1、欢迎大家参加读书报告会,三亚市人民医院 陈 林 2013 . 08,载脂蛋白CIII链接高脂血症与血管内皮细胞功能障碍,Contents,Background,富含甘油三酯的VLDL apoCIII 在IR.MS合并富含甘油三酯的LDL 血脂异常PKC 损害血管内皮细胞对胰岛素的反应激活血管内皮细胞的炎症和动脉粥样硬化的信号建立假说 apoC影响血管内皮细胞胰岛素信号和其功能。,Methods and Results,apoC抑制胰岛素诱导IRS-1酪氨酸磷酸化，减少HUVECs PI3K/ Akt的活化。,apoC使eNOS活化受到影响，减少NO释放到介质中。,1,2,3,4,apoC激活H
2、UVECs的PKC，导致IRS-1通过丝氨酸磷酸化功能障碍。,apoC通过PKC激活丝裂原活化蛋白激酶。,Methods and Results,PKC抑制剂或MEK1抑制剂修复受损胰岛素信号。,apoC和富含apocIII的VLDL损害了小鼠主动脉和HUVECs胰岛素信号，但他可被PKC抑制剂修复。,总结,5,6,7,同时，它们还抑制小鼠主动脉内皮依赖性舒张。,VLDL中的apoCIII激活PKC抑制IRS-1/PI3K/Akt/eNOS通路，损害血管内皮细胞、诱导血管内皮功能紊乱，损害胰岛素刺激NO的产生。,Conclusion,对于AS来说，apoCIII是链接血脂代谢紊乱和胰岛素抵抗对
3、血管内皮细胞产生间接有害影响的一个关键环节。,Foreword,载脂蛋白CIII是一种小分子蛋白，以多种形式存在于VLDL表面，少部分存在于LDL表面。apoC抑制VLDL和LDL从血浆中清除，造成致AS的脂蛋白和富含apoC的LDL、TG、CH在血浆中集聚，延长AS脂蛋白在血浆中停留时间，这些在DM和AS血脂异常中更为明显。人群研究表明apoC与CHD风险之间的相关性可能归因于apoC直接参与了AS的形成。血浆中含有apoC的VLDL和LDL水平用来预测CVD的风险。,Foreword,我们最近研究表明：1、富含apoC的VLDL比无apoCIII停留时间长；2、 apoC对血管细胞有直接的
4、促炎、致AS的作 用；3、apoC激活了单核细胞和内皮细胞增加他们在AS中的相互黏附作用。,Clinical Perspective,内皮障碍,NO利用,EH.AS,舒张 抗AS,正常,异常,IR.IRS1.PI3K,胰岛素靶组织,胰岛素,NO生物利用度,eNOS激活,NO： 强效舒血管 抗AS,丝裂原活化 蛋白激酶激活,胰岛素抵抗,高胰岛素血症,内皮素1,刺激分泌,ET1：强效血管收缩剂,胰岛素,x,内皮细胞功能障碍,血脂异常,MS,apoCIII,apoCIII,apoCIII,apoCIII,apoCIII,apoCIII,apoCIII,启动子负向调控胰岛素,胰岛素作用受损,有联系,P
5、KC,激活,抑制胰岛素激活,损伤胰岛素信号,NO,apoCIII导致AS和其连接的血脂异常 与血管内皮细胞功能紊乱机制,apoCIII,Methods1 Cell Culture and Reagents,人脐静脉内皮细胞（HUVEC）培养并检测。 载脂蛋白用高效液相色谱和免疫亲和柱色谱法从人血浆中纯化。 载脂蛋白中内毒素水平采用鲎变形细胞溶解产物显色试验法测定，小于0.03 EU / ml。 载脂蛋白中游离脂肪酸（FFA）使用酶法测定水平，20 nmol /l。 抗载脂蛋白抗体 PD98059、渥曼青霉素、PKC特异性抑制剂 胰岛素,Methods2 Lipoprotein Preparat
6、ion,10名健康志愿者，禁食12小时采血。受试者没有服用心血管药物，抗氧化剂，激素。涉及人体受试者伦理问题遵守东京医科齿科大学人权委员会协议的准则。VLDL中的载脂蛋白水平通过ELISA进行测定。通过酶法测定VLDL甘油三酯水平。VLDL中内毒素水平0.03 EU / ml。,分离,含apoCIII的VLDL,无apoCIII的VLDL,EDTA,Methods3 Immunoblotting,使用apoC和有apoCIII的VLDL来孵育HUVECs， 然后使用胰岛素刺激,使用抗PKCI抗体、抗PKCII抗体与膜结合的蛋白 对PKC的激活进行检测,Methods4,量化NO和ET-1培养基
7、中或血浆NO水平测定按照制造商试剂盒的说明书通过一氧化氮比色法进行测试。培养基中的ET-1水平测定通过ELISA试剂盒（酶联免疫试剂盒）进行测定。体内apoC刺激 请参阅在线数据补充的材料和方法部分。等距张力测量 请参阅补充材料和方法部分。,Methods5 Statistical Analysis,结果采用平均值标准差，用非配对t检验对数据进行分析或双因素方差分析。P 0.05认为有统计学意义。,Results1: ApoCIII Inhibits Insulin-Stimulated IRS-1Tyrosine Phosphorylation in HUVECs,通过胰岛素刺激，胰岛素受体
8、激活血管内皮细胞PI3K/Akt信号,使IRS-1酪氨酸磷酸化。A.使用不同浓度apoCIII来孵育HUVECs 30分钟后，使用胰岛素刺激。剂量依赖性。 B. 使用相同浓度apoCIII用不同时间来孵育HUVECs，然后使用胰岛素刺激。孵育时间不同 C.使用apoCIII来孵育HUVECs然后使用胰岛素刺激。,加入apoCIII变化不大，说明apoCIII不影响IR磷酸化,胰岛素增加IR磷酸化,间接推出apoCIII影响下游的IR,Results2：ApoCIII Inhibits Insulin-Stimulated PI3K/Akt and eNOS Activation in HUVE
9、Cs,图:使用一定浓度的apoC或渥曼青霉素(wort）来孵育HUVECs，然后使用胰岛素刺激。,apoCIII浓越高PI3K磷酸化越低,apoCIII影响胰岛素刺激PI3K的磷酸化,PI3K抑制剂wort消除了胰岛素诱导eNOS活化以及NO释放,A.不同浓度的apoC孵育HUVECs (PKCI.II) B.C:apoC孵育HUVECs，然后使用胰岛素刺激，对照组在孵育前30分钟，向培养液中加入PKC-特异性抑制剂。,Results3：ApoCIII Activates PKC in HUVECs,PKCII是apoC损伤 胰岛素信号转导中心环节,不同亚型PKC介导炎症和细胞事件，PKC活化
10、， 抑制胰岛素诱导eNOS激活，导致血管舒张功能受损。 apoC激活PKC，诱导粘附分子表达上调。,A.apoC孵育HUVECs，然后使用胰岛素刺激： B.对照组在孵育前30分钟培养液中加入PKC-特异性抑制剂,胰岛素诱导ERK活化,apo增强胰岛素诱导ERK活化,apoCIII使pERK,抑制剂部分逆转,Results4 ApoCIII Activates MAP Kinase in HUVECs,C.apoC孵育HUVECs。在孵育前30分钟向培养液中加入PKC-特异性抑制剂或PD98059。D. E.F：apoC孵育HUVECs，然后使用胰岛素刺激，在孵育前30分钟加入PKC-特异性抑制
11、剂或PD98059。,apoC诱导IRS-1的Ser616磷酸化,被PKC-特异性抑制剂阻断,被PD98059部分逆转,PD98059部分逆转apoC抑制NO释放,提示ERK参与这一过程,apoC增加了培养液中ET-1水平,可以被PKC特异性抑制剂清除也可以被PD98059清除,这些结果表明apoC通过胰岛素抵抗这一特殊途径 促使或增加血管舒张和血管收缩之间的不平衡,Results4 ApoCIII Activates MAP Kinase in HUVECs,A.B：使用不同浓度的apoC，IV给小鼠,30分钟后收集小鼠主动脉。C：使用apoC.IV小鼠，在注射前30分钟，IV.PKC-特异
12、性抑制剂，30分钟后，收集主动脉。D-F：使用apoC静脉注射给小鼠。在apoC注射前30分钟，使用PKC-特异性抑制剂IV。在30分钟后，小鼠腹膜腔内使用胰岛素刺激。,PKC特异性抑制剂逆转apoC的抑制作用， 它还修复了被apoC减少的血浆NO水平,apoCIII在500ug时激活PKCII、ERK,apoC使IRS-1 Ser612磷酸化被PKC-特异性抑制剂抑制,D.E.F:胰岛素使pIRS-1Ser612.peNOS. NO,被apoCIII抑制,PKC抑制剂使其恢复,Results5 ApoCIII Inhibits Insulin Signaling in the Aortas
13、of C57BL/6J Mice,A.B：对小鼠静脉注射含有apoCIII的VLDL和无apoCIII的VLDL。30分钟后，收集主动脉和血液。C.给小鼠静脉注射含有apoCIII的VLDL。在注射apoC的前30分钟，使用PKC-特异性抑制剂IV。 30分钟后，收集主动脉。D.E：对小鼠静脉注射含有apoCIII的VLDL或无apoCIII的VLDL。在注射apoC的前30分钟使用PKC-特异性抑制剂IV。30分钟后，使用胰岛素腹膜内注射。10分钟后收集血液和主动脉。,Results6 VLDL CIII+ Inhibits Insulin Signaling in the Aortas o
14、f C57BL/6J Mice,A.B:含apoCIII的VLDL刺激PKCII激活和小鼠主动脉中IRS-1的Ser612的磷酸化。不含apoCIII的VLDL对此影响小,C.含apoCIII的VLDL刺激IRS-1的Ser612的磷酸化，PKC抑制剂可部分抑制这一效应。,D.胰岛素使pTyr989 ，VLDLCIII+抑制这一效应，PKC抑制剂使其恢复。,E.胰岛素使NO, VLDLC-影响不明显，VLDLC+使NO明显，PKC抑制剂使其恢复。,A.将apoC静脉注射小鼠体内。在注射apoC的前30分钟，使用PKC-特异性抑制剂，30分钟后，分离主动脉做等距张力测量。B.静脉注射含有apoC
15、III的VLDL或无apoCIII的VLDL，30分钟后，分离主动脉做等距张力测量。PE：去氧肾上腺素CCh：卡巴胆碱,Results7 ApoCIII Inhibits Endothelium-Dependent Relaxation in the Aortas of Mice,apoC刺激小鼠离体主动脉环 显著地损伤了内皮依赖性舒张， 这些可被PKC特异性抑制剂所修复,VLDLCIII+损伤了内皮依赖性舒张， 相反,不含apoCIII的VLDL对其影响小,Discussion1,目前第一次报道：apoCIII和富含apoCIII的VLDL引 起血管内皮细胞的胰岛素抵抗。 我们的证据：暴露于
16、血管内皮细胞中的apoCIII抑制 胰岛素刺激eNOS活性和NO产生。 临床研究：MS、T2DM中胰岛素抵抗与apoCIII相关。 据报道：肝细胞中胰岛素抵抗通过异常Foxo1造成apo产生过剩。 我们研究结果表明：血清中apoC的增加不只是胰 岛素抵抗的临床表现，而且也是内皮细胞中胰岛素 抵抗过程中的一个致病因子。,Discussion2,VECs,IRS1/PI3K/Akt,PKC,胰岛素,激活,eNOS,胰岛素抵抗,激活,Akt,eNOS,apoCIII,细胞黏附分子1表达,丝氨酸磷酸化,IRS-1功能,功能障碍,增加,apoCIII通过PKC造成VECs功能障碍,apoCIII通过eN
17、OS途径激活 MAPK,我 们 发 现,apoCIII,ERK+,MAPK+,+,胰岛素+,抑制剂逆转,MAPK影响eNOS通路,ET-1,NO,？,apoC造成血管收缩/血管舒张之间不平衡,Discussion3,肝细胞中的胰岛素抵抗增加apoCIII产生和其分泌到血液中。 富含甘油三酯脂蛋白中apoC通过抑制IRS-1在血管内皮细胞的功能又削弱胰岛素诱导NO的产生。 apoC抑制NO产生的作用，可能是间接通过激活PKCII，部分是ERK，从而诱发IRS-1的丝氨酸磷酸化。,Discussion4 apoC引起血管内皮细胞胰岛素抵抗的机制,Discussion5 apoCIII诱导VECs功
18、能障碍,本实验（小鼠）,apoCIII损伤,VECs中,胰岛素信号,先前实验（人）,口服负荷量脂肪,血脂异常者,健康受试者,VECs功能紊乱,细胞粘附分子,现有理论,apoCIII影响脂肪分解代谢,高脂血症,VECS急性直接影响,apoCIII,induced,内皮细胞 功能障碍,鼠主动脉胰岛素信号,内皮依赖性舒张,Discussion6 apoCIII的浓度相关性,研究表明：apoC在100微克/毫升时损伤血管内皮细胞胰岛素信号、造成血管内皮功能障碍。流行病学研究：apoCIII的风险从较低水平开始呈梯度分布，apoCIII越高，风险越高。临床研究支持：apoC浓度与内皮细胞的功能相关。,D
19、iscussion7 apoCIII与胰腺细胞,研究表明：apoC使小鼠胰岛素分泌受到损伤，这与apoCIII造成培养基中胰腺细胞凋亡相一致。 本研究还发现：apoC对胰岛素信号的影响与细胞类型的特异性相关。,Conclusion,高甘油三酯血症与VECs功能障碍的相关性已经明白：FFA和富含甘油三酯的脂蛋白削弱胰岛素的作用和/或内皮功能障碍。我们的研究阐明了一个新机制：富含甘油三酯的脂蛋白携带的一种致病因子，即apoC，它在代谢综合征中是将血脂异常和内皮细胞功能障碍联系起来的一个关键分子。,我们走的更远,CLINICAL PERSPECTIVE,AS.EH.CHD,NO利用度,抗AS,缩血管,胰岛素抵抗,内皮细胞功能障碍,心血管疾病的主要危险因素,DM，肥胖，血脂异常,apoCIII,作用于VECs,抑制胰岛素活化eNOS,NO,内皮细胞功能障碍,高甘油酸酯血症,FFA,胰岛素抵抗,insulin signaling,脂蛋白,apoCIII,血脂异常,apoCIII,高脂血症,内皮细胞功能障碍,apoCIII,请老师批评指正！,Thank You !,
