GlcNA，葡萄糖氧化酶对D-GlcN 的催化效率仅为葡萄糖的 2%，收率较低7；微生物法制备 D-GlcNA 的转化率较高，但高浓度 D-GlcN对菌株生长及转化酶有一定的抑制，发酵转化的底物浓度不超过 10 g/L1,8. 另外，产物易被生产菌株分解，需要添加 -溴代丙酸钠等抑制剂促进其积累1. 本
5、研究筛选得到了一株 D-GlcNA 的高产菌Pseudomonas putida GNA5, 30 g/L 底物 D-GlcN 对菌株GNA5生长和转化无抑制作用 . 该菌对产物 D-GlcNA的分解能力极弱，发酵过程中能够大量积累产物，显示了与现有报道菌株不同的特性，具有理论研究和实际应用开发的价值 . 2 实 验 2.1 试剂 D-氨基葡萄糖盐酸盐 (分析纯，南通双林生物制品公司 )， D-氨基葡萄糖酸 (试剂纯，大于 97%，日本东京化成株式会社 )，其他试剂均为市售分析纯 . 2.2 培养基 筛选培养基 (g/L): D-GlcNHCl 10, CaCO33, KH2PO41, MgS
6、O47H2O 0.5, NaNO31, 酵母粉 0.5， NaOH 调 pH至 7.0. D-GlcN 过滤灭菌后与其他成分按比例混合 . 平板培养基 (g/L)： 葡萄糖 10, KH2PO42, NH4NO32, MgSO47H2O 0.5，酵母粉 5，琼脂 18， NaOH 调 pH 7.0. 基础培养基 (g/L): D-GlcNHCl 30, NH4NO32，酵母粉 1， KH2PO42, MgSO47H2O 0.5, 玉米浆 0.2 mL/L, CaCO310，用 NaOH 调 pH 至 7.0. 2.3 土样来源 所用土样为南京周边不同生态环境下的土壤样品及填埋有 D-GlcNH
7、Cl 一个月后的土壤样品 . 2.4 D-GlcNA 生产菌的筛选 取少量不同来源的土样加入以 D-GlcN 为唯一碳源的筛选培养基中，在 30温度下，装液量 10 mL/试管(25 mm200 mm)，以 120 r/min 培养 57 d，其间用灭菌蒸馏水补充蒸发损失的水分 . 取培养液 0.1 mL，转接入新灭菌的筛选培养基中，转接 3 代，富集培养能代谢利用 D-GlcN 的微生物，将富集培养液稀释涂布于平板培养基上， 30培养 12 d. 挑选生长良好、不同形态的菌落进行画线分离，获得单一菌株 . 将单一菌株接入筛选培养基中进行复筛， 采用纸层析法初步测定发酵液中 D-GlcN 及
8、D-GlcNA 的含量， 选择生产 D-GlcNA 能力较强或 D-GlcN 消耗快的菌株 . 2.5 菌种鉴定方法 2.5.1 Biolog 微生物系统鉴定 针对革兰氏染色结果选择对应的菌种鉴定板进行生理生化特性研究 . Biolog 细菌自动鉴定系统 (Biology 124 过 程 工 程 学 报 第 9 卷 Inc., USA)鉴定原理为：利用微生物对 95 种有机物的分解代谢能力与大量数据库中微生物性质比较，相关计算机系统给出目的菌属与种名称，同时给出可信度数据9. 2.5.2 1 6S rDNA 序列测定和分析 按常规方法抽提细菌染色体 DNA. 采用细菌通用引物 F: 5-AGA
9、GTTTGATCCTGGCTCAG-3和 R: 5-GG TTACGCTTGTTACGACTT-3扩增菌株 16S rDNA 全长序列 . 将 PCR 产物克隆到 T 载体中， 送交上海英骏生物技术公司进行测序 . 所得 16S rDNA 序列登录 GenBank (http:/www.ncbi.nlm.nih.gov)，应用 BLAST 程序与数据库中已有细菌 16S rDNA 序列进行同源性比较分析 . 2.6 分析方法 2.6.1 D-GlcN 和 D-GlcNA 的定性及半定量分析 底物中 D-GlcNHCl 在加入 NaOH 中和时，以D-GlcN 形式存在 . 采用纸层析法检测 D
10、-GlcN 和D-GlcNA10，在文献的基础上对展开剂作了改进 . 取富集培养液或纯菌株发酵液 2 L， 用微量进样器点样于滤纸上 . 展开剂为乙醇 :冰醋酸 :水 =6:1:1(). 纸层析结束后吹干滤纸， 喷洒 0.2%茚三酮溶液并于 95加热 5 min显色 . 两者均呈紫红色 . 底物 D-GlcN 与产物 D-GlcNA的迁移率 Rf分别为 0.65 和 0.21. 2.6.2 菌体生物量 将发酵液适当稀释后测定 640 nm 处的吸光值OD640，代表菌体生物量 . 2.6.3 D-GlcN 和 D-GlcNA 的定量分析 采用 HPLC 定量检测 D-GlcN 和 D-GlcN
11、A10， 考虑到两物质的溶解性能，对文献中的流动相作了调整 . 发酵液上清经 0.45 m 滤膜过滤，用于 HPLC 分析 . 采用Dionex 高效液相色谱仪，色谱条件：色谱柱 Shodex Asahipak NH2P-50 4E 氨基柱， 流动相为乙腈 /0.01 mol/L醋酸铵 (40:13, )，流速 0.5 mL/min，检测器 RI-101 示差折光检测器，柱温 30 . 以 D-GlcNHCl 制备 D-GlcNA 的摩尔转化率 = (m1/195.17)/(m2/215.63)，其中 m1为 D-GlcNA 的质量，m2为 D-GlcNHCl 的质量 . 2.6.4 产物的制
12、备与结构验证 收集微生物氧化发酵上清液，加入等体积的乙醇，在 4冰箱内放置过夜，抽滤得白色结晶状物质，重结晶一次，进行核磁共振谱 (1H-NMR 和13C-NMR)分析，以 D-GlcNA 标准品 (纯度 97%)的核磁共振谱为参照 . 3 结果和讨论 3.1 D-GlcNA 生产菌株的筛选 D-GlcN 代谢菌株富集： 从 42 份不同生态环境的土壤样品中富集并分离到 17 株能快速代谢 D-GlcN 的菌株 . D-GlcNA 生产菌株的筛选： 将初筛分离到的菌株分别接种于基础培养基中， 培养 48 h 后测定发酵液中底物消耗和产物生成情况 . 纸层析结果表明， 17 株菌都能快速消耗 D
13、-GlcN，但绝大多数菌株未见产物积累，部分菌株发酵结果如图 1 所示， 仅有 1 株菌株 GNA5 的发酵液中有大量 D-GlcNA 积累，而菌株 GNA7 能够代谢底物 D-GlcN，无 D-GlcNA 的积累 . 图 1 分离菌株发酵液的纸层析图 Fig.1 Paper chromatogram of the fermentation broth of isolates 3.2 生产菌株 GNA5 的菌种鉴定 菌株 GNA5 根据革兰氏染色鉴定为革兰氏阴性菌 . 选用 Biolog 公司提供的革兰氏阴性菌鉴定板， 根据碳源利用情况， Biolog 系统鉴定菌株 GNA5 为 Pseudo
14、monas putida，与数据库标准菌株的相似值 (sim 值 )为 0.82，具有较高的可信度 . 根据上述方法测定了菌株 GNA5 的16S rDNA 序列 (登录号 EU620069)，在 NCBI 上进行Blast 序列比对，发现该序列与 Pseudomonas putida MG-Y2 的 16S rDNA 序列 (登录号 EU179737)同源性高达 99%. 菌株 GNA5 的生理生化性质与 16S rDNA 的分析结果一致，因此将该菌株命名为 Pseudomonas putida GNA5. 迄今为止，没有文献报道 Pseudomonas putida能够积累 D-GlcNA
15、， 有报道11 Pseudomonas 属可能存在D-GlcNA 脱氢酶， 能够进一步分解利用 D-GlcNA. 本研究中筛选到的菌株 GNA5 不能继续利用 D-GlcNA，可能是在自然进化过程中突变所致 . 3.3 氧化发酵培养基成分的初步优化 3.3.1 补充碳源对 D-GlcNA 产量的影响 在基础培养基中分别添加 5 g/L 葡萄糖、山梨醇和蔗糖 (对照含底物，未添加其他碳源 )，接种菌株 GNA5，发酵 48 h 后测定发酵液中 D-GlcNA 的浓度 . 从表 1 可以看出，葡萄糖作为碳源更有利于 D-GlcN 转化为D-GlcNA，发酵 48 h 时，产物浓度达到 22.05
16、g/L，摩尔转化率达 81.21%；继续发酵 24 h，产物浓度增加幅度很小 . 所以后续优化取样时间确定为发酵 48 h，并采D-GlcN D-GlcNA1 2 3 4 1. Authentic D-GlcN (0.1%) and D-GlcNA (0.1%) 2. Basic medium 3. Fermentation broth of isolate GNA5 4. Fermentation broth of isolate GNA7 第 1 期 袁静等：以恶臭假单胞菌发酵制备 D-氨基葡萄糖酸 125 用 5 g/L 葡萄糖作为补充碳源 . 表 1 碳源及发酵时间对 D-GlcNA
17、产量的影响 Table 1 Effects of carbon source and fermentation time on D-GlcNA production Concentration of D-GlcNA (g/L) Carbon source (5 g/L) 24 h 48 h 72 h Control 9.02 11.70 14.43 Sucrose 9.99 10.84 14.49 Glucose 17.16 22.05 22.95 Sorbitol 8.19 9.18 12.87 3.3.2 氮源对 D-GlcNA 产量的影响 在基础培养基中 (去除酵母粉、 NH4NO3和玉
18、米浆 )，以 5 g/L 葡萄糖作碳源，选择 5 g/L 蛋白胨、尿素、酵母粉、 12 mL/L(固型物含量约 40%)玉米浆作为有机氮源 . 从表 2 可以看出，尿素最有利于底物的转化，酵母粉次之，因此确定氮源为 5 g/L 的尿素 . 采用此培养基发酵48 h 时，产物浓度达到 24.80 g/L，摩尔转化率达 91.4%. 表 2 有机氮源对 D-GlcNA 产量的影响 Table 2 Effects of organic nitrogen sources on D-GlcNA production Nitrogen source Concentration of D-GlcNA (g/
19、L) Urea (5 g/L) 24.80 Yeast extract (5 g/L) 23.75 Peptone (5 g/L) 13.78 Cornsteep liquid (12 mL/L) 17.10 经过碳源和氮源的初步优化，获得优化培养基为(g/L): D-GlcN7HCl 30，葡萄糖 5，尿素 5， KH2PO42, MgSO47H2O 0.5, CaCO310, pH 7.0. 采用微生物制备法，发酵 48 h 底物的摩尔转化率达 91.4%，达到了较高的产量和摩尔转化率 . 3.4 氧化发酵法制备 D-GlcNA 的生产曲线 将 P. putida GNA5 接种于初步优化
20、培养基， 其生产曲线见图 2. 该菌在发酵 24 h 时， 菌体生物量达到最大， 图 2 Pseudomonas putida GNA5 氧化发酵制备 D-GlcNA 的生产曲线 Fig.2 Time-course of D-GlcNA production by Pseudomonas putida GNA5 随后缓慢进入衰亡期 . 底物 D-GlcN 的浓度基本呈直线下降，产物 D-GlcNA 迅速生成，其浓度呈直线上升 . 发酵 48 h 后，培养基中 D-GlcN 全部消耗，产物 D-GlcNA浓度达到了最大值 25.5 g/L，底物 D-GlcN7HCl 的摩尔转化率为 93.91%
21、. 继续发酵 12 h，产物 D-GlcNA 未出现明显的分解下降，表明该菌对 D-GlcNA 代谢能力极低， 发酵过程中无需添加产物代谢抑制剂来促进其积累 . 而已报道的菌株 Aeromonas oxydans 103-1 和 Aeromonas xanthus 102-112也能将 D-GlcN 转化为 D-GlcNA，但产物易分解，需要添加抑制剂 -溴代丙酸钠才能提高产物的收率 . 在现有微生物法制备 D-GlcNA 的报道中，氧化发酵过程中底物 D-GlcN 浓度均未超过 10 g/L ，Moonmangmee 等8采用 Gluconobacter frateurii IFO 3264
22、 发酵氧化 5 g/L 的 D-GlcN 制备 D-GlcNA，摩尔转化率近 100%8； Takiguchi 等10采用 Acinetobacter sp. A-10 氧化 10 g/L 的 D-GlcNHCl 制备 D-GlcNA， 最大摩尔转化率为 92%10. 本实验筛选到的菌株 P. putida GNA5发酵 48 h对 30 g/L底物的摩尔转化率高达 93.4%. 该菌株具有更高底物浓度的耐受能力 . 3.5 鉴定产物结构 按 2.6.4 节所述方法制备结晶产物 D-GlcNA. 对产物进行氢谱与碳谱分析，结果见图 3. 产物的氢谱：1H-NMR(500 MHz, D2O, )
23、: 4.34(1H, d, J=2.5 Hz, H-2), 3.80(1H, d, J=3.0 Hz, H-3), 3.71(1H, m, H-5), 3.64(1H, m, H-6), 3.57 (1H, m, H-4). 产物的碳谱：13C-NMR(125MHz, D2O, ): 173.1(C-1), 73.2 (C-5), 71.2(C-3), 67.7(C-4), 63.2(C-6), 58.7(C-2). 本研究所制一次重结晶产物的核磁共振波谱 (图 3)与日本东京化成株式会社提供的 97%纯度 D-GlcNA 标准品图谱 (图 4)一致，表明 P. putida GNA5 氧化
24、D-GlcN所得产物为 D-GlcNA. 图 4 中标准品 D-GlcNA 的 NMR谱图分别有少量杂质峰， 本实验用 P. putida GNA5 氧化发酵制备的 D-GlcNA 经简单纯化后纯度高于标准品 . 4 结 论 (1) 以 D-GlcN 为唯一碳源富集筛选 D-GlcN 代谢菌， 获得 17 株能够耐受较高浓度并能代谢 D-GlcN 的菌株， 其中仅有菌株 GNA5 能明显积累产物 D-GlcNA. 结合 Biolog 细菌自动鉴定系统与 16S rDNA 序列分析结果，菌株 GNA5 鉴定为恶臭假单胞菌 Pseudomonas putida. 该菌种为首次报道的来源于 Pseu
25、domonas 属的D-GlcNA 高产菌株 . 0 1224364860051015202530D-GlcNAD-GlcNTime (h)Concentration ofD-GlcNA and D-GlcN (g/L)0.00.51.01.52.0OD640126 过 程 工 程 学 报 第 9 卷 图 3 发酵产物的1H-NMR 谱和13C-NMR 谱 Fig.3 1H-NMR and 13C-NMR spectra of fermentation product 图 4 D-氨基葡萄糖酸标准品的1H-NMR 谱和13C-NMR 谱 Fig.4 1H-NMR and 13C-NMR spe
26、ctra of an authentic D-Glucosaminic acid(2) 对菌株 P. putida GNA5 的发酵转化培养基进行了碳源和氮源的初步优化，优化培养基组成为 (g/L)：D-GlcNHCl 30 ，葡萄糖 5 ，尿素 5, KH2PO42, MgSO47H2O 0.5, CaCO310, pH 7.0. 菌株 GNA5 在发酵过程中能氧化 30 g/L 底物 D-GlcNHCl，发酵 48 h 获得25.5 g/L 的产物 D-GlcNA，摩尔转化率达 93.4%，远高于文献报道的氧化发酵法制备 D-GlcNA 的产量 . 该菌对发酵产物代谢能力弱，发酵制备过程不
27、需要添加产物分解抑制剂，工艺简单，具有很高的实际开发价值 . 参考文献： 1 Mitsubishi Gas Chemical Co. Production of D-Glucosaminic Acid by Aeromonas Species P. Jpn. Pat.: S59-014787, 19840125. 2 Hecht S M, Rupprecht K M, Jacobs P M. Synthesis of L-Erythro-beta-hydroxyhistidine from D-Glucosamine J. J. Am. Chem. Soc., 1979, 101: 39823
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33、 1H-NMRIntensity Chemical shift (ppm)220 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0(b) 13C-NMRIntensityChemical shift (ppm)第 1 期 袁静等：以恶臭假单胞菌发酵制备 D-氨基葡萄糖酸 127 Production of D-Glucosaminic Acid by Fermentation with Pseudomonas putida YUAN Jing, MENG Xiao, HE Bing-fang (College of Life Science and Pharmacy,
34、 Nanjing University of Technology, Nanjing, Jiangsu 210009, China) Abstract: Strain GNA5 producing D-glucosaminic acid from D-glucosamine was isolated from soil samples. It was identified as Pseudomonas putida based on the assay of Biology Automated Microbiology Identification System and analysis of
35、 16S ribosomal DNA sequence. P. putida GNA5 could grow in the medium containing high concentration of D-glucosamine, and D-glucosaminic acid was stably accumulated in the oxidative fermentation process. The preliminary optimized culture medium composition (g/L) for the production of D-glucosaminic a
36、cid with P. putida GNA5 was obtained as follows: D-glucosamineHCl 30, glucose 5, urea 5, KH2PO42, MgSO47H2O 0.5, CaCO310, pH 7.0. After 48 h fermentation in this medium, the concentration of D-glucosaminic acid reached 25.5 g/L, with molar yield of 93.9%. P. putida GNA5 exhibited efficient conversion ability of D-glucosamine to D-glucosaminic acid and low degradation ability of D-glucosaminic acid. It shows considerable economic significance in development of D-glucosaminic acid producing process. Key words: D-glucosaminic acid; oxidative fermentation; Pseudomonas putida; D-glucosamine
