rna-direct realtime pcr master mix.pdf

1、 08-01One-step qPCR Kit RNA-directTM Realtime PCR Master Mix Code No. QRT-101, 101T 研究用 使用说明书 TOYOBO CO.,LTD.Biochemical Operations Department OSAKA JANPAN Distributor:Shanghai SOLOMON bio-sci&tech,Co.Ltd. Tel:+86-21-33782046 Email: 目 录 1 简介 1 2 制品内容 3 3 必需品 4 4 使用方法 6 5 相关实验 12 6 常见问题 15 7 相关产品 17

2、【 注意 】 本产品为研究用试剂。请勿作为诊断、临床试剂使用。 在使用本产品时，请严格遵守实验室 的一般注意事项，安全操作。 “Purchase of this product is accompanied by a limited license to use it in the Polymerase Chain Reaction (PCR) process for The Research Field in conjunction with a thermal cycler whose use in the automated performance of the PCR process

3、is covered by the up-front license fee, either by payment to Applied Biosystems or as purchased, i.e., an authorized thermal cycler.” LightCyclerTM是Idaho Technology Inc. 的注册商标。 TaqMan是Roche Molecular Systems Inc. 的注册商标。 ABI PRISM是Applied Biosystems Inc. 的注册商标。 RNA-direct Realtime PCR Master Mix 垂询电话

4、：021-58794900 Http:/www.bio- 1 1 简介 本品采用 Thermus thermophilus HB8 株来源的rTth DNA 聚合酶，该酶在二价锰离子（ Mn2+）存在下具有很强的逆转录活性，利 用该特性，开发出单酶一步法定量PCR试剂盒。逆转录反应和PCR 反应在同一反应体系连续进行，仅需一次加样即可完成，减少了样品间交叉污染的危险，而且操作简便，尤其适用于高通量实验。 特征 1. 逆转录反应和定量 PCR反应在同一反应体系中进行 本品以 RNA 为模板，逆转录反应和 PCR 反应在同一反应体系连续进行，实验快速方便，非常适合于高通量实验。同时也减少了样品间交

5、叉污染的风险。 2. 可应用于高级结构复杂的 RNA和高GC含量的模板 本品采用单种耐热性 rTth DNA 多聚酶。和通常的逆转录酶相比较，可以在高温进行逆转录，非常有利于对具有复杂高级结构的 RNA 模板进行逆转录反应，同时该酶对高 GC 含量的模板也有出色的扩增表现，在定量 PCR 实验中也能高效扩增。 3. 快速热启动 本品采用抗体热启动，对控制非特异性扩增非常有效。同时，抗体在高温下会迅速失活， 释放多聚酶活性， 最大限度地避免了高温对 RNA 模板和聚合酶活性的损伤。 4. 高适用性 可应用于 LineGene（BIoFlux 公司） ， LightCycler（Roche 公司）

6、， ABI PRISM（ ABI公司）等仪器。RNA-direct Realtime PCR Master Mix 垂询电话：021-58794900 Http:/www.bio- 2 2 制品内容本品含以下组分。 品名内容 保存 QRT-101 (50l 反应 x 100 回用) QRT-101T (50l 反应 x 40 回用) RNA-directTMRealtime PCR Master Mix -20 （4，2 个月） 避光保存 500l x 5 500l x 2 50mM Mn(OAc)2-20 500l x 1 200l x 1 RNA-directTMRealtime PCR

7、Master Mix Master Mix是 2反应液，含反应buffer 、dNTPs 、rTth DNA 多聚酶和多聚酶抗体，以及passive reference 。使用时，加入RNA 模板、引物、Mn(OAc)2溶液及DEPC 水至 1即可。 Master Mix 请在-20保存，融解后须上下颠倒混匀方可使用。使用后重新-20保存，通常冻融 10 次以内不会影响实验，但也请尽量避免反复冻融。如果一次使用量较少，可以在融解后分装成几管，每次取一管使用。如果短期内需多次使用，可在 4保存，但须在 2 个月内用完。注意必须避光保存。 50mM Mn(OAc)2逆转录反应必需溶液。通常按反应体

8、系的 1/20 体积（终浓度 2.5mM）添加，根据RNA 模板的不同，也可适当增减 Mn(OAc)2的终浓度，以获得更高的扩增效率。 RNA-direct Realtime PCR Master Mix 垂询电话：021-58794900 Http:/www.bio- 3 3 实验必需品 除本品外，还需以下仪器和试剂。 定量 PCR 仪器 本品适用于 LineGene（BIoFlux 公司），LightCycler （Roche 公司），ABI PRISM （ABI 公司）等仪器。请根据各仪器的操作说明书进行实验。 引物及探针 请根据目的基因的序列设计引物以及探针，引物以及探针设计对定量PC

9、R 实验的精确性和重现性非常重要。 以下是设计引物的一般注意事项： - 引物长度20-30mer ， GC含量在40-60 之间。 - 扩增片段应小于200bp ，过长的片段会降低扩增效率，而且容易导致非特异性反应，影响准确定量。 - 引物设计尽量横跨内含子，探针应选择在外显子的边缘，以防止基因组DNA 的扩增而引起假阳性。 RNase-free 水 建议使用超滤制备的 RNase-free 水，如果使用 DEPC 水，请通过高压灭菌去除 DEPC，否则残留的 DEPC 会影响反应。另外，用于定量 PCR 的水不要和其它实验混用，以避免污染影响定量。 Total RNA 本品可直接以 Tota

10、l RNA 作为模板进行定量。通过常规 AGPC（Acid Guanidium - Phenol Chloroform ）法制备的 Total RNA 中可能会混入基因组 DNA，从而造成假阳性，必要时可用 DNase I 等试剂去除。在组织、细胞等样本中，作为目标检测对象的 mRNA 含量通常仅占 Total RNA 的 1-2。 poly(A)+RNA (mRNA) 具有 poly(A)+结构的mRNA 可通过oligo(dT)制备。通过纯化过程， mRNA得到高度浓缩，通常用于对mRNA 的高灵敏度检测。需要注意的是，mRNA 比Total RNA 更容易被RNase 所降解，操作时需要

11、特别小心。 RNA-direct Realtime PCR Master Mix 垂询电话：021-58794900 Http:/www.bio- 4 4 使用方法 1. 使用LineGene (BioFlux 公司) 的TaqMan分析法 (1)反应液的配制 PCR 反应液 (例 ) 蒸馏水（RNase free Grade ） Up to 10 lRNA-directTMRealtime PCR Master Mix 5 l50mM Mn(OAc)20.5l引物 1 (终浓度 0.3M ) 3pmol引物 2 (终浓度 0.3M ) 3pmolTaqMan 探针( 终浓度 0.2M ) 2

12、 pmol样品 RNA 溶液 500ngTotal 10l蒸馏水必需用 RNase-free 水，建议用过滤法生成的 RNase-free 水。如用 DEPC 水，请通过高压灭菌彻底去除DEPC。另外，避免与其它实验混用 RNase-free 水。 引物添加量在 2-6pmol（0.2-0.6 M）间调整，扩增不好时，可适当加大引物量，但引物量过多，可能会造成非特异性扩增。 探针添加量在 0.5-3pmol（0.05-0.3 M）间调整，扩增不好时，可适当加大 TaqMan 探针量，但 TaqMan 探针量过多，可能会造成非特异性扩增。 Mn(OAc)2终浓度通常为 2.5mM，根据RNA 模

13、板浓度和序列的不同，有时在 1.5-3.5 mM浓度范围内适当增减Mn(OAc)2浓度会得到更好的结果。 作为的模板的RNA ，通常 Total RNA不要超过 500ng， poly(A)+RNA（mRNA ）不要超过 100ng，模板过多会降低反应效率，从而造成扩增曲线的线性不好。 (2)PCR 的实施 RT-PCR 温度设定( 例) 变性 1 90 30s RT 61 20min 变性 2 95 30s RNA-direct Realtime PCR Master Mix 垂询电话：021-58794900 Http:/www.bio- 5 PCR 循环 95 15s （45Cycles

14、 ） 60 45s（data collection ） 熔解曲线分析 本品是高速热启动产品（参见第 2 页），第一次变性过程 90， 30s（变性 1）后，即可充分释放酶活，过分加热会影响酶活性及损伤模板 RNA 的稳定性。 请根据所使用的荧光色素类型，选择相应的 detection channel。 2. Applied Biosystems 7900HT（ ABI公司）的 TaqMan分析法 (1)反应液的配制 PCR 反应液 (例 ) 蒸馏水（RNase free Grade ） Up to 50 lRNA-direct Realtime PCR Master Mix 25 l50mM

15、Mn(OAc)22.5l引物 1 (终浓度 0.3M ) 15pmol引物 2 (终浓度 0.3M ) 15pmolTaqMan 探针( 终浓度 0.2M ) 10 pmol样品 RNA 溶液 2.5gTotal 50l蒸馏水必需用 RNase-free 水，建议用过滤法生成的 RNase-free 水。如用 DEPC 水，请通过高压灭菌彻底去除DEPC。另外，避免与其它实验混用 RNase-free 水。 因为添加量在 10-30pmol（0.2-0.6 M）间调整，扩增不好时，可适当加大引物量，但引物量过多，可能会造成非特异性扩增。 因为添加量在 2.5-15pmol（0.05-0.3 M

16、）间调整，扩增不好时，可适当加大 TaqMan 探针量，但 TaqMan 探针量过多，可能会造成非特异性扩增。 Mn(OAc)2终浓度通常为 2.5mM，根据RNA 模板浓度和序列的不同，有时在 1.5-3.5 mM浓度范围内适当增减Mn(OAc)2浓度会得到更好的结果。 作为的模板的RNA ，通常Total RNA 不要超过 2.5g，poly(A)+RNA（mRNA ）不要超过 500ng，模板过多会降低反应效率，从而造成扩增曲线的线性不好。 RNA-direct Realtime PCR Master Mix 垂询电话：021-58794900 Http:/www.bio- 6 (2)P

17、CR 的实施 RT-PCR 温度设定( 例) 变性 1 90 30s RT 61 20min 变性 2 95 60s PCR 循环 95 15s （45Cycles ） 60 60s（data collection ） 熔解曲线分析 本品是高速热启动产品（参见第 2 页），第一次变性过程 90， 30s（变性 1）后，即可充分释放酶活，过分加热会影响酶活性及损伤模板 RNA 的稳定性。 请根据所使用的荧光染料类型，选择相应的 detection channel。 上例采用 Applied Biosystems 7900HT 的标准模式。 RNA-direct Realtime PCR Mast

18、er Mix 垂询电话：021-58794900 Http:/www.bio- 7 3. 使用LightCyclerTM(Roche公司) 的TaqMan分析法 (1)反应液的配制 PCR 反应液 (例 ) 蒸馏水（RNase free Grade ） Up to 20 lRNA-direct Realtime PCR Master Mix 10 l50mM Mn(OAc)21l引物 1 (终浓度 0.3M ) 6pmol引物 2 (终浓度 0.3M ) 6pmolTaqMan 探针( 终浓度 0.2M ) 4pmol样品 RNA 溶液 1gTotal 20l蒸馏水必需用 RNase-free

19、 水，建议用过滤法生成的 RNase-free 水。如用 DEPC 水，请通过高压灭菌彻底去除DEPC。另外，避免与其它实验混用 RNase-free 水。 因为添加量在 4-12pmol（ 0.2-0.6M）间调整，扩增不好时，可适当加大引物量，但引物量过多，可能会造成非特异性扩增。 Mn(OAc)2终浓度通常为 2.5mM，根据RNA 模板浓度和序列的不同，有时在 1.5-3.5 mM浓度范围内适当增减Mn(OAc)2浓度会得到更好的结果。 作为的模板的RNA ，通常 Total RNA不要超过 1g， poly(A)+RNA（mRNA ）不要超过 200ng，模板过多会降低反应效率，从而

20、造成扩增曲线的线性不好。 (2)PCR 的实施 RT-PCR 温度设定( 例) 变性 1 90 30s RT 61 20min 变性 2 95 30s PCR 循环 95 0s （45Cycles ） 60 45s（data collection ） 熔解曲线分析 RNA-direct Realtime PCR Master Mix 垂询电话：021-58794900 Http:/www.bio- 8 本品是高速热启动产品（参见第 2 页），第一次变性过程 90， 30s（变性 1）后，即可充分释放酶活，过分加热会影响酶活性及损伤模板 RNA 的稳定性。 请根据所使用的荧光染料类型，选择相应的

21、 detection channel。 本品支持 20 /sec的快速升温模式，扩增效果不佳时，可试着在退火和延伸步骤将升温速度降至 2/sec。 5 相关实验 1. Total RNA 的 DNase I 处理 用 AGPC(Acid Guanidium-Phenol-Chloroform)法等常规方法制备的 Total RNA 中经常会混入基因组 DNA，必要时可通过 DNase I 处理，方法如下： (1)反应液配制： 反应液组成（例） 蒸馏水（RNase free Grade ） Up to 10 lTotal RNA X g10DNase I Buffer 1lRNase-free

22、DNase I （10U/ul ） 0.5lTotal 10l(2)反应和纯化 上述反应液置冰浴反应 10-30min。 加入 100l 蒸馏水，100 lTE 饱和酚，混匀后，冰浴 5min。 12,000rpm、离心 5min，取上清。 加入 100l 氯仿，混匀。 12,000rpm、离心 5min，取上清。 加入 5l 20mg/ml 肝糖（共沉剂），100 l 5M 醋酸胺，200 l 异丙醇，混合均匀，-20放置 30min。 12,000rpm、离心 5min，弃上清。 在沉淀中加入 70乙醇洗涤。 12,000rpm、离心 5min，弃上清。 RNA-direct Realti

23、me PCR Master Mix 垂询电话：021-58794900 Http:/www.bio- 9 用适量蒸馏水溶解沉淀。 2. poly(A)+RNA纯化法 目的基因含量很低时，将Total RNA 纯化成poly(A)+RNA，可提高灵敏度。以下以MagExtractor -mRNA- （code No. NPK-801，在磁硅珠上结合有oligo(dT)，专用于mRNA 的纯化）为例介绍poly(A)+RNA的纯化。 (1)纯化前 DNase I 反应液配制： 反应液组成（例） MagExtractor -mRNA- 溶出液 Up to 100 lTotal RNA（ 100g）

24、X g10DNase I Buffer 10lRNase-free DNase I （10U/ l） 1lTotal 100l上述反应液冰浴反应 15min。 加入 400l 溶解液（含 2-ME）和 800l 吸附液。 (2)纯化 在新的 1.5ml 离心管中加入 250l 磁硅珠。 使用磁性台架（Magical Trapper (Code No. MGS-101) ）进行固液分离（B/F 分离），弃上清。 在磁珠中加入上述处理后的 Total RNA 溶液。 充分混匀。 室温放置 10min。 固液分离（B/F 分离）弃上清。 加入 1ml 洗净液。 充分混匀。 固液分离（B/F 分离）弃

25、上清。 加入 1ml 洗净液。 充分混匀。 RNA-direct Realtime PCR Master Mix 垂询电话：021-58794900 Http:/www.bio- 10 固液分离（B/F 分离）弃上清。 加入 1ml 洗净液。 充分混匀。 固液分离（B/F 分离）弃上清。 Spin down，再次去除上清。 加入适量溶出液 充分混匀。 65温浴 2min。 充分混匀。 Spin down。 固液分离（B/F 分离）回收上清。 在MagExtractor -mRNA- 试剂盒的标准操作中，上述纯化过程须重复 2 次，虽然一次纯化也能满足通常的实验需要，但是对poly(A)+RNA

26、的纯度要求很高时，建议重复 2 次，以彻底除去可能残留的基因组DNA 和rRNA 。 关于纯化操作，详细说明请参考 MagExtractor -mRNA- 试剂盒的说明书。 RNA-direct Realtime PCR Master Mix 垂询电话：021-58794900 Http:/www.bio- 11 常见问题 扩增曲线混乱或没有 (1) PCR仪设定方面的问题( 参照相应仪器的说明书) 原因 对策 Detector 的设置与荧光染料不匹配 根据荧光染料的种类不同，对检测仪器的设置进行相应的更改，然后再进行实验。 数据收集的设定不恰当 针对荧光标记的探针和引物的各种分析方法，根据实

27、验的不同，data collection 的推荐设定位置也有差异，请确定最优化的设置后再进行实验。 样品位置设定错误 设定适当的样品位置后再进行分析或再进行实验。 仪器方面的其他故障 请根据各仪器的说明书进行点检。 PCR 条件、引物序列或浓度不当 请确认引物浓度及 PCR 条件，扩增不好时，通常先尝试降低退火温度，延长退火时间和提高引物浓度，有时也可以提高退火温度，增加延伸时间，降低升温速度。对于 GC 含量高的模板，可以适当延长变性时间。如果还是扩增不好，请重新设计引物。 RNA 质量问题 RNA 模板可能被降解，重新抽提 RNA。 定量值重现性差 原因 对策 仪器方面 因为仪器的不适用，

28、在温度管理或检测时产生重现性差。请根据相应仪器的说明书进行点检。 样品纯度不好 不纯的样品会导致实验的重现性差。请使用混匀的样品。另外，样品中残留的基因组 DNA 也可能导致定量值偏差，请用 DNase处理以除去基因组 DNA。 PCR 反应条件、引物浓度、序列等不恰当 扩增效率差的 PCR 较容易产生重现性差。通过变更引物的浓度或 PCR 反应条件来进行调整。扩增不好时，一般可降低退火温度或提高引物浓度，也可以延长延伸时间。如模板的 GC 含量较高，可延长变性时间。仍得不到改善时，建议重新设计引物和探针。 计量误差 反应体积太小会导致检测精度下降。请根据定量 PCR仪推荐的反应体积重新实验。

29、 空白样品中有信号（ 请在熔解曲线分析的基础上进行判断。） 原因 对策 阳性样品或 PCR 产物污染 首先请更换用作空白样本的水。如果还发生同样情况，请分别检查蒸馏水、引物或另启用一管新的 Master Mix后再进行实验。 RNA-direct Realtime PCR Master Mix 垂询电话：021-58794900 Http:/www.bio- 12 7 相关产品 高特异性一步法定量 PCR 试剂（Taqman 探针法） 品名 内容 Code No. RNA-directTMRealtime PCR Master Mix（掺入法） 500l x2 500l x5 QRT-201T

30、 QRT-201 RNA 制备相关试剂 品名 内容 Code No. MagExtractorTM-mRNA- 5 回用 NPK-801 MagExtractorTM-RNA- 50 回用 NPK-200 Magical Trapper 1 个 MGS-101 Realtime PCR 相关试剂 品名 内容 Code No. Realtime PCR Master Mix（探针法） 1ml x1 1ml x5 QPK-101T QPK-101 SYBRGreen Realtime PCR Master Mix（染料法） 1ml x1 1ml x5 QPK-201T QPK-201 ReverTra Ace -50 回用 FSK-100 ReverTra Ace10,000U x1 TRT-101 RNase Inhibitor 2,000U x1 2,000U x5 SIN-101 SIN-101B Manufacturer TOYOBO CO.,LTD. Biochemical Operations Department OSAKA JANPAN 代理商 上海硕盟生物科技有限公司 上海浦东新区高科西路 3000 弄 35 号 邮编： 201204 联系方式 Tel:+86-21-33782046 33782006 Email: Http: