1、简 报 第 46 卷 第 8 期 2001 年 4 月 673人神经元钾离子通道 a 亚基基因的分子克隆夏 昆 何云贵 郑 多 张华莉 潘 乾 夏家辉(中国医学遗传学国家重点实验室 , 长沙 410078. E-mail: )摘要 为克隆新的钾离子通道基因并研究其与疾病的关系 , 将大鼠的神经元钾离子通道 亚基编码区序列在人的 EST 数据库进行 BLAST 分析 , 得到一个与其有 87%的一致性的 EST, 通过重叠群的构建和 5 -RACE 反应 , 克隆了人神经元钾离子通道 亚基 (homo sapiens neuronal potassium channel alphasubuni
2、t, HNKA)基因 , 该基因仅在成人脑和胎脑中有表达 . 经与大规模测序数据库比较后将该基因定位在 8q23.1q23.2 位点 . 选择定位于此区域的痉挛性截瘫为 HNKA 基因的候选疾病 , 利用 PCR 产物直接测序的方法 , 对 14 个痉挛性截瘫家系进行了突变检测分析 , 但未检测到突变 .关键词 人神经元钾离子通道 a亚基基因 (HNKA) 痉挛性截瘫 突变检测离子通道是神经 肌肉和腺体等许多组织细胞膜上的基本兴奋单元 , 其形成的通道允许细胞膜内外的离子依从电化学梯度发生快速转移而产生和传导电信号 , 具有重要的生理功能 . 不同的离子通道对各自的离子进出有相对的选择性 .
3、钾离子通道是广泛存在 种类最多 最为复杂的一大类 , 可进一步分为电压依赖 配基 (或受体 )依赖 ATP 敏感 钙激活 钠激活以及机械激活等不同类型 13. 离子通道在电 信号的产生和传导中有至关重要的作用 , 已有报道 , 钾离子通道功能的丧失可通过引起信号传递的紊乱而导致不同疾病的发生 , 如 KCNA1 的突变导致伴发肌纤维阵挛的精神发作共济失调 (episodicataxia with myodymia), KCNQ2 的突变导致良性家族性婴儿惊厥 (benign familial neonatal conbulsions, BFNC),KvLQT1 的突变引起伴发听力下降的长 QT
4、 综合征(long QT syndrome), KCNQ4 的突变引起常染色体显性遗传的非综合征耳聋等 47. 提示钾离子通道基因的突变和耳聋等神经性疾病有密切的关系 , 对神经性疾病的发病机制有相当重要的作用 .为了克隆一个新的可能引起神经性疾病的钾离子通道基因 , 我们利用大鼠的钾离子通道 亚基基因Kv2.3r(GenBank: X98564)的编码区序列在数据库中进行同源比较 拼接 1, 结合 5 -RACE 反应进行全长cDNA 克隆 , 获得了一个新的人类钾离子通道蛋白 亚基基因 (homo sapiens neuronal potassium channel alphasubuni
5、t, HNKA), RT-PCR 表明 HNKA 仅在成人脑和胎脑有表达 . 经与大规模测序数据库比较后获得一个含有 HNKA 的克 隆 , 不但确定了该基因的基因组结构 ,而且将该基因定位于 8q23.1q23.2. 进一步对我室收集的 14 个痉挛性截瘫家系进行了突变检测分析 , 但未检测到突变 .1 材料与方法( ) EST 数据库的 Blast 分析 . 利用 GCG (GeneticComputer Groups, USA)的 seqlab 软件包 , 以 Kv2.3r(GenBank 接受号 : X98564)的编码区对 NCBI (nationalcenter of biotec
6、hnology information)的 dbEST 进行BLAST 搜寻 , 得到一个与 Kv2.3r 在 1004 bp 内的同源性达 87%的人的 EST (GenBank: U69191), 利用这个 EST在 UniGene数据库中得到一个 EST簇 Hs.13285,并构建重叠群 , 根据重叠群设计引物 ( 表 1)进行5 -RACE 反应 , 以克隆 HNKA基因的全长 cDNA.表 1 HNKA 基因克隆 cDNA 全长证实以及 HNKA基因表达分析引物引物名称 引 物 序 列 引物位置KCN1 5 -atgcacacatactccaggatttccag-3 终止密码子的 5
7、端KCN2 5 -ccaccacgaagataatggagatgacgcca-3 终止密码子的 5端KCN10 5 -gcacagcgggtggagagggt-3 起始密码子的 5端KCN11 5 -aatacagaaatccacatcactgct-3 终止密码子的 3端KCN12 5 -cattgtccaggtgttgaggct-3 位于第 2 个外显子KCN13 5 -acagtagtcatagaggtggtgg-3 位于第 3 个外显子gt10-5 5 -ttgagcaagttcagcctggttaagt-3 gt10 载体臂gt10-3 5 -tggcttatgagtatttcttcc
8、aggg-3 gt10 载体臂gt10-5 5 -gccaagagctgacgcaagttctgg-3 gt10 载体臂gt10-3 5 -ggcgttcagaaagagtttgcatatc-3 gt10 载体臂AP1 5 -ccatcctaatacgactcactatagggc-3 Marathon 制备的cDNA 接头AP2 5 -actcactatagggctcgagcggc-3 Marathon 制备的cDNA 接头( ) 全长 cDNA 的克隆 . 以胎盘 cDNA 文库(Clontech 公司 )为模板 , 用 cDNA 文库的 gt10 噬菌体载体臂巢式引物 gt10-5 , g
9、t10-3 , gt10-5 和gt10-3 和基因特异性引物 KCN1和 KCN2进行 PCR扩增 (表 1). 同时以人 Marathon ready cDNA(Clontech公司 )作模板 , 用基因特异性引物分别和接头上的引物 AP1 和 AP2(表 1)扩增 . PCR 反应条件 : 95 预变性3 min, 然后 95 , 30 s, 68 , 20 s, 72 , 5 min, 32 个循环后 , 72 延伸 10 min, 最后 4 保温 . PCR 产物经 8%聚丙烯酰胺凝胶 (PAGE)回收 . 用 ABI PRISM BigDye第 46 卷 第 8 期 2001 年
10、4 月 简 报674 Terminator Cycle Sequencing Kit, 在 ABI377 自动测序仪上完成测序 , 以获取 HNKA 基因 5 端新序列 .为证实拼接的 cDNA 序列可读框 , 在 HNKA 基因的5 - UTR 区和 3 -UTR 区设计一对引物 KCN10 和KCN11(PCR 扩增长度为 1780 bp), 见表 1. 在人脑gt10 cDNA 文库中扩增编码区全长 , 回收扩增产物 ,测序证实 .( ) HNKA 基因的表达分析 . 利用跨内含子的引物 KCN12 和 KCN13(表 1)分别在成人脑 胎脑成人肝 胎肝 成人心和肾 6 种 Marath
11、on ready cDNA以及成人脑 成人肝 胎心 胎盘和胰腺 5 种 gt10cDNA 文库中扩增 , 检测 HNKA 基因在这些组织中的表达情况 . 用 Trizol (1 mL/100 mg, GIBCO 公司 )抽提胎脑 胚胎 胎盘 胎肾 外周血淋巴细胞胎心 胎脾 胎儿皮肤和脊髓等组织总 RNA, 利用Reverse Transcription System (Promega 公司 )进行RT-PCR, 同时利用 b-actin 作内对照 .( ) HNKA 基因在数据库中的分析 . 得到的新序列用 GCG 软件中的 FastA 进行分析 , Consensus 进行序列拼接 , Fr
12、ame 进行可读框的判断 , UniGene 数据库查阅 EST 的定位信息 , 采用 Seqlab 软件中的BLAST, FastA, Bestfit 和 Pileup 进行 HNKA 基因的核酸和蛋白质的序列同源性比较分析 , Peptidesort 进行蛋白质分子量计算 , Isoelectric 计算蛋白质的等电点 ; HNKA 基因 cDNA 序列在 NCBI 的 HTGS 数据库进行 BLAST 搜寻 , 以获得定位信息并确定基因结构 .( ) HNKA 基因的候选疾病分析及 HNKA 基因的突变检测 . 在 NCBI 的 Genatlas 数据库和 OMIM的疾病基因定位数据库中
13、查阅 HNKA 基因所在区段的疾病定位情况 . 设计引物 (数据未显示 )扩增基因的外显子 , 利用 PCR 产物直接测序的方法对已收集的14 个散发和家族性的痉挛性截瘫患者进行突变检测 ,测序结果利用 Dnastar 软件中的 Seqman 进行分析和比较 .2 结果2.1 数据库中的 BLAST 分析通过对人 EST 数据库的 BLAST 搜寻得到一个长 2049 bp的 EST(GenBank: u69191), u69191 是 Uni-Gene 数据库中一个 EST 簇 Hs.13285 中的一员 , 该EST 簇包括 u69191, t06525 和 h11972, 经拼接构成一个
14、长 2068 bp 的重叠群 (图 1). 拼接的重叠群和Kv2.3r (GenBank: X98564)的同源性在 1022 bp 内为87%.2.2 HNKA 基因的 cDNA 全长克隆通过 KCN1/KCN2(图 1), KCN3/KCN4 和 KCN5/KCN6 (数据未显示 ) 3组引物的 cDNA 步移 , 在 5端得到 875 bp 的新序列 , 拼接后得到一个长 2942 bp的重叠群 , 包含一个完整的可读框 , 起始密码子ATG 位于 342344 位 , 终止密码子位于 18421844位 , 编码区长 1503 bp, 编码 500 个氨基酸 . 起始密码子前的 268
15、 270 位有终止密码子 TGA. 另外 ,ATG 前的 3 位为鸟嘌呤 , 符合共有的 Kozak 序列 .此新克隆的基因被命名为人类钾离子通道 亚基基因 (human neuronal potassium channel alpha subunitgene, HNKA, GenBank 注册号 : AF167082). 利用KCN10/KCN11 引物在人脑 gt10 cDNA 文库中行 PCR扩增得到一个长 1780 bp 的片段 , 经测序证实与拼接的 HNKA 序列一致 .将 HNKA 基因在 NCBI 的数据库中进行 BLAST分析 , 发现位于 8 号染色体上的一个长 199 k
16、b 的克隆 (GenBank: AC018608)中包含 HNKA 的序列 , 经过比较后确定 HNKA 的编码区由 3 个外显子和 2 个内含子组成 , 外显子和内含子交界处序列也符合GT/AG 规则 (图 2). AC018608 定位于 8q23.1q23.2,由此将 HNKA基因定位在此区带 , 并据此选择 HNKA基因的候选疾病 . 图 1 HNKA 基因重叠群的构建Hs.13285 中的 h11972,u69191 和 t06526 三个 EST 构建的长 2068 bp 的重叠群 , 进行 5 -RACE 反应的引物 KCN1 和 KCN2 的位置如箭头所示2.3 HNKA 基因
17、的表达分析利用跨内含子的引物 KCN12/KCN13 分别在成人脑 胎脑 成人肝 胎肝 成人心和成人肾 6 种Marathon ready cDNA 以及成人脑 成人肝 胎心胎盘和胰腺 5 种 gt10 cDNA 文库中进行扩增 , 发现 HNKA 基因在成人脑 胎脑中有表达 , 而在肝脏心脏 肾脏 胎盘和胰腺等组织中无表达 . HNKA 基因的 RT-PCR 结果显示 , HNKA 在胎脑中有表达 , 但b-actin 在外周血淋巴细胞中也没有产物 , 可能是总RNA 降解或者是 RT-PCR 不成功所致 , 因而 HNKA简 报 第 46 卷 第 8 期 2001 年 4 月 675基因
18、在外周血淋巴细胞是否表达还需进一步的实验证据 (图 3).2.4 HNKA 基因 cDNA 序列及其推导的编码产物一级结构的同源性比较和分析将克隆的 HNKA 基因的 cDNA 序列和大鼠的Kv2.3r (GenBank: X98564)做 FastA 比较 , 发现二者的相似性很高 , 在 1681 bp 内一致性达 86%, 其中在编码区 1503 bp 中一致性达到 88.2%. 在氨基酸水平上 , 推导的 HNKA 和大鼠的 Kv2.3r 基因编码产物的一致性在 496 个氨基酸内达 96.4%. HNKA 编码的蛋白质由 500 个氨基酸组成 , GCG 软件计算分子量为56.3 k
19、u, 等电点为 5.87.2.5 HNKA 基因候选疾病和突变检测分析OMIM 的疾病定位数据库中查阅表明 , 定位于8q23.18q23.2 区间的未克隆的候选疾病有多个 , 包括定位于 8q23q24 区间的痉挛性截瘫 (spasticparaplegia-8, SPG8; OMIM: 603563). 设计 3 对引物(序列未显示 )分别扩增 HNKA 基因的外显子 , 利用PCR 直接测序的方法对本室收集的 14 个痉挛性截瘫患者 ( 本室分子编号 M0740, M1305, M0540,M1383, M0535, M1386, M1042, M1455, M0768,M0752, M
20、0625, M1757, M0802, M0824)进行 HNKA基因的突变分析 , 但未发现任何突变 .图 2 HNKA 基因的基因结构示意图(a) HNKA 位于 8号染色体长臂上 , 由 3 个外显子组成 , 外显子 13 的大小分别为 802, 530和 1610 bp; 2个内含子的大小分别为 1086和 3760 bp. (b) HNKA 基因的内含子和外显子的交界序列 . 大写黑正体为 HNKA 基因的编码区序列 , 大写黑斜体字母表示起始密码子和终止密码子 , 斜线表示外显子和内含子的交界处 , 交界处序列符合 GT/AG 规则图 3 HNKA 基因的表达分析(a) M 示 M
21、arker(PBR322/MspI), 左侧数字示 Marker 的片段大小 . 1 示空白对照 , 26 示胰腺 胎盘 胎心 成人肝和成人脑 cDNA, 712 示成人肾 成人心 胎肝 成人肝 胎脑和成人脑 Ready cDNA. HNKA 基因仅在成人脑和胎脑中表达 . (b) HNKA 基因的 RT-PCR 分析 . 在人组织的 RT产物中利用引物 KCN13/KCN14 (产物大小为 253 bp)进行 PCR 分析 , 利用 b-actin 作为内对照 (产物大小约 530 bp), 1 示空白对照 , 210 分别示脊髓 胎儿皮肤 胎脾 胎心 外周血淋巴细胞 胎肾 胎盘 胚胎和胎脑
22、等组织的总 RNA 的 RT-PCR 产物 , HNKA 基因仅在胎脑中有表达 (10),在外周血淋巴细胞中 HNKA 和 b-actin 均无产物3 讨论所有细胞通过离子通道的开放或关闭等来维持细胞内外的离子平衡 . 电压门控钾离子通道选择性地允许钾离子通过 , 通常由同源或异源的亚单位形成同源或异源四聚体 (homotetramer or heterotetramer),即电压门控钾离子通道的功能性单位 . 亚单位有一个共同的特点 , 即由通道孔结构域 (pore domain, P)和跨膜结构域 (TMD)组成 , 旁侧为长度可变的位于细胞质中的亲水性 N 末端和 C 末端 . Kv2.
23、3r 是第一个克隆的具调节功能的 亚基基因 , 仅在脑中表达 ,不能独自形成功能性的钾离子通道 , 其功能是选择性地和其他 亚基如大鼠的 Kv2.1 共组装成异源多聚体通道 (hetero-multimerix channels), 引起通道的电生理特性的改变 . 我们克隆的 HNKA 与大鼠 Kv2.3r 在核苷酸和蛋白质水平上均有高度的一致性 , 而且也是仅在人脑及胎脑组织中表达 ; 同时 , HNKA 和Kv2.3r 的编码蛋白质具有相似的结构 , 即都有 1 个孔结构域和 6 个跨膜结构域 (图 4), 提示 HNKA 可能与 Kv2.3r 一样 , 为一个具有调节功能的钾离子通道亚基
24、 , 其本身不能 形成功能性的钾离子通道 , 仅能选择性地和其他 亚基通道共组装成钾离子通道蛋白异源多聚体 , 而发挥其调节功能作用 . 但是 ,第 46 卷 第 8 期 2001 年 4 月 简 报676 HNKA 究竟和哪些钾离子通道 亚基共组装 , HNKA对通道如何调节均需要进一步研究来阐明 .现已发现长 QT 综合征 非综合征性耳聋 DFNA2等近 20 种神经和肌肉性疾病是离子通道基因突变所致 , 这些疾病被称为离子通道病 (channelopathies).NKA 定位在 8q23.1q23.2 位点 , 通过 OMIM 数据库图 4 推导的 HNKA 和大鼠 Kv2.3r 的氨
25、基酸序列的结构域分析HNKA.pep 和 mnka.pep 分别为 HNKA 和大鼠 Kv2.3r 蛋白质的氨基酸序列 . 氨基酸用单个字母表示 , 竖线示一致的氨基酸 , 点示氨基酸不一致 ,横线示结构域涉及的氨基酸 , S1S6 示 6 个跨膜结构域 , PORE 示孔区 , A 和 B 示位于 N 末端的保守的 A, B 盒 . A, B 盒与 PORE 结构域及 S1S6跨膜结构域的序列高度相似查询 , 将定位于此区域的一种痉挛性截瘫 (OMIM:603563)视为 HNKA 基因的候选疾病 , 但在 14 个痉挛性截瘫家系中均未检测到任何突变 , 其原因可能是由于遗传异质性的存在 ,
26、 即这 14 个家系的疾病基因并不是位于 HNKA 位点 , 进一步收集更多的痉挛性截瘫或其他定位于此位点的家系进行突变检测将有可能发现 HNKA与疾病的关系 .致谢 本工作为国家 “八六三 ”高技术计划 (批准号 : Z19-02-02-02) 国家重点基础研究发展规划 (批准号 : G1998051002)和国家自然科学基金 (批准号 : 39980018, 30070410)资助项目 .参 考 文 献1 Castellano A, Choara M D, Mellstrom B, et al. Identification andfunctional characterization o
27、f a K+ channel -subunit withregulatory properties specific to brain. The Journal ofNeuroscience, 1997, 17(12): 465246612 Walker R G, Willingham A T, Zuker C S. A drosophilamachanosensory transduction channel. Science, 2000, 287:222922343 Biervert C, Schroeder B C, Kubisch C, et al. A potassium chann
28、elmutation in neonatal human epilepsy. Science, 1998, 279(16):4034064 Edward C, Cooper E C, Jan L Y. Ion channel genes and humanneurological disease: recent progress, prospects and cha llenges.Proc Natl Acad Sci USA, 1999, 96: 475947665 Doyle D A, Morais C J, Pfuetzner R A, et al. The structure of t
29、hepotassium channel: molecular basis of K+ conduction andselectivity. Science, 1998, 280(5360): 6977简 报 第 46 卷 第 8 期 2001 年 4 月 6776 Hedera P, Rainnier S, Alvarado D, et al. Novel locus for autosomaldominant hereditary spastic paraplegia, on chromosome 8q. Am JHum Genet, 1999, 64: 5635697 Kubisch C
30、, Schroeder B C, Friedrich T, et al. KCNQ4, a novelpotassium channel expressed in sensory outer hair cells, is mutatedin dominant deafness. Cell, 1999, 96: 437446(2000-07-28 收稿 , 2001-02-08 收修改稿 )山西黄土中主要温室气体组分特征刘 强 刘嘉麒 隋淑珍(中国科学院地质与地球物理研究所 , 北京 100029. E-mail: )摘要 对晋北偏关至晋南稷山 5 个黄土剖面的大范围空间调查发现 , 黄土 -古
31、土壤序列中主要温室气体CO2, CH4 和 N2O 的浓度普遍高于它们的大气浓度 , 甚至可高达几倍或数十倍 . 黄土中 CO2 浓度在同一剖面的不同层位中没有规律性的变化 , 但空间上从北至南有逐渐升高的趋势 . 马兰黄土中 CH4 浓度不高 , 但该层之下的 CH4 浓度远高于大气中的水平 . 黄土中 CO2 的 d13C 值范围大多在 11.14 15.48(PDB)之间 . CO2 的碳同位素组成分析表明 , 黄土中 CO2 主要来源于稳定型有机质的微生物氧化分解 ,因与黄土中碳酸盐物质发生同位素交换 , 故其碳同位素组成偏重 . 由于黄土富含碳酸盐 , 因此它不仅是一个巨大的碳库而且
32、其所含的碳酸盐在次生碳酸盐化作用中对大气 CO2 具有调节作用 .关键词 黄土 -古土壤序列 主要温室气体 浓度 d13C 值 次生碳酸盐温室气体源与汇的研究是当前全球变化研究的主要论题 , 也是进行未来气候变化预测的基础 . 尽管目前人们在碳汇的位置与幅度上的认识还存在很大争议 , 但都普遍认为北半球中纬度陆地生态系统 (植被和土壤 )是一个重要的碳汇区 1. 中国黄土分布在北半球中纬度干旱 -半干旱生物气候带 , 其面积达 4.4105 km2 2, 在人为 CO2 未知汇的研究中很可能起着某种重要作用 3. 相对于浅部土壤温室气体排放吸收和 CO2 的碳同位素组成等研究 46来说 , 土
33、壤深部的温室气体浓度和同位素特征报道较少 . 国内外对堆积巨厚 约占陆地表面积 10%的黄土中温室气体组分特征的报道很少 . 为了进一步认识黄土 -古土壤序列不同层位的主要温室气体特征及其空间变化情况 , 本文是继陕西渭南 7和北京斋堂 8黄土剖面温室气体组分研究后 , 对中国黄土中主要温室气体组分特征开展的一次范围广 多层位研究 .1 采样位置与分析方法1998 年 9 月 13 日至 28 日 , 利用自制的麻花钻机从北至南 , 分别在山西省偏关 兴县 离石 蒲县和稷山等 5 个黄土剖面进行了气样和土样的采集 ,相邻两个剖面之间的南北空间距离约 80120 km. 该钻机配备有 1.5 和
34、 3 m 长的钻杆各 1 根 , 最大钻入深度为 3 m, 可进行垂直和水平打钻 . 钻杆的下部是钻头 , 其四周钻有多个毛细孔 , 以便气体交换 . 在钻杆的内部插有内径为 3 mm 的毛细管连接钻杆的上下部 ; 在钻杆的上部则用真空胶垫密封毛细管 , 防止大气的混染 . 采集气样前先用注射器针头穿过真空胶垫将毛细管抽取为低真空 (约 500 Pa), 利用毛细管负压原理使黄土中游离的气体通过毛细孔进入毛细管 , 待毛细管中的气体与黄土中游离气体保持平衡后 (5 min), 再利用 50 mL 塑料注射器抽取进入毛细管中的气体 , 并立即将注射器中的气体注入钛铝合金材料做成的容积为 500
35、mL 的取气袋中保存 . 土样是通过钻杆返回地表带上来某一深度土样而得到的 .对 5 个剖面的马兰黄土 (L1)都进行了样品采集 ,在地层出露比较完整的蒲县剖面还进行了多层黄土和古土壤中样品的采集 . 此外 , 在每个采样点上空 2 m分别采集了 1 个空气样以便进行对比分析 . 在室内对气体样品进行了 CO2, CH4 和 N2O 的浓度及 CO2的碳同位素组成 (d13Cg)分析 ; 对应的土样进行了碳酸盐含量 ( 23CO )分析 (表 1). CO2, CH4 和 N2O 的浓度是在表 1 晋北至晋南 5 个黄土剖面中主要温室气体 CO2, CH4 和 N2O 的浓度 CO2 的碳同位素组成 (d13Cg)及碳酸盐 ( 23CO )含量采样地点 样品号 层位及深度 打钻方向 CO2/L L1 CH4/L L1 N2O/nL L1 d13Cg/ (PDB) 23CO /%山西偏关 PG98air 大气 491.3 2.2 621.3PG98g01 L1, 1.0 m 垂直 1699.3 0.7 548.8PG98g04 L1, 3.0 m 垂直 1431.5 1.5 574.3 6.66
