1、江 红三所五室,核酸研究的基本技术,1. 核酸的分离、纯化和鉴定: 基因组DNA、质粒、总RNA 2. PCR技术: 反应体系、常见的PCR技术、PCR产物的克隆、表达、鉴定 3. 核酸分子的杂交: Southern-blotNorthern-blot 4. 新基因的克隆和功能研究,Tm值(DNA的熔点或解链温度),概念：指加热变性使 DNA的双螺旋结构失 去一半时的温度。,一、核酸的分离、纯化和鉴定 基因组DNA的分离、纯化：PCR、 Southern- blot、构建基因组文库实验材料：哺乳动物组织(50100mg)哺乳动物细胞(5x106107),实验步骤：RT 匀浆：TE pH8.0
2、组织( 液氮冻存、研磨)消化：EDTA 、SDS、蛋白酶K、RNase 37/55 抽提：酚、氯仿、异戊醇沉淀：异丙醇 / NaAc+无水乙醇洗涤：75乙醇干燥：风干溶解：TE / H2O,注意事项：1. 试剂：pH值准确 2. 蛋白酶K：20mg/ml， 分装，-20，避免反复冻融 3. 抽提：完全，不要触及蛋白层4. 干燥：避免过分5. 操作：小心，机械剪切作用，80100kb,2. 总RNA的分离纯化: RT-PCR、Northern-blot实验材料：哺乳动物组织(50100mg)哺乳动物细胞(5x106107),实验步骤：匀浆：Trizol 组织( 液氮冻存、研磨)抽提：氯仿沉淀：异
3、丙醇 / NaAc + 无水乙醇 RT 15min洗涤：75乙醇干燥：风干溶解：DEPC-H2O保存：分装，-70，避免反复冻融,注意事项：(1) 无RNase环境：手套勤换、试剂专用、DEPC处理玻璃器皿：180C干烤8小时以上塑料器皿：氯仿冲洗0.1%DEPC水溶液浸泡(RT 12h或37C 2h)，高压灭菌去除DEPC,(1) 核酸的定量：,OD260：DNA, RNA; OD280：蛋白质 浓度： 1OD260： 50g/ml ds DNA40g/ml ss DNA，总RNA35g/ml 单链RNA20g/ml 单链寡核苷酸 核酸纯度: OD260 / OD280 DNA 1.8RNA
4、 1.72.1 2.0OD260和OD280应大于0.05，,(2) 核酸的凝胶电泳：分离、纯化琼脂糖凝胶电泳：agarose, 水平, TAE, EB(2ng), 紫外灯,迁移率：同样大小的分子 超螺旋 线性分子 缺口或松弛,DNA Marker: DL2000, DNA/Hind,聚丙烯酰胺凝胶电泳: PAGE(Acr+Bis)，垂直，银盐染色非变性，变性,4. 质粒：概念：细菌等微生物细胞染色体以外，能独立进行复制和遗传，赋予宿主细胞一定生物学性状的共价闭环双链DNA分子。,载体：指可容忍外源DNA片段插入、可在细胞间转移并能在细胞内自主复制的DNA分子。如:细菌质粒、噬菌体和某些病毒,
5、组成：复制子、启动子、多克隆位点、选择标记基因,复制子：ColE1, pMB1, pSC101，控制着质粒在细菌中的拷贝数。启动子：位于表达载体，启动基因的转录，如Ptac, PCMV, PSV40等。多克隆位点(MCS)：人工合成的含多个单一限制性内切酶识别位点的一段特殊的DNA序列，便于酶切、插入重组和克隆DNA分子。选择标记基因：Ampr、Tetr、Kanr、Neor,分类,按用途分类克隆载体表达载体：含有强启动子，使克隆化的外源基因转录产生大量的mRNA。依其发挥作用的宿主细胞不同，分为 原核、真核、酵母、昆虫、病毒表达载体。,按复制能力分类严谨性质粒：它们的复制伴随着染色体复制，1几
6、个拷贝。 松弛型质粒：它们的复制与染色体复制无关，10200拷贝，常用。,穿梭质粒：人工构建两种不同复制起点和选择标记两种不同的宿主细胞中存活和复制转移基因基因表达活性和功能,分离：碱裂解法、煮沸法：剧烈，小质粒 去污剂(SDS)裂解法：易受损的大质粒 (15kb),碱裂解法,收菌 重悬：TE-葡萄糖 裂解：变性，NaOH-SDS 5min 中和：复性，KAc 抽提：酚:氯仿:异戊醇(25:24:1) 沉淀：异丙醇 洗涤：70乙醇 溶解：TE-RNase A,纯化：氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心聚乙二醇分级沉淀法,Kit: 碱裂解，DNA介质(硅胶、玻璃奶),互补现象,pUC系列质粒(lac操纵
7、子),-半乳糖苷酶氨基端,细菌 (-半乳糖苷酶N-末端缺陷型),蓝色菌落,外源DNA插入,白色菌落,-半乳糖苷酶,缺陷型,蓝白筛选,1.原理 2.反应体系 3.类型 4.PCR产物的克隆、表达和鉴定,二、PCR(聚合酶链式反应)技术,1985, Mullis K, PCR，Klenow 1988, Saiki, Taq 酶,1、原理: 模板变性、引物退火、DNA pol进行DNA合成,PCR产物呈指数方式增加 2530个循环 理论109 实际105107,2、PCR反应体系：25100 l,1)模板DNA：单链或双链DNA, 避免DNA聚合酶抑制剂和能结合DNA的蛋白质污染, 10.1g。,2
8、)引物：人工合成的两段与待扩增靶DNA侧翼片段互补的寡核苷酸。20pmol,3)Mg2+的浓度：反应产物的特异性和产量，1.5mmol/L。,4)dNTP：50200mol/L，四种dNTP浓度相同。,5)Taq DNA聚合酶：Klenow, Taq酶, 高保真Taq酶, 2.5U/100l 。,6)参数：94 5min - 30(94 30sec - 55 30sec - 721 min)- 72 7min,1)长度一般为1825个碱基； 2)尽可能选择碱基随机分布的序列； 3)两条引物的G+C的百分比应尽量相似，多为4555%； 4)避免引物内部形成二级结构； 5)两引物之间不应发生互补，
9、特别是在3端; 6)引物3末端碱基可以影响Taq酶的延伸效率，最好 选T、G或C，而非A；7)引物5端允许有一段序列不与模板配对, 内切酶，保护碱基。,引物设计原则,退火温度计算公式：1) T=2(A+T)+4(G+C)-352) T=22+1.46 ln35 ln=2(G or C)+(A or T) 2035nt3) T=81.5+16.6lgJ+0.41(G+C%)-(600/l)-0.63(FA%)J+=monovalent cations l=oligonucleotide length FA=formamide 1470nt,Taq酶合成延伸速率：22 0.25nt/sec， 37
10、 1.5nt/sec，55 24nt/sec，70 60nt/sec 1.Taq酶单克隆抗体: 低温与Taq酶结合，抑制活性;高温与Taq酶解离，释放活性。 2.模板变性后加入Taq酶。,热启动PCR: 提高特异性,3、影响因素,模板：ng级的质粒DNA，g级基因组DNA。 引物：引物浓度不宜偏高，否则易形成引物二聚体。 Mg2+浓度：特异性及产量 dNTPs浓度：正确性和产量 Taq酶用量：非特异性 循环参数：常规为2530个循环,对照：阳性对照阴性对照：不加模板,4、特点：特异性、有效性、忠实性,操作简便省时； 灵敏度高； 特异性较强，但有一定的假阳性率。提高退火温度可以提高特异性； 对原
11、始材料的质量要求较低； 有一定程度的单核苷酸错误掺入。因为Taq DNA聚和酶缺乏35核酸外切酶活性，不能纠正反应中发生的错误核苷酸掺入。,1)反转录PCR：RT-PCR,5、常见类型,PCR,关键：总RNA完整性反转录引物,随机引物,特异下游引物,第一轮PCR,第二轮PCR,2)巢式PCR: 模板数低,3) RACE: cDNA末端的快速克隆,AAAAA,m7Gppp,5,3,5RACE,3RACE,3RACE,5RACE,方法一：Cap-Finder,方法二 GeneRacer,连接头,cDNA第一链,5末端,3末端,1.第一链的合成至关重要1) 确定所需的mRNA的存在2) mRNA中存
12、在的稳定二级结构可能对反转录有影响，采用热稳定的具反转录活性的DNA聚合酶2.反转录结束后通过两次NH4Ac沉淀去除多余dNTP和引物3.内源性同聚序列的影响1)降低引物的用量 0.5pmol/g mRNA/20l反应体积2)避免太低的杂交温度,注意,4)长片段PCR,Taq酶：LA Taq酶 5U/ 50l反应 dNTP: 2.5mM 8 l 延伸：5min 循环：25,6)差异PCR,5)DNA指纹分析：随机引物,遗传学图谱绘制、系统生物学、发育生物学,1)大量扩增目的核酸片段 2)克隆新基因 3)生物多态性的研究 4)核酸测序 5)在核酸中引入突变 6)检测基因的整合、表达情况 7)疾病
13、的诊断,6、PCR在生物学中的应用,1.需突变位点位于基因两侧，只需在合成引物时，直接加上突变碱基即可；2、当突变位于基因的中间部位时，可以采用以下两种方法进行突变,在基因中引入突变,方法一,方法二,DNA的序列测定：Sanger双脱氧链终止法测序的原理,单链模板DNA,测序引物,5,3,4种dNTP(包括 32PdNTP) DNA聚合酶,ddTTP,ddCTP,ddGTP,ddATP,造成链末端终止的双脱氧核苷酸,新合成的DNA,1)阴阳性对照2)配制PCR混合物PCR buffer+dNTP+H2O3)控制污染: 靶序列污染，气溶胶 紫外线照射更换实验场所、设备、试剂暂停实验,7、注意事项
14、,8、限制性核酸内切酶,核酸酶：是一类能切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键，使核酸分子多核苷酸链发生水解的蛋白酶。基因工程中最常用的核酸酶是核酸内切酶。限制性核酸内切酶: 简称限制酶，是一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的DNA水解酶，它能特异地结合于限制酶识别序列或其附近的位点，并在此切割双链DNA分子。,概念,分类,I类: 识别部位复杂，特异性差，在识别序列周围400 7000bp范围内切割DNA。II类：能识别双链DNA的特定序列并进行切割，产生特异的DNA片段，常规应用于分子克隆中。III类：在识别位点周围2727bp范围内切割DNA。,命名原则,EcoR I,第一个大写字
15、母：属的缩写两个小写字母：种的缩写第二个大写字母：不同变种和品系的缩写罗马数字： 同一微生物中多种限制酶分离的顺序,特征,识别序列：46个核苷酸，迴文结构。切割产物：同时切割dsDNA的两条链平滑末端或粘性末端,酶活性单位,一个活性单位：在适当的反应条件，1小时，完全酶解1g DNA底物，限制性内切酶的量。,单酶切/双酶切反应：30 l,37 4h,标准的酶解反应：50l反应体系，1U内切酶，最适反应条件， 1小时，1g DNA完全降解。,影响活性因素,DNA：纯度、甲基化程度、分子结构缓冲液：pH值溶液：离子种类及浓度消化反应的温度 反应体系中甘油浓度,指改变酶反应条件时，酶原有的识别特异性
16、降低的现象，即限制酶在非标准反应条件下，能切割一些与其特异识别序列相似的序列。一般在相应限制酶的名称右上角加一个星号(*)表示。几乎所有的限制酶都具有。,星号活力：Star活力,星号活力的诱发因素,甘油含量高：酶量不超过反应体积的10%； 1/30内切酶用量过大：100U/gDNA； 210U/g DNA离子强度低：25mmol/L； 推荐BufferpH值高：pH7.58.5, EcoRI出现*；pH7.0含有机溶剂：DMSO，乙酸等; DNA纯度二价阳离子：Mn+, Co+, Zn+等； Mg+,9、PCR产物的克隆、表达和鉴定,PCR产物,A-T克隆,测序,重组表达载体,重 组 蛋 白,
17、制备抗体,检测活性,转 染 细 胞,1)查找目的基因序列：mRNA序列 NCBI GenBank,1 atg aat ttt caa cag agg ctg caa agc ctg tgg act tta gcc aga 45 1 M N F Q Q R L Q S L W T L A R 1546 ccc ttc tgc cct cct ttg ctg gcg aca gcc tct caa atg cag atg 90 16 P F C P P L L A T A S Q M Q M 30541 gac gta gaa gca gct ctg acc aaa gcc ctt ggg gaa
18、 gtg gac att 585 181 D V E A A L T K A L G E V D I 195586 ctt ctg acc tgg atg cag aaa ttc tac aag ctc tga 621 196 L L T W M Q K F Y K L *,2)酶切位点分析,http:/pga.mgh.harvard.edu/web_apps/web_map/start,3)设计引物,选择载体,原核表达载体：His: pET, pRSETGST: pGEX 酵母载体：YCP 真核表达载体：pcDNA3, pcDNA3.1myc: pCMV-myc, pcDNAmyc/HisH
19、A: pcMV-HAFlagGFP: pEGGFP-N, pEGFP-C, pIRES2-EGFPRFP 昆虫表达载体： 病毒表达载体：pAdEasy,His-tag,GST-tag,5 保护碱基+酶切位点+起始密码+目的基因序列 3,1 atg aat ttt caa cag agg ctg caa agc ctg tgg act tta gcc aga 45 1 M N F Q Q R L Q S L W T L A R 15,上游引物,上游有标签 读框,586 ctt ctg acc tgg atg cag aaa ttc tac aag ctc tga 621 196 L L T W
20、M Q K F Y K L *,下游引物: 反向互补,5 保护碱基+酶切位点+终止密码+目的基因反向互补序列 3,下游有标签 读框,4)PCR 5)PCR产物的A-T克隆和亚克隆DNA凝胶回收：KitPCR产物和T载体的连接：T4DNA连接酶，16 12h感受态细菌的制备转化挑克隆提质粒：Kit双酶切鉴定测序和分析冻存菌种,NCBI Blast,6)重组蛋白的制备：细菌,宿主菌,重组表达载体,重组蛋白表达,表达形式分析,亲和纯化,7)重组表达载体在哺乳动物细胞中的表达,脂质体：Lipofectamine2000，效率低病毒系统：腺病毒、逆转录病毒、腺相关病毒，效率极高,8)表达的鉴定mRNA水
21、平: Northern-blot, RT-PCR, 原位杂交蛋白质水平：Western-blot, 免疫组化9)功能分析,1.概念：质粒，-互补，穿梭质粒，PCR，热启动PCR，RT-PCR，限制性核酸内切酶，A-T克隆 2.方法：核酸分离：DNA、RNA、质粒核酸定量PCR，RT-PCR克隆，亚克隆,小结,参考文献,1.金冬雁,黎孟枫译.分子克隆试验指南 2.颜子颖,王海林译.精编分子生物学试验指南 3.黄培堂等译.PCR技术试验指南 4.姜泊等.分子生物学常用实验方法 5.公司Protocol： Invitrogen，Clontech，Santa Cruz, Promega，ToKaRa 6. Weaver RF. Molecular Biology. 2e, 2002 (影印版),谢谢,
