1、中国马车薯，第l5卷，第5期，2001 摘要；文章概述了近一个世纪以来马铃薯抗晚瘦病育种的研究进展。对马铃薯晚疫病的传播与 危害、马铃薯抗晚疫病育种的历史、马铃薯的抗病机制和抗病基因克隆等作了综速，井介绍和评述了 各种生物学技术在引进和创造马铃薯抗病资源中的应用。 关键词；马铃薯育种；晚疫病 中图分类号；$532 文献标识码；A 文章编号；10010092(2001)05-0290)6 1 马铃薯晚疫病的发生、传播与危害 马铃薯晚疫病是由马铃薯晚疫病菌Phytoph bora infesmns(Mont)de Bary引起的一种真菌 病害。晚疫病起源于墨西哥，大约于19世纪传人 欧洲大陆。18
2、30年在德国首先发现了马铃薯晚疫 病“ ，但当时并未引起人们的重视。1845年，比 利时首次报道了晚疫病的发生，随后该病在欧洲迅 速传播开来，在荷兰、丹麦、芬兰、法国、意大 利、英格兰、苏格兰等国均有发生，特别是在爱尔 兰，晚疫病的流行传播造成全部马铃薯几乎无收， 引起广大居民的饥荒 j。正如恩格斯所描述：1847 收稿日期：20010621 作者简介：车先平(1973一)，男，助研，云南省袁科院生骑技 术研克所马锋薯研究开发中0，从事马锋薯抗晚疫痛育种研究。 年由于晚疫病传播引起的饥荒，“使专吃或差不多 专吃马铃薯的一百万爱尔兰人死亡，使二百万逃亡 海外 ”。 大约在20世纪70年代，由于种
3、薯贸易中带病 块茎的传播，使得马铃薯A1和A2交配型两种晚 疫病菌再次从墨西哥传播到欧洲，进而分散传播至 世界各地，据美国康乃尔大学wE Fry等调查， A1、A2两种交配型的晚疫病菌已传播到了除南极 洲和澳洲以外的世界各大洲 J。A2交配型晚疫病 菌在世界各地的不断发现 ，引起了植物病理学 家的高度重视由于新发现的A2交配型较之原有 的A1交配型具有更强的适应性和侵染力，因此8O 年代以来，新侵入的晚疫病菌生理小种已经逐渐取 代了原有的A1交配型生理小种，且两种交配型的 同时存在将导致具有厚壁和抗性的休眠卵孢子的产 生 J。卵孢子经得起冻融、长时间保存，可摆脱活 但是“新技术”说“薯自身养分
4、消耗多，促 使生理功能减弱是导致马铃薯退化的根本原因”； 及“与现在国际上马铃薯专家们的关于马铃薯低 产(退化)的观点大相径庭”的提法欠妥。论据 不足，未免有点冒昧。病害的防治从某种程度上 说，实质上是一个生态学问题。马铃薯病毒与寄 主之间在外界特殊条件影响下是相互斗争、对立 统一的两个方面。3O多种马铃薯病毒全是专性寄 生物，与其侵染植物的真细菌等病源相比，其危 害性相对要小，往往是不会对植物的组织或个体 造成迅速致死，而是使植物的生长发育受到不同 程度的干扰和抑制，从而降低了产量和品质。“新 技术”是从调整控制农田生态系统与子系统方面 创造了有利于马铃薯的生长发育，而战胜病毒的 干扰活动，
5、制止病毒病的发展，甚至不能呈现的 条件。此时马铃薯品种起主导作用，满足了其固 有的需要，从而达到不退化的目的，它是一种预 防手段，而脱毒技术是治疗手段，两者的目的是 一致的，并无矛盾之处，所以不宜作出超越条件 的解说。 维普资讯 http:/ 马特薯抗晚疫病育种研究进展率先平，何云昆，赵志坚等 体薯块而长期存活于土壤中成为新接种源，因而作 为有性生殖产物的卵孢子将进一步增加晚疫病对马 铃薯的危害。I+1前，已在墨西哥、荷兰、加拿大、 芬兰、波兰、挪威、瑞典等国发现了A1、A2交配 型之阉发生有性生殖的证据 。 在我国，马铃薯生产亦一直受到晚疫病的危 害，特别在50年代到6o年代初，华北、东北和
6、西 北曾几次发生晚疫病太流行，使马铃薯生产损失过 半“ ，在其后20年问，晚疫病时有发生 进入80 年代后，在全国范围内，特别是降水充沛的西南山 区和北方部分潮湿产区，晚疫病几乎每年都普遍发 生，因此产生的薯块产量损失达到20-800 。 1996年张志铭等在中国首次报道了交配型A2的存 在 】，随后赵志坚等也在云南发现了晚疫病菌A2 交配型“ 。这将对我国控制本来就难以防治的晚 疫病提出了新的挑战。 马铃薯晚疫病作为马铃薯生产中的头号敌人， 是所有引起粮食作物产量损失的病害中最严重的一 种真菌病害。1996年，据CIP估计，全球每年因 此病害造成直接经济损失达到170亿美元，发展中 国家的损
7、失是53亿美元，而这些国家是以马铃薯 为主要粮食和重要的经济作物，他们所遭受到的打 击比发达国家要重得多。在我国因晚疫病而发生的 产量损失每年平均亦达到10亿美元左右 。因 此，马铃薯晚疲病的防治已经成为当前世界马铃薯 生产和育种中优先考虑的目标之一。 2马铃薯晚疫病防治策略 长期以来，人们采取了各种方法来控制马铃薯 晚疫病的流行与危害：(1)采用各种栽培措施。如 作物轮作、问套作、选用健康种薯、早播和适时割 蔓等措施的台理应用在晚疫病防治中能取到一定的 作用；(2)药剂防治。施用农药是当前马铃薯晚疫 病的主要防治措施，并在生产上取得了明显的效 果，但近年来随着晚疫病菌生理小种的不断变异产 生
8、了对杀真菌荆的抗性，同时由于化学药剂价格较 高，以及对环境的污染，使得人们又再次对培育抗 病品种寄予希望；(3)栽培抗病品种。这是防治马 铃薯晚疫病最经济、最有效、最简便的方法，也是 国内外历史上使用最成功的措施。事实上，在晚疫 病150多年的防治工作中，普遍应用和收效最显著 的，莫过于栽培抗病品种。但是近年来新的晚疫病 菌生理小种的发现与传播致使很多抗病品种逐渐丧 失了原有的抗性，如云南省1998年晚疫病的流行 使得CFK691、会_2号、CIP24等抗病品种亦因 抗病性的逐渐丧失而大幅度减产。这就要求育种学 家尽快培育出高抗、持久、稳定的抗病新品种以满 足马铃薯生产的需要。 3马铃薯对晚疫
9、病的抗病机制 3 1马铃薯的抗病类型 植物发病是寄主病原物相互作用的结果，发 病表型的变异取决于寄主、病原物和环境条件三者 之闻的关系。1978年范德普朗克(JEVa nderplaI1k)根据寄主、病原物变异的关联性，把植 物病害的抗性区分为垂直抗性和水平抗性两类“ 。 在马铃薯，晚疫病菌互作中同样存在这两种抗病类 型。垂直抗性是受单基因或少数基因控制的，一般 表现为高度抗性，而在选种过程中抗、感界限明 显，便于对后代进行选择，容易进入育种程序。因 此在本世纪初从墨西哥马铃薯野生种Sdernis 中把垂直抗性引人马铃薯栽培种Stuberos “ 以来，受到育种学家和植物病理学家的普遍重 视。
10、但由于其抗病性只针对一个或少数几个病原物 生理小种，所以随着小种的变化，抗病性丧失的现 象时有发生。根据有关资料，许多高度抗病的品种 只能维持35年。因此，虽然垂直抗性在培育抗 晚疫病的马铃薯新品种中起了较太作用，但由于晚 疫病菌的生理小种多变，新的生理小种随着环境条 件和新品种的出现而不断增加，甚至抗晚疫病新品 种剐投入生产，有的品种随即受到了晚疫病新的小 种的侵染而丧失其抗病力。因此，单纯依靠垂直抗 性已经不能完全解决品种对晚疫病的抗性，必须寻 求新的抗病类型。 马铃薯对晚疫病的水平抗性是由微效多基因 控制的数量性状，虽然其抗病程度不及垂直抗 性，但由于它对病原菌不同小种都表现抗性，且 表
11、现出多种保护机制，如对晚疫病菌孢子侵入寄 主细胞的抗性、x,fm丝体侵入寄主后的抗性、抑 制孢子囊的发育和形成和抑制孢子在单位感染面 积上的形成能力等抗性 。因此，水平抗性所表 现出的优点引起了育种学家的高度重视，并使他 们改变过去的育种策略转而从事对水平抗性的研 究。 维普资讯 http:/ 中国马铃薯，第15卷。第5期2001 32马铃薯抗晚疫病遗传研究 目前在马铃薯中已鉴定了13个控制马铃薯晚 疫病菌生理小种专化性抗性的主效R基因。其中 Rl_Rl1来自马铃薯野生种Sdemissum mj， R12和R13来自于野生种Sberthaultii EZ33。同时 科学家们应用分子标记技术已将
12、一些R基因定位 在相应的染色体上：用RFLP、AFLP等技术巳经 将R1基因定位在染色体5上 ；将R3、R6、R7 基因定位在染色体ll上，并证明这三个基因高度 连锁 矧；将R2基因定位在染色体4上；将 R12和R13分别定位在染色体lO和染色体7 上 。R基因的定位、分离、克隆及其编码产物 功能的确定将有助于我们深入了解马铃薯对晚疲病 抗性的机制，进而寻找出培育马铃薯抗病品种的方 法和途径。 4马铃薯抗晚疫病育种进展 在马铃薯的原产地南美洲分布生长着许多马铃 薯种。霍克斯(Hawkes，1982)将这些马铃薯种 划分为18个系，共包含164个种，其中有8个栽 培种和154个野生种 。由于所有
13、已鉴定的马铃 薯晚疫病抗性基因均来自于马铃薯野生种，因此， 长期以来的马铃薯抗晚疫病育种实际上就是从野生 种中把晚疫病抗性基因导入到栽培种中并加以驯化 的过程。 4 1 马铃薯抗晚疫病育种的历史 l9世纪8O年代欧洲马铃薯晚疫病的流行危害 淘汰了全部感病品种，逐渐使人们意识到抗病品种 的重要性，至20世纪初开始了抗晚疫病育种。从 此育种家们一直致力于在野生种中寻找晚疫病抗性 基因并将其导入栽培种中的研究。大约在上个世纪 20年代英国租德国的育种家们在墨西哥发现了一 批非常抗晚疫病的Sdemssum野生种，利用这 些种与普通栽培种S 曲一 杂交和回交，育 成了一些新的抗病品种投入生产，但种植不久
14、这 些品种中有的丧失了抗病性。后来对这些抗性类型 进行分析，发现来源于野生种Sdemissum的抗 病性是由一组显性基因所控制，在田闻连续种植过 程中，晚疫病菌由于突变或体细胞重组，产生了能 侵染具有显性基因抗性的生理小种，使一些抗病品 种失掉抗病性变为感病品种，这即是前已述及的垂 直抗性。由于垂直抗性易于为新的晚疫病生理小种 所破坏，特别是最近几年晚疫病菌A2交配型的流 行和传播使得马铃薯的垂直抗性更加脆弱而易于被 克服，因此水平抗性育种又为育种学家所重视。由 于水平抗性的持久性和稳定性，在上个世纪8o年 代未和90年代初，国际马铃薯中心(cIP)改变过 去的抗病育种策略，在取得育成群体A的
15、成就的 基础上，又培育出一批不带R基因的纯属具有水 平抗性的材料，称为群体BB群体主要具有以下 优点：(1)抗病性质完全属于水平抗性，对病原菌 所有生理小种均具有有效抗性；(2)缺乏R基因， 简化了实生苗筛选和田间检测过程，不再需要复合 生理小种，筛选工作可以在任何生理小种条件下完 成；(3)由于简化了晚疫病抗性筛选过程，能更加 有效地与对其他病害的抗性相结合；(4)选出抗病 性和块茎产量高度结合的株系，可以作为其它育种 计划的亲本，并提供实生籽进行商业化生产 J。B 群体的开发与应用为马铃薯的抗晚疫病育种带来了 新的希望。 在马铃薯的抗晚疫病育种中，利用最多的野生 种资源是Sdemissum
16、，在各国栽培的抗病品种 中有95以上都参与了该野生种的亲缘 。除了 S demssum外，发现在其它许多墨西哥野生种如 Stoloniferttm、S声 b 、S 由疃亡而0 、 S 咖 m、S nnatitum等也都含有抗 晚疫病的R基因和微效多基因 J。若把这些野生 种的抗性基因导入栽培种中，将能有效扩大马铃薯 的基因库(gene poo1)，加快马铃薯的抗晚疫病育 种进程，培育出高抗晚疫病的新品种。 42抗病育种方法研究 前已述及，在许多墨西哥马铃薯野生种中拥有 丰富的晚疫病抗性资源。但由于野生种与栽培种之 间存在严重的有性生殖障碍，使得野生种与栽培种 杂交非常困难，甚至不能杂交成功。经
17、过对马铃薯 野生种与栽培种闻生殖隔离机制(sexual isolating meehanisms)的探入研究发现，导致马铃薯种间杂 交不亲和的原因大体可分为两类：即前合子生殖障 碍 (pre-zygotic barr?rs)和后合子生殖障碍(post- zygotie barriers) 。对于马铃薯的前合子生殖障 碍，如花期不遇、花器官结构异常、花粉在相异的 柱头上或花拄中不能正常生长和发育等原因导致杂 交不亲和，可采取一些常规的方法解决，如在不同 的环境条件下进行大量授粉 进行正反交、选择优 维普资讯 http:/ 马|争薯抗琉疫病育种研究进展一李先平，何云昆赵志坚等 良授粉者、或者切除花
18、柱，直接对其胚珠进行授粉 等措施。 后合子生殖障碍是马铃薯野生种与栽培种之间 杂交不亲和的主要原因。它主要是由于胚乳败育引 起的。对此Johnston等(1980) 提出了胚乳平 衡散(d0speml balance number，EBN)的理论， 用以预测种问杂交的可行性。该理论认为每个马 铃薯种都有一个特定的EBN，它决定着各马铃薯 种问的杂交可育性，所有成功的种间杂交，在其杂 交种的胚乳中来自母本和父本的EBN的比例一定 是2：r 研究表明，即使是两亲本间有了相匹配的 EBN，许多种之间仍不易杂交成功而只有IEBN 的马铃薯种则更加困难。针对马铃薯后合子生殖障 碍的特点，育种家利用了多种
19、生物学技术来克服马 铃薯的种间杂交不育性。 在马铃薯育种的早期阶段，由于对生殖隔离机 制还不了解，育种家只能通过实践，用杂交结实性 强的马铃薯种作为桥梁品种，与野生种进行杂交， 再用其杂交后代作为亲本材料与栽培种回交，从而 将野生种资源引入普通栽培种中。Hermsen等 ” 利用该技术成功地获得了野生种S bulocastanum 与栽培种Stuberoum的杂交种。但由于种间生 殖隔离机制的复杂性，该法只对少数马铃薯种有 用。 根据EBN的理论，马铃薯育性主要决定于杂 交种中亲本的EBN的比例，而非染色体的倍性， 因此，对野生种进行倍性操作不失为一个克服马铃 薯种问杂交不亲和性有效手段。Do
20、menico Carprto 等 针对野生种Scommersonil(2n=2x=24， llN)的情况，通过体外倍性操作，使其染色体 加倍(2n=4x=48，2EBN)，从而变为具有2EBN 的种，再用它作为亲本与二倍体材料(SPhure iaSTuberosum)(2n=2x=24，2jN)杂交， 得到F1代杂交种(2n=3x=36，2jN)，由于F1 可形成2n卵，因而能和普通载培种(2n=4x=48， 4EBN)进行杂交，将杂交产生的五倍体后代(2n =5x=60，4EBN)与普通栽培种回交即可将野生 种Scommersonii的有用基因导入育种材料中； 同样，通过倍性操作，KDAdi
21、wilaga等 蝴将四 倍体的墨西哥野生种资源(2n=4x=48，2jN) 引入到马铃薯栽培种基因池中。 胚挽救法(embryo rescue)是针对杂交后因胚 乳败育使合子不能正常发育的特点，将授精岳形成 的合子通过体外培养形成正常植株。Bob I-IRrlne marl等 利用该技术成功获得了用野生种s pinnatisectum与普通栽培种的杂交后代，并对其 杂种进行抗病性鉴定，发现其对晚疫病具有l00 的抗病性，为马铃薯抗晚疫病育种提供了非常有用 的中间材料。 与上述各种方法相比，体细胞杂交则是克服马 镥薯种问各种有性生殖障碍的一种有效方法也是 当前使用最多、研究最深入的技术。利用该技
22、术已 成功地将野生种中抗晚疫病、卷叶病毒病、线虫病 害、软腐病等多种抗性的基因引入了抗病育种材料 中。JPHelgeson等 通过体细胞杂交获得了野 生种Sbulbocastanum和普通栽培种Sbuberos m的六倍体杂种，再用其与马铃薯栽培品种Ka- tabdin或Atlantic杂交和回交，并通过4年的田间 评价，筛选到对晚疫病具有高度抗性的株系；U， Menke等 用野生种S,nnatlsectum与栽培种 Stuberosum品系进行体细胞杂交，并通过RFLP 鉴定证明获得两者的体细胞杂种植株。 43基因工程在马铃薯抗晚疫病育种中的应用 在研究植物病原互作的生物化学及分子生物 学过
23、程中，人们首先发现若干与植物防卫反应有关 的蛋白因子，这些蛋白基因组成了目前通过遗传工 程手段开发植物抗菌物病害新资源的物质基础。在 马铃薯抗病基因工程育种中也大量使用了这些病程 相关(PR)蛋白基因：1994年Dong Liu等 首 次报道了组成型表达烟草Osmotin蛋白的转基因马 铃薯植株推迟了晚疫病病斑出现时间；随岳Zhu 等 发现组成型表达马铃薯Ostrtin-Like蛋白的 马铃薯转基因植株能降低Pinfestans的侵染频 率；1999年，李汝刚等 克隆了缺失c端信号肽 序列(引导蛋白在细胞液胞内定位)、保留N端信 号肽序列(引导蛋白分泌至胞外)的烟草Osrrmtin 蛋白基因，
24、并证明Om,otin蛋白基因胞外分泌能够 赋予转基因植株叶片抗晚疫病的能力；G Wu等 报道葡萄糖氧化酶(GO)基因在转基因马铃薯中 表达， Q水平升高，降低了晚疫病菌对马铃薯 的侵染速度；在国内，甄伟和张立平等分别将GO 基因导入裁培品种台湾红皮、大西洋(Atlantic) 和夏波蒂(Shepody)中，均获得对晚疫病具有明 显抗性的株系 ：周思军等 将菜豆几丁质酵 维普资讯 http:/ 中国马祷薯，第l5卷第5辫2001 基因导人马铃薯栽培品种“鲁引1号”和“鲁引4 号”中亦获得成功；最近Ali GS等 将Ambi dopsis thaumatin-like protein 1(ATLP
25、1)基因导人 马铃薯栽培种Desiree中，证明组成型表达ATLP1 基因的马铃薯对晚痰病具有一定抗性。 PR蛋白基因在植物基因工程育种中得到广泛 的应用，并取得了明显的抗病效果。但同时PR蛋 白本身也存在着一些不利因素如它的抗病效果仅 只是针对有限的病原菌种类，并且单一的、专化性 的修饰活性很容易被病原菌所克服。对此， PJGMde Wit_45。作了有益的探索，他根据基因 对基因假说，通过对番茄Cladosporiumlvum互 作的分子基础研究，提出了一个非专化的抗病双元 系统(tvacomponent system for nonspecific msis tance)，该系统认为，把
26、无毒基因(口 )和抗病 基因(R)组装于同一细胞中，在适合的启动子调 控下，将会引起寄主被侵染细胞的过敏性坏死，从 而限制病原菌的扩散，达到抗病的目的。遣个系统 的关键是要选择一个适合的启动子，这个启动子应 该是病原侵染诱导型而非组成型表达的，否则寄主 的健康细胞亦会因转入基因的表达而受到伤害。 NorbertMartini等 等发现，马铃薯prpl一1基因 的启动子表达专一受Pinfestara侵染诱导。 GunterStfittmatter等 利用这个启动子孵特点， 在含有harstar基因的马铃薯中导人由prpl一1启动 子片段驱动的细菌核酸酶(bamase)基因，结果表 明在转基因后代
27、中Pinfestans的产孢率大大降 低。受非专化的抗病双元系统的启发，李汝剐提出 利用植物病原细菌在非寄主王诱导过敏性反应防治 植物病害的基因工程设想 ，建构了由prpl一1启 动子驱动的，来自梨火疫病菌(Erwlnia amylovo m)的Harpin蛋白基因，并将该基因转入二倍体 马铃薯种Liner和R2中，结果表明表达Harpin蛋 白的转基因马铃薯植株降低了晚疫病的病斑生长 率 。本实验将Harpin基因导人马铃薯栽培种大 西洋(Atlantic)中亦获得成功 5结语 经过一个世纪的马铃薯抗晚疫病育种实践，育 种家们培育出了一批在生产上大面积使用的抗病品 种。但由于马铃薯Pinfe
28、stans的协同进化，加之 A2交配型晚疫病菌在世界范围的广泛传播，使得 已育成的抗病品种经受着严峻的考验。当前各种生 物学技术在育种中的应用为马铃薯抗晚疫育种剖造 了许多优良的抗病材料，但这些材料要在生产中应 用还有大量的工作要傲。如对这些材料的田阃抗病 性评价、野生性状的驯化以及对转基因材料的安全 性评价等。因此，在生物技术飞速发展的今天，我 们在应用这些先进技术的同时，还得与传统的常规 育种紧密结合起来，才能加快马铃薯育种进程，尽 快培育出更多高产、丰产、优质的马铃薯新品种服 务于生产。 参考文献 1黑龙江省农业科学院马铃薯研究所主编中国马斡薯栽培学 M中国农业出版杜295 2Austi
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41、shmce and fr - ing 。 cejntransgenic potato p1mts。【pI rsense and 一 sense genesfor蛆osmotin-like proteia Planta，1996，198：70 77 4o李故刚等表选(nodn蛋白的转基因马铸薯对晚疫病的抗 性分 】生物工程学撮1999，15：I35140 41WuG，et Dhee resistance ecderred by exgnion of geae 廿1l硝 H2 -generating oxkhse_m tranagenlc poltao ph nts 11lePlantCell，1
42、9 7：13571368 42甄伟等转基因马铃薯中病原诱导GO基因的表达爰其对晚 疫病的抗性J科学通报，2OOO，45：10711075 43张立平等表达葡萄糖氧化酶基因抗晚疫病马特薯的培育 M面向21世纪的中国马特薯产韭(2OOO)暗尔滨工翟 大学出版桂，108一I16 44周思军等通过农杆菌介导将菜豆几丁质酶基因导马斡薯 J中国马锋薯，2000，14：7022 45deWitPJGM，Molecular charaeterimtkm gmr- geae systems ha l 0f呱Igl mtezzctiom and the hc of iru g伽in。口 plant g哪 Anu
43、Rev 一 topathol，1992，30：391418 46Maxtinl Norbert， P工 加ter sequences of a potato patlm genesisreatedg目 mediatetiansationa v jon 3el睇t油 upDn in MoGenGoaet1993，236：179186 【47 J tnn毗盯C-mter，计 IrLMbiticuof h1署 disease d p- merit Inphntby印面leE eoatadhd cell tll Biorfhchml ogy，19 ，13：10851089 48李汝同I植物一病原相互作用的分子基础与植物宿害的控制 策略J农业生物技术学报1994 2(1)：113 49李故同I，范云六表选 n蛋白的转基因马斡薯降低晚疫 病班生长率 J中国科学19991 维普资讯 http:/
