1、576。 安徽医科大学学报Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2008 Oct；43(5) 体外抗真菌药物敏感性试验ATB FUNGUS 3法与 微量肉汤稀释法的对比评价 高锦，王中新 摘要 目的 对比分析体外抗真菌药物敏感性试验CLSI M27一A方案推荐的微量肉汤稀释法和ATB Fungus 3法。方 法采用ATB Fungus 3法和CLSI M27一A方案推荐的微量肉 汤稀释法测定102株临床分离鉴定的假丝酵母菌对常用抗 真菌药物的MIC值。结果两种方法所测假丝酵母菌对氟 康唑、伊曲康唑、伏立康唑和两性霉素B的敏感性经配对设 计的符号秩和检验，除伏
2、立康唑组外，其他三组差异均无显 著性(P005)。结论研究结果表明ATB Fungus 3法具 有操作简便、结果判读客观、量化等特点，对于伏立康唑组， 与微量肉汤稀释法比较存在差异，其他三组无差异，但可作 为临床微生物实验室抗真菌药物氟康唑的敏感性实验的筛 选方法。 主题词抗药性，真菌；微生物敏感性试验；酵母菌属 自由词假丝酵母菌；CKSI微量肉汤稀释法；ATB Fungus 3 法 中图分类号R 37；R 379；R 453；R 9785 文献标识码A文章编号10001492(2008)05057604 近年来，真菌病发病率呈明显上升趋势，特别是 条件致病性真菌感染更为常见，抗真菌药物合理有
3、 效的使用已越来越引起重视，但是，由于抗真菌药物 的广泛应用，特别是随着吡咯类药物的耐药菌株不 断增多，临床采用合适的实验方法进行抗真菌药物 敏感性测定已是当务之急。评价抗真菌药物敏感性 的最基本方法之一是测定其最低抑菌浓度MIC值。 美国国家临床实验标准化委员会(CLSI)M27一A方 案推荐的微量肉汤稀释法为体外抗真菌药物敏感试 验的标准化奠定了基础，此方案具有重复性好，一致 性高的特点，已被众多实验室认可。但操作繁琐，结 果判读困难，难于广泛开展 J。同时，随着自动化 仪器的应用和发展，ATB FUNGUS法也由于它的便 利等优点被多数大型医院的微生物实验室所采用。 本文就上述两种方法对
4、临床分离的102株假丝酵母 20080810接收 基金项目：安徽高校省级自然科学研究项目基金(编号： KJ2008B299) 作者单位：安徽医科大学第一附属医院检验科，合肥230022 作者简介：高锦，女，硕士研究生； 王中新，男，副教授，副主任技师，硕士生导师，责任作 者，E-mail：aywzhx87yahoocomcn 菌进行抗真菌药物敏感性试验结果进行分析，对比 评价ATB FUNGUS 3法和CLSI M27一A方案推荐的 微量肉汤稀释法。 1材料与方法 11材料 111 菌株来源 收集2006年l2月份2007年 6月份安徽医科大学第一附属医院临床感染患者的 标本(痰、咽拭子、尿液
5、、粪便、血液、胸腹水、胃液、 脑脊液、引流液、静脉插管及各种分泌物等)中分离 出的假丝酵母菌，剔除同一患者连续分离的菌株，共 计102株。经CHROMagar显色培养基传代两次初 步鉴定并提高了菌株的活性和纯度后，再用法国生 物梅里埃ATB细菌鉴定系统ID32C板条鉴定到种。 其中包括白假丝酵母菌67株，光滑假丝酵母菌14 株，热带假丝酵母菌13株，克柔假丝酵母菌5株，挪 威假丝酵母菌3株。标准菌株克柔假丝酵母菌 ATCC6258由北京协和医院检验科惠赠。 112培养基和试剂法国CHROMagar显色培养 基(郑州博赛生物工程有限责任公司)；ATB ID32 C 酵母菌鉴定反应板(法国生物梅里
6、埃公司)；含L一 谷氨酰胺和酚红指示剂，不含碳酸氢盐的合成培养 基RPMI一1640(Gibco公司)；三氮吗啡丙磺酸 (MOPS缓冲液，Sigma公司)；二甲亚砜(DMSO，江 晨生物)。 113抗真菌药物 氟康唑(FCA，辉瑞制药有限 公司)；伊曲康唑(ITRA，西安杨森制药有限公司)； 伏立康唑(VRC，珠海亿邦制药有限公司)；两性霉 素B(AMB，上海新先锋制药有限公司)。水溶性药 物(FCA和VRC)用灭菌双蒸水溶解，配制成l0倍 最高测试浓度的原液，一20C储存备用，FCA和 VRC原液浓度分别为1 280 ml和640 ml，使 用时用RPMI一1640倍比稀释成251 280
7、ml 和0625320 gml，再用RPMI一1640液稀释l0 倍，接种后终浓度分别为012564 ml和 0031 316 ml；脂溶性药物(ITRA和AMB)用 DMSO溶解成640 gml，一20C储存备用，使用时 用RPMI1640倍比稀释成0625320 ml，接种 安徽医科大学学报Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2008 Oct；43(5) 577 终浓度为0031 316 gml。 114 ATB FUNGUS3试剂盒法国生物梅里埃公 司产品，包括的抗真菌药物及浓度范围：FCA 025 256 gml、ITRA 01254 gml、VR
8、C 00622 ml、5一FC 05128 gml、AMB 058 ml。 12方法 121微量肉汤稀释法采用CLSI推荐的M27一A 方案操作。 1211菌接种液的制备挑取单个经CHROMa gar显色培养基传代两次活化并纯化的菌落，于无菌 生理盐水中研磨，用比浊仪调整其浓度为05麦氏 浊度，相当于(15)Z 10。CFUml，再取5 l菌液加 入5 ml RPMI一1640液体培养基中，即为1：1 000倍 稀释。 1212药液的制备取各抗真菌药物的原液用 RPMI1640液体培养基中将其倍比稀释为终浓度的 2倍，如FCA 025128 gml，ITRA 012532 ml，VRC 012
9、532 gml，AMB 058 ml。 1213加样在无菌条件下，使用经环氧乙烷灭 菌的96微孔反应板，每排由第10孔到第1孔按低 浓度到高浓度的顺序加入100 l相应的药物，第11 孔为生长对照孑L不加药物，第12孔为阴性对照孔。 在调好菌接种液15 nfin后取100 l加入相应的微 孔内，每株菌重复一排，这将使每一梯度的抗真菌药 物和菌液(2倍终浓度)分别被1：1稀释至终浓度。 经35c(=培养24 h后观察结果，在不搅动的情况下与 对照孔按下列情况比较：0肉眼清晰；1略模糊；2浊 度显著减低(50受抑制)；3浊度轻度减轻；4浊度 未减低。本试验采取1(略模糊)为判定终点基 准 j。每次
10、试验以ATCC6258为对照，只有当24 h 后FCA在1664 gml，ITRA在01205 ml，48 h后FCA在16128 gml，ITRA在012 05 gml范围内，方视为实验操作准确。 122 ATB Fungus 3微量稀释法按操作说明书 进行：挑取数个菌落混悬于无菌生理盐水中，用比浊 仪调整其浓度为2个麦氏单位，再用微量加样器取 20 l加入ATB培养基中，之后用自动加样器混匀 后自动加样于药敏板中，每孔135 txl，盖上塑料盖， 置湿盒中于35C孵育24 h，上机读取结果。也可肉 眼读取，以生长对照孔生长良好，而含药最高稀释孔 不生长者为最小抑菌浓度的终点。判定标准：FC
11、A： 8 ml为敏感，l632 ml为剂量依赖性敏 感(sDD)，64 ml为耐药；ITRA0125 ml为敏感，02505 ml为剂量依赖性敏感(s DD)，1 ml为耐药；VRC0125 ml为敏 感，02505 ml为剂量依赖性敏感(S-DD)， 1 ml为耐药；5FC4 ml为敏感，816 ml为剂量依赖性敏感(S-DD)，t32 ml为耐药。 AMB敏感性没有定义，根据操作说明I2 ml为 耐药。 123 统计学处理运用SPSS 120统计软件对 试验数据进行配对设计的符号秩和检验。 2结果 21 CLSI M27一A推荐的微量肉汤稀释法所测假丝 酵母菌对4种抗真菌药物的药敏结果见表
12、1。 22 ATB FUNGUS3法所测假丝酵母菌对4种抗真 菌药物的药敏结果见表2。 23 因试验中将药物倍比稀释成一定的浓度梯度， 故药敏结果是呈等比关系的数据，故对抗真菌药物 进行分组，将敏感、剂量依赖性敏感和耐药分别用 1、2、3表示，用配对设计的符号秩和检验进行统计 分析后，FCA组的z值为一1633，P值为0102 005，也就是说，就这一组药物而言，两种药敏方法 之间无显著性差异；ITRA组的z值为一0302，P值 为0763，也是005，同样说明对于ITRA组，两种 药敏方法之间无显著性差异；而VRC组的z值为 一2000，P=0046，说明两种方法所测的VRC的药 敏结果是有
13、显著性差异的。至于AMB组，两药敏方 法的结果均敏感，亦无差异。 表1 CLSI M27-A方案推荐的微量肉汤稀释法药敏实验结果(株) S：敏感；I：中介(S-DD)：剂量依赖性敏感；R：耐药 表2 ATB FUNGUS3微量法药敏实验结果(株) S：敏感；I：中介(S-DD)：剂量依赖性敏感；R：耐药 578 安徽医科大学学报Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2008 Oct；43(5) 3讨论 近年来，真菌感染，尤其是假丝酵母菌感染不断 增多，有资料 显示，深部真菌感染的发生率已占 医院感染病例的2039，抗真菌药物的耐药现象 亦日益严重。体外抗真菌
14、药物敏感试验与真菌感染 治疗药物的选择、疗效观察及预后均有很大关系，因 此需要建立一种准确可靠、重复性好、且简便易行的 药敏试验方法。CLSI推荐的微量肉汤稀释法具有 重复性好，一致性高的特点，而被定为真菌药敏试验 的参考方法，但操作较费时，繁琐，难于广泛开展。 以琼脂为基础的Etest试验和纸片扩散法，由于其 操作相对简便易行，无需特殊的实验仪器，而成为近 年来的研究热点E 3-4，但Etest试条的价格太高，而 纸片扩散法选择的药物比较单一，仅有FCA和 VRC。ATB FUNGUS3微量法能够同时检测临床上 常用的FCA、ITRA、VRC、AMB和5一FC五种抗真菌 药物的敏感性，其操作
15、简便，能及时为临床提供确切 的MIC值，便于临床医师更好的掌握用药剂量。 本次实验通过检测临床分离的102株假丝酵母 菌对临床常用四种抗真菌药物的敏感性，比较CLSI M27-A方案推荐的微量肉汤稀释法和ATB FUN GUS3法之间有无差异。而试验中ATB Fungus 3法 所测试的药物浓度梯度少，无法与微量肉汤稀释法 各浓度测试结果都进行比较，故本研究中将原始数 据转换成敏感，中介和耐药株数后，运用SPSS 120 统计软件进行配对设计的符号秩和检验，依据P值 从而确定两种方法之间有无差异，比多数文献中单 纯的以药物敏感性的符合率作为评价指标更为客 观。目前两种方法对AMB敏感性还没有确
16、切的判 读标准，根据操作说明t2 ml为耐药，本试验研 究中，ATB Fungus 3法和微量肉汤稀释法所测102 株假丝酵母菌对AMB的MIC值均005)，而闭孔神 经反射、导尿管留置时间、及术后膀胱冲洗例数明显少于电 切组(P005)in three groups except for the group of VRCConclu- sion The results of this study demonstrate that ATB Fungus 3 method is simple and the interpretation is objective and quantized，co
17、mpare with broth microdilution methodThere is significant statistical difference for VRChowev er，and there is no significant statistical difference for another three groupsTherefore it is recommended as a screening method for susceptibility testing of FCA against common Candida spp in the clinical microbiology laborato r)， MeSH drug resistance，fungal；microbial sensitivity tests；saccharomyces Free words candida；CLSI broth microdilution method：ATB fungus 3 method
