1、第42卷第4期 2008年12月 华中师范大学学报(自然科学版) JOURNAl OF HUAZHONG NORMA1 UNIVERSITY(NatSci) Vo142 NO4 Dec2008 文章编号:10001190(2008)O4061 2-03 产中性纤维素酶真菌产酶条件的优化 曾青兰 (成宁职业技术学院生物工程系,湖北咸宁43710o) 摘要:研究了碳源、氮源、接种量、培养时问、培养温度、培养基初始pH等条件对产中性纤维素 酶真菌菌株瓶霉菌(Phialophora spz8)产酶的影响结果表明:该菌株产中性纤维素酶的适宜碳 源为1 稻草粉加1 可溶性淀粉,最适氮源为02 的(NH )
2、zSO 加01 的牛肉膏,接种量为 5 ,培养时间为72 h,培养温度为28,培养基初始pH为67在最适宜的条件下,培养液中内 切葡聚糖酶活力可达到295 IUmI ,而天然纤维素酶活力和滤纸酶活力却很低 关键词:中性纤维素酶;Phialophora spz8;酶活力;优化 中图分类号:Q9393 文献标识码:A 纤维素酶广泛存在于自然界的生物体中按纤 维素酶催化反应的最适pH值,可将其分为酸性纤 维素酶(最适pH值为35)、中性纤维素酶(最适 pH值为68)和碱性纤维素酶(最适pH值为8 11)其中中性和碱性纤维素酶的主要成分是内切 一葡聚糖酶,该酶在棉织品水洗整理工业、造纸制 浆业等方面显
3、示了广泛的应用前景 特别是真菌 所产的中性和碱性纤维素酶一般都是胞外酶,具有 简化发酵工艺,节约资源的优势因此,正逐步显 示出它良好的使用性能和巨大的工业价值 笔者对产中性纤维素酶真菌Phialophora sp z8的产酶条件进行研究,以期为该菌的进一步研 究和开发应用奠定基础 1材料与方法 11材料 真菌菌株瓶霉菌(Phialophora spz8):笔者 从湖北咸宁天化纺业有限公司附近的中性偏碱的 淤泥中筛选获得 12粗酶液制备方法 将发酵液于4、5 000 rmin离心10 min,收 集上清液作为粗酶液备用 13酶活力的测定 纤维素酶(Cellulases)活性以内切葡聚糖酶 (CM
4、Case)的活力表示,用1 的羟甲基纤维素钠 (CMCNa)为底物进行测定;滤纸酶(FPase)以去 收稿日期:20080820 *E-mail:zqll0106163corn 淀粉的滤纸为底物进行测定;天然纤维素酶活力以 碱处理过的稻秆粉为底物进行测定 J这3种酶的 酶活力定义为:1 mL粗酶液l min催化底物生成 1 tamol葡萄糖所需的酶量为一个酶活力国际单 位,用IUmL表示 14产酶条件的优化 设定不同的产酶相关条件,进行液体培养,测 定CMCase的活力,根据CMCase的相对酶活,确 定适宜的产酶条件 1)最佳碳源的确定 设定不同的碳源组合, 28 oC,210 rrain培
5、养60 h,测定酶活力 2)最适氮源的确定ll5以1 稻草粉加1 可 溶性淀粉为碳源,分别加入03 不同氮源(02 无机氮源+01 有机氮源),28,210 rrain培 养60 h,测定酶活力 3)最佳接种量的确定设定不同接种量,取孢 子期的种子悬液接种至50 mI 培养基中,28, 210 rmin培养60 h,测定酶活力 4)最适培养温度的确定设定不同的培养温度, 5 的接种量,培养基初始pH自然,210 rrain培 养60 h,测定酶活力 5)适宜培养基初始pH的确定调节培养基酸 碱度在pH 59的范围内,5 接种量,28, 210 rmin培养60 h,测定酶活力 6)适宜培养时间
6、的确定5接种量,适宜的 碳源、氮源、初始pH,28,210 rmin条件下进 行培养,在不同生长时间进行酶活力测定 第4期 曾青兰:产中性纤维素酶真菌产酶条件的优化 15粗酶液与不同底物的反应 产酶条件优化后,取粗酶液与不同底物进行反 应,研究该酶对不同类型纤维素降解能力以初步 确定该菌所产的纤维素酶的主要成分 2结果与分析 21产酶条件的优化 1)适宜碳源结果表明(表1):1 稻草粉加 1 可溶性淀粉为碳源时,Phialophora spz8所产 的CMCase活性最高由于纤维素酶是诱导酶,在 微生物发酵过程中,作碳源的物质同时又是诱导物 的主要来源,因此选择 稻草和9,6可溶性淀粉作为 摇
7、瓶发酵的适宜碳源 2)适宜氮源结果表明(表1):02 的 (NH ) SO 加01的牛肉膏作为氮源效果最好, 因此是最佳产酶氮源 表1 不同条件对产酶的影响 Tab1 Effect of different condition on the cellulase production CMCase 产酶条件 相对酶活力 (IUmL一 ) CMCase 产酶条件相对酶活力 (IUmL一 ) 培养 时间h 培养基 初始pH 3)最佳接种量当接种量为5 时,菌体产 CMCase活可达到最大值接种量过低或过高都会 显著影响酶活性较低的接种量,营养过剩,菌丝体 徒长,但密度不够,不利于产酶;较高的接种量由
8、于 营养物质过度吸收,后期营养不良,菌丝体细小,散 热慢,不易排出废气,一般产酶能力也较低,只有当 接种量合适时,形成的生物量才能达最大值,产酶 活力才会最高 4)最适培养温度实验表明该菌的最佳产酶 温度为28(表1),低温和高温菌体生长均受影 响,产酶能力下降,酶活力则相当低 5)适宜培养基初始pH结果表明(表1):在 pH值为67时该菌产酶旺盛;酸性条件下该菌 的生长与产酶受到抑制,在pH为34的情况下, 发酵液中几乎检测不到酶活力。 6)适宜培养时问结果显示(表1):Phialo- phora spz8菌接种后12 h到72 h,产酶量稳步上 升,至72 h达最大值,此时培养液中酶活力达
9、到 295 IUmL,此为该菌的最佳产酶时间超过 72 h后,培养液中的CMCase活力逐渐下降 22粗酶液与不同底物的反应 表2结果表明,Phialophora spz8所产的中 性纤维素酶对不同类型纤维素的降解能力差异很 大,其中CMCase活力最高,而其FPase和天然纤 维素酶的活力均很低,说明该菌产生的纤维素酶的 组分较单一,且以内切葡聚糖酶为主要成分,对非 结晶纤维素降解能力最强;外切葡聚糖酶含量很 低,对天然纤维素降解能力较弱,故FPase和天然 纤维素酶活力都很低,具有这种组分结构的中性纤 维素酶系非常适用于棉织品水洗整理工业和造纸 制浆业等 表2优化培养液与不同底物的反应 T
10、ab2 The reaction of different substrate with optimzational nutrient solution 3结论 对产中性纤维素酶真菌Phialophora spz8 的产酶条件研究表明,该菌株产中性纤维素酶的适 宜碳源为:1 稻草粉加1可溶性淀粉,最适氮源 为02的(NH )SO 加01 的牛肉膏,接种量 为5,培养时间为72 h,培养温度为28,培养 n 舍; 盱船 614 华中师范大学学报(自然科学版) 第42卷 基初始pH为67在最适宜的条件下,培养液中 内切葡聚糖酶活力可达到295 IUmL,而天然纤 维素酶活力和滤纸酶活力却很低具有这
11、种组分结 构的中性纤维素酶系在棉织品水洗整理工业、造纸 制浆业等工业领域具有广阔的应用前景 参考文献: 1王冬,宋桂经,高培基芽孢杆菌074碱性纤维素酶的纯 化和性质研究J生物化学与生物物理学进展,1994,21 (3):237-241 IsZhang Y H PMichael E H,Jonathan R MOutlook for el一 3 5 6 lulase improvement:Screening and selection strategiesJ Biotechnology Advances,2006(24):452481 曾青兰,洪玉枝,刘子铎纤维素降解菌Gibberella
12、fujikuroi 产纤维素酶条件的优化I-J华中农业大学学报,2008(3): 39卜393 郑亚平,余晓斌碳源对绿色木霉ZC产中性纤维素酶的影 响J无锡轻工大学学报,2003,22(2):9-12 陈士成,曲音波,张岩,等产中性纤维素酶芽孢杆菌Y106 产酶条件优化J应用与环境生物学报,2000,6(5): 457461 韩铭海,黄俊,余晓斌高产中性纤维素酶菌株的诱变选育 和筛选方法J无锡轻工大学学报,2004,23(6):9-12 Optization of conditions for submerged fermentation of neutral cellulase by fun
13、gi ZENG Qinglan (Department of Biological Engineering,Xianning Vocational Technical College,Xianning,Hubei 437100) Abstract:Factors including carbon source,nitrogen source,inoculating quantities,in cubating time。initial temperature。initial pH et al affecting the production of cellulase have been stu
14、diedThe results showed that the best carbon source wasl straw powder and 1 soluble starch,nitrogen source was 02 (NH4)2SO4and 01 peptone,inocu lating volume was 5 ,incubating time was 72 h,initial temperature was 28and ini tial pH of culture medium was 67Under the optimal condition the activity of cellu lase(CMCase)reached 295 IUmL,natural cellulase and FPA were very lOW Key words:neutral cellulasePhialophora spz8;cellulase activity;optimization