1、重组牛 IFN- 蛋白单克隆抗体的制备 豆思远 豆玲 周峰 张莉 康新华 王佳 甘肃省动物疫病预防控制中心 摘 要： 本研究以纯化原核表达重组蛋白 rBovIFN-PET28a-His 为免疫原, 以重组蛋白为筛选抗原, 通过杂交瘤细胞技术, 研制出 5 株稳定分泌 rBovIFN- 单克隆抗体的细胞株, 命名为 1C11、6E2、7F7、9F5、10C8;腹水效价分别为 112 800、16 400、112 800、125 600、112 800。5 株单抗中:1C11、7F7、9F5、10C8 只与 rBovIFN-PET28a-His 反应, 而不与 IFN-、IFN-、IL-4、白介素
2、 2、鸡 IFN- 等其他细胞因子发生交叉反应;6E2 除了与 rBovIFN-PET28a-His 反应外, 还与鸡 IFN- 发生交叉反应。Western blot 分析表明, 4 株单抗均能特异性识别并结合 rBovIFN-, 纯化后的 5 株单抗的腹水效价分别为 16 400、13 200、16 400、112 800、16 400;同时, 本研究制备的兔抗 rHis-BoIFN- 多抗效价达 125 600。关键词： 奶牛结核病; 重组牛 IFN-; 单克隆抗体; 作者简介：豆思远 (1988-) , 男, 甘肃庆阳人, 硕士, 兽医师, 从事动物疫病预防控制工作。作者简介：豆玲 (
3、1984-) , 女, 甘肃兰州人, 硕士, 兽医师, 从事动物疫病预防控制工作。收稿日期：2017-04-27基金：甘肃省农业科技创新项目 (GNCX-2011-43) Preparation of Recombinant Bovine IFN-Protein Monoclonal AntibodiesagainsDOU Si-yuan DOU Ling ZHOU Feng ZHANG Li KANG Xinhua WANG Jia Animal disease prevention and control center of GanSu Province; Abstract： In thi
4、s paper, five cell lines of secreted stable monoclonal antibodies named 1 C11, 6 E2, 7 F7, 9 F5 and 10 C8 were prepared through hybridoma cell technology which the recombinant protein rBovIFN-PET28 a-His was used as an immunogen and the recombinant protein was used to screen the antigen.The five cel
5、l lines ELISA titers of the ascites were 112 800, 16 400, 112 800, 125 600 and 112 800, respectively.Among these cell lines, 1 C11, 7 F7, 9 F5 and 10 C8 could only react with rBovIFN-PET28 a-His recombinant protein, rather than other cytokines such as IFN-、IFN-、IL-4、IL-2 and chichken-IFN-.While, the
6、 6 E2 cell lines have a potential cross-react not only with rBovIFN-PET28 a-His but also with chichken-IFN-.The results of Western-blot showed that all of these four monoclonal antibodies could recognize and bind to rBovIFN-specificity, and the ELISA titers of the ascites were 16 400, 13 200, 16 400
7、, 112 800 and 16 400 respectively after the purification of these 5 monoclonal antibodies.At the same time, the titers of the ascites could be 125 600 for the polyclonal antibody to Anti-rabbit rHis-BoIFN-made by this research.Keyword： Bovine IFN-protein; recombinant protein; monoclonal antibodies;
8、Received： 2017-04-27BovIFN- 单抗在牛疫病检测中具有重要的价值, Wood 等最先将抗原特异性IFN- 试验用于牛结核病的检测。与传统的 TST 相比, 抗原特异性 IFN- 试验不仅简单、快速、灵敏、特异, 而且由于减少了前者试验中操作和解释上的主观性, 使结果更为客观、可靠。这一检测方法的大范围田间试验已在世界上许多国家 (包括澳大利亚、爱尔兰、比利时、新西兰、阿根廷、西班牙、意大利和美国) 完成, 并在澳大利亚、爱尔兰和新西兰被批准为正式试验。近年来, 国内也有 BovIFN- 单克隆抗体制备的相关报道。本研究用纯化的原核表达产物 rBovIFN-PET28a-
9、His 重组蛋白免疫 BALB/c 小鼠, 通过淋巴细胞杂交瘤技术, 以纯化的原核表达融合蛋白 rBovIFN-PET28a-His 为包被抗原, 建立间接 ELISA 方法筛选阳性杂交瘤细胞克隆, 成功获得 5 株稳定分泌抗 rBovIFN-McAb 的杂交瘤细胞系, 为进一步研究 BovIFN-McAb 在牛结核病等诊断中的应用奠定了基础。1 材料1.1 试剂胎牛血清购于杭州四季青公司;胰蛋白酶、PEG2000、EDTA、D-hanks、DMEM、L-谷氨酰胺、HEPES、RPMI1640 细胞培养基、1640 完全培养液、HT 培养液、HAT培养液、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、BSA、
10、DAB、TMB 底物溶液、HRP 标记的羊抗小鼠 IgG 以上试剂均购自 sigma 公司;单克隆抗体亚型鉴定试剂盒购于荷兰 HBT 公司;Protein A 预装柱为基因公司产品;其他试剂均为国产分析纯。BALB/c 小鼠、ICR 小鼠、日本长耳兔购自兰州兽医研究所实验动物中心, BL21 (DE3) /pET-28a (+) 、原核表达纯化融合蛋白 rBovIFN-PET28a-His, 骨髓瘤细胞系 Sp2/0 均为本室制备和保存。1.2 仪器设备本研究所用仪器设备均由甘肃省动物疫病预防控制中心实验室提供。2 方法2.1 小鼠免疫重组蛋白 rBovIFN-PET28a-His 进行初次免
11、疫, 四周后进行第二次免疫。两周后采小鼠尾静脉血离心取血清测效价 (用 ELISA 方法检测) 效价较高的小鼠融合前三天取抗原 25g 加强免疫。2.2 骨髓瘤细胞的制备取 3 瓶生长状态良好的骨髓瘤细胞, 计数后待用。2.3 免疫脾细胞的制备取加强免疫小鼠一只, 眼眶采血后脱臼处死, 在 75%酒精中消毒后取脾脏, 去除结缔组织, 制备脾细胞悬液, 计数后待用。2.4 细胞融合利用淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合。2.5 筛选方法的建立采用纯化的重组蛋白 rBovIFN-PET28aHis 作为包被抗原建立间接 ELISA 方法作为筛选试验。2.6 杂交瘤细胞的克隆培养经过 23 次克隆化培养
12、杂交细胞。2.7 单克隆抗体的生产和效价测定10 周龄 BALB/c 小鼠腹腔注射液体石蜡 0.30.5mL/只, 710d 后, 腹腔注射杂交瘤细胞 510/只, 8d 后用针头收集腹水, 离心取上清, 间接 ELISA 测定效价。2.8 单抗生物学特性鉴定2.8.1 单抗亚类鉴定按单克隆抗体亚类鉴定试剂盒介绍方法进行。2.8.2 单抗特异性的鉴定将 IFN-、IFN-、IL-4、白介素 2、鸡 IFN- 以及牛 IFN- 按适当浓度包被酶标板, 用间接 ELISA 法检测单抗反应的特异性。2.9 单克隆抗体的纯化利用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化单抗。2.1 0 兔抗 rHis-BoIFN- 多抗
13、制备以相同免疫程序同时免疫三只兔子, 两周后第二次免疫, 四周后第三次免疫, 经兔背部皮下多点注射, 每只 1mg。三免后 10d 耳静脉采血测抗体水平, 颈动脉插管放血收集血清备用。3 结果3.1 免疫血清效价免疫后的 BALB/c 小鼠尾静脉取血, 离心后取上清作为检测样品。用重组蛋白抗原包被 ELISA 板, 将血清做 100 倍稀释后, 倍比稀释检测血清抗体的效价。结果表明:BALB/c 小鼠产生的抗重组蛋白 rBovIFN-PET28a-His 抗体的效价为2100。3.2 杂交瘤细胞株的建立获得 5 株能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞, 连续培养, 细胞生长良好, 反复冻存与复苏后, 仍
14、保持稳定的抗体分泌能力, 将其分别命名为:1C11、6E2、7F7、9F5、10C8。3.3 单抗培养上清和腹水抗体的 ELISA 效价采用间接 ELISA 法测定 5 株单抗培养上清及其腹水抗体滴度 (见表 1) , 杂交瘤上清间接 ELISA 效价为 11 600、1800、11 600、13 200、1800, 腹水效价为 112 800、16 400、112 800、125 600、112 800。表 1 单抗培养上清和腹水抗体效价 下载原表 3.4 单抗亚类鉴定结果用单克隆抗体亚类鉴定试剂盒经鉴定:1C11、6E2、9F5、10C8 为 IgG1, 7F7 为IgM 类。3.5 单抗
15、特异性的鉴定采用间接 ELISA 试验, 5 株单抗与几种细胞因子的反应 (见表 2) , 5 株单抗中, 1C11、7F7、9F5、10C8 只与 rBovIFN-PET28a-His 反应, 而不与其它重组细胞因子反应;6E2 除了与 rBovIFN-PET28a-His 反应外, 还与鸡 IFN- 发生交叉反应。表 2 5 株单克隆抗体与几种细胞因子的交叉反应 下载原表 3.6 单抗 Western-blotting 分析结果所获得的腹水单抗与 rBovIFN-PET28a-His 均有特异性免疫结合, 在 19KD 处出现条带, 且 9F5 和 10C8 特异性较强, 结果见图 1。图
16、 1 单抗 Western-blotting 分析结果 下载原图1.1C11, 2.7F7, 3.空白对照, 4.9F5, 5.10C83.7 纯化单抗效价应用间接 ELISA 法, 检测 1C11、6E2、7F7、9F5、10C8 纯化前腹水的效价为112 800、16400、112 800、125 600、112 800, 纯化后的效价为16 400、13 200、16 400、112 800、1:6 400。3.8 兔抗 rHis-BoIFN- 多抗制备通过间接 ELISA 测定抗体滴度, 血清从 1100 开始稀释, 结果表明:制备的兔多克隆抗体的效价为 125 600。4 讨论本研究
17、制备的 5 株单抗中:1C11、7F7、9F5、10C8 只与 rBovIFN-PET28a-His反应, 而不与 IFN-、IFN-、IL-4、白介素 2、鸡 IFN- 等其他细胞因子发生交叉反应;6E2 除了与 rBovIFN-PET28a-His 反应外, 还与鸡 IFN- 发生交叉反应。Western blot 分析表明, 4 株单抗均能特异性识别并结合 rBovIFN-, 纯化后的 5 株单抗的腹水效价分别为 16 400、13 200、16 400、112 800、16 400;同时, 本研究制备的兔抗 rHis-BoIFN- 多抗效价达 125 600。说明本研究制备的 5 株单
18、抗除 6E2 外, 均具有较好的敏感性和特异性, 为下一步建立牛结核 IFN- 的双抗体夹心间接 ELISA 方法奠定了基础。参考文献1陈祥, 牛中伟, 徐正中, 等.牛 -干扰素 ELISA 检测方法的建立与初步应用J.中国动物传染病学报, 2010, 18 (4) :54-59. 2豆玲, 豆思远, 周峰, 等.奶牛结核病 IFN- 基因的克隆及其在 E.coli BL21 (DE3) 中的高效表达J.畜牧兽医杂志, 2015, 34 (1) :18-21. 3李超, 林祥梅, 梅琳, 等.牛 -干扰素单克隆抗体的制备及 ELISA 检测方法的建立J.中国畜牧兽医, 2011, 38 (1
19、) :72-75. 4李晓非, 赵勤, 汪亚玲, 余文林.两种结核分枝杆菌相关 -干扰素定量检测试剂盒检测结核分枝杆菌感染结果比较研究J.中国防疫杂志, 2011, 33 (5) :267-270. 5张成全, 陈祥, 牛中伟, 等.重组牛 -干扰素单克隆抗体的研制J.中国动物传染病学报, 2009, 17 (4) :15-19. 6张喜悦, 呼西旦, 杨经纬, 等.-干扰素试验及比较皮试在结核污染牛群的应用研究J.中国人兽共患病学报, 2010, 26 (1) :53-56. 7Schiller I.;OeschB.;Vordermeier H.M.;PalmerM.V.;Harris B.N.;Orloski K.A.;Buddle B.M.;Thacker T.C.;Lyashchenko K.P.;Waters W.R.Bovine tuberculosis:a review of current and emerging diagnostic techniques in view of their relevance for disease control and eradicationJ.Transboundary and Emerging Diseases, 2010, 57 (4) :205-220
