1、植物次生代谢物的细胞培养技术研究进展摘要: 近年来, 植物的次生代谢物的结构、功能与应用越来越受人们的关注。为了既能满足人们对植物次生代谢物的需求, 又能合理开发利用自然植物资源和保护生态环境, 植物细胞培养成为生产植物次生代谢物的关键技术。本文重点阐述了 6 种植物细胞培养技术和植物细胞培养生产植物次生代谢物过程中的重要影响因素及其调控, 同时对前述两个方面的深入研究提出了合理化建议。关键词: 植物次生代谢物; 细胞培养技术; 植物次生代谢产物利用可追溯到远古时代, 迄今为止这些天然产物仍在人类的生活中占有重要的位置。但从天然或栽培植物中提取植物次生代谢产物受到以下因素制约: 野生资源的盲目
2、采集, 易造成许多野生植物趋于濒危和生态环境的破坏; 生态环境的差异, 产生的引种和驯化很困难; 可耕地面积日益减少; 栽培过程的自然环境影响, 使产量和质量难以控制。而化学合成方法由于工艺复杂, 费用高, 易造成新的环境污染, 其发展也不受欢迎。自从 Routine 和 Nickel(1956)首次提出用植物细胞培养技术生产有用次级代谢产物以来, 据不完全统计应用于植物细胞培养技术生产次生代谢产物的植物已达百种以上, 近半数的次生代谢产物含量超过原植株。目前植物次生代谢产物的生产在药物如紫杉醇、长春碱等; 油料如豆寇油、春黄菊油等; 食品添加剂如生姜、香子兰等; 调味剂如胡椒、留兰香等; 饮
3、料如咖啡、可可等; 树胶如阿拉伯胶等。由于植物细胞培养生产有用代谢产物可(1)在完全人工控制的条件下一年四季不断进行生产, 不受地区和季节限制, 节约土地, 较便于工业化生产; (2) 通过改变培养条件和选择优良系的方法得到超越原植物产量的代谢物, 例如通过新疆紫草的细胞培养获得了比原植株含量高 6 倍的紫草素; (3)在无菌条件下完成的,能排除病菌及虫害对药用植物的侵扰; (4) 对有效成分的合成路线进行遗传操作, 以提高所需的次生代谢产物含量, 也可以进行特定的生物转化反应, 大规模生产我们所需的有效次生代谢产物; (5) 作为解决资源问题的较为有效的途径而成为当代生物技术的重要发展领域,
4、 吸引了众多国家实验室和研究人员, 也取得了可喜的进展, 但真正实现植物次生物大规模生产仍有许多问题有待解决, 本文就植物细胞培养技术中的若干重要问题进行探讨, 以期推动我国植物细胞培养技术的发展和满足人们对植物次生代谢物的日益增长的需求。1 植物细胞培养技术1.1 固定化培养技术 自 1979 年 Brodelius 等人利用固定化培养技术用于生产植物次生代谢物以来, 已有 10 多种植物细胞应用成功。由于固定化培养与悬浮培养相比, 具有: (1)可极大限度地减少剪切力的损伤作用, 便于连续培养和延长植物细胞寿命以及提高培养细胞的利用率; (2)固定化培养的植物细胞生长相对缓慢 , 有利于植
5、物次生代谢物的积累; (3)固定化培养的植物细胞的培养密度高 , 可提高产植物次生代谢物的产量; (4)固定化培养生产的植物次生代谢物直接分泌到培养液中, 可简化分离步骤提高工作效率等方面的优点而应用于植物次生代谢物的生产。此项技术的改进与完善主要有(1)包埋物的多样化: 已由原来单一的海藻酸拓展为海藻酸、琼脂糖、琼脂、角叉菜聚糖, 且取得良好的效果, 如固定化的长春花细胞生产阿玛碱的产量分别达到游离细胞的 176%、114%、95%和 84%。(2) 固定方法上已采用吸附固定、共价结合固定、网格及泡沫固定、膜固定( 包括中空纤维) 植物细胞的方法。由于植物次生代谢物的释放并非都以分泌的方式而
6、使该项技术的应用受到一定限制, 同时固定化的植物细胞氧、养分的供应与传递以及细胞的遗传稳定性等问题有待于进一步研究解决。1.2 两相培养技术 在培养体系中加入水溶性或脂溶性有机物或者具有吸附作用的多聚物使培养体系分为上下两相, 细胞或组织在水相中生长和合成次生代谢物质, 次生代谢物质分泌出后再转移到有机相中, 然后再从有机相分离植物次生代谢物的技术, 称为两相培养技术。迄今为止, 已有 18 种植物细胞应用此项技术获得成功。例如在紫草悬浮系培养中在合适时间添加十六烷提取紫草素, 可使产量提高七倍多; 长春花细胞培养中加入 XAD- 7 大孔吸附树脂, 可使吲哚生物碱含量明显提高; 孔雀草发根培
7、养中添加十六烷, 可使噻吩的分泌量由原来的 l%提高至 30%- 70%1。虽然两相培养术可利用有机相及时分离植物细胞或组织产生的次生代谢物, 减少了次生代谢产物的反馈抑制, 同时也提高了次生代谢产物含量, 而且有机相可以循环使用, 基本实现了植物组织的连续培养, 但建立和利用两相培养技术的关键是: (1) 添加的有机相或多聚物对植物组织、细胞无害, 不影响其生长和次生代谢产物合成; (2)次生代谢产物能被有机相溶解或为多聚物吸附; (3) 有机物或多聚物不吸收培养基中有效成分;(4) 两相易分离等方面的条件和问题。因此, 在利用两相培养技术进行规模化生产之前, 应对前述若干问题进行详细研究。
8、1.3 反义技术 根据碱基互补原理, 人工合成或生物体合成特定互补 DNA 或 RNA 片段, 抑制或封闭某些基因表达的技术, 通过此技术, 可以将反义 DNA 或 RNA 片段导入植物细胞, 使催化某一分支代谢的关键酶活性受抑制或加强, 从而提高目的物的含量, 同时抑制其他化合物合成。通过反义技术调节亚麻属的一种植物(Lomims favum)发根中内植醇脱氢酶的活性, 可以抑制分支代谢中木质素分子的合成而使抗癌物 5-甲氧基鬼臼毒素的含量提高 2。反义技术是近年发展起来的, 许多问题有待于解决, 问题的关键在于对次生代谢途径及关键酶的了解和反义片段如何有效地起作用两方面。1.4 冠瘿培养技
9、术 利用根癌农杆菌 Ti 质粒的 T-DNA 片段( 含有诱导冠瘿组织发生的 tms 基因和 tmr 基因) , 通过根癌农杆菌感染植物可以将 tmr 基因整合进入植物细胞的基因组, 诱导植物细胞冠瘿组织的发生。本项技术的突出特点: 冠瘿组织离体培养时, 具有激素自主性、增殖速率较常规细胞培养快; 次生代谢物合成稳定性与能力较强。利用此项技术诱导的丹参冠瘿组织, 培养生产丹参酮, 已筛选出高产株系,丹参酮的含量已超过生药的含量 3。表明冠瘿培养技术用来生产有用次生代谢产物有着良好的开发前景。1.5 毛状根培养技术 毛状根是双子叶植物受发根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogene
10、s)感染后产生的。感染过程中, 发根土壤杆菌的 Ri 质粒 T-DNA 转移并整合到植物基因组中诱导出毛状根, 从而建立培养系统 4。在不添加外源激素的条件下 , 其不仅生长迅速, 分支多, 而且毛状根具有器官化的特征, 遗传性、生理生化特征稳定, 与悬浮细胞培养相比, 具有更强的次生代谢物合成能力。此外, 毛状根能产生某些植物的愈伤组织不能合成的有效成分; 毛状根具有生物转化功能, 从而可以产生许多新的化合物 ; 毛状根具有很强的繁殖能力, 可以制成人工种子长期保存。有些植物的毛状根还具有向培养基中释放代谢物的特性。利用此技术诱导人参愈伤组织发根, 在无外源激素的条件下, 其生长速度为用激素
11、诱导根的 2 倍, 人参皂甙的含量达干重的 0.95%, 高于再生根(0.91%)和天然栽培根(0.4%) 5。据报道, 诱导植物产生毛状根的种类已达几十种以上, 且次生代谢产物生产水平达到相当于或高于原植株的水平。由于毛状根培养技术是将外源基因导入植物细胞中, 从基因水平上对某些酶和特定次生代谢过程进行调控, 可使植物细胞培养和次生物质积累进入一个新的水平。因此被公认为是生产植物次生代谢物的一条新途径。1.6 添加诱导子或引导物技术 诱导子是一种能引起植物过敏反应的物质, 当它在与植物的相互作用时, 能快速、高度专一和选择性地诱导植物特定基因的表达, 进而活化特定次生代谢途径, 积累特定地目
12、的次生代谢物, 从而提高植物次生代谢产物的产量 6。目前用于提高植物次生代谢产物的诱导子还包括真菌诱导子、寡糖素、茉莉酸类、金属离子和紫外光等。张长平等 7、李家儒等 8在红豆杉(Taxus chinensis)细胞悬浮培养体系中加入真菌诱导子, 紫杉醇的合成被加强, 产量得到了显著提高 ; 甘烦远等 9在研究红花细胞悬浮培养过程中, 发现同时加入寡糖可提高红花细胞生长速率及 - 生育酚产率; 宾金华等 10利用茉莉酸甲酯处理烟草幼苗可以明显提高幼苗木质素和 HRGP 含量。以红豆杉、南方红豆杉 (Taxus chinensis var meirei)悬浮细胞为材料,加入茉莉酸甲酯,二氢丙烷基
13、茉莉酮酸酯 (2,3- dihydroxypropyl jasmonate,DHPJA), 紫杉醇含量提高了 5- 10 倍 11-12; 金属离子作为诱导子主要有 Cu2+、Ca 2+、Mg 2+等, 李家儒等 13发现用 Cu2+处理红豆杉培养细胞能显著促进紫杉醇含量的提高; 紫外光通常也能刺激许多培养物形成某些次生代谢物, 如胡萝卜素、类黄酮、多酚和质体醌形成等。在应用生产中, 有效诱导子的筛选应注意次生代谢产物合成的途径及关键酶的结构和特性; 诱导子与次生代谢物之间结构与功能的关系两个问题。另外, 在诱导子的纯化和结构分析方面也有待进一步研究。1.7 植物细胞悬浮培养生物反应器技术 生
14、物反应器技术具有很多优点: 工作体积大、单位体积生产能力高、物理和化学条件控制方便等。目前, 国内外用于植物细胞培养的反应器主要有搅拌式、鼓泡式、气升式和振动混合式。对于植物悬浮细胞培养的生物反应器选择要符合以下的要求: 合适的氧传递; 良好的流动特性; 低的剪切力。气升式反应器结构简单、剪切力小、传质效果好等优点, 然而通入气体会导致泡沫产生, 严重影响植物细胞的生长, 而且泡沫会夹带一些有用的挥发性物质, 如 CO2 等, 可加入消泡剂和对反应器内构件进行改造来克服, 可用于植物悬浮细胞培养。用气升式反应器培养植物细胞, 在细胞浓度 20%以下时可获得较好的效果。日本专卖公司用 21 升的
15、搅拌反应器进行烟草细胞的连续培养,生长速率达 5.82kg/m3/d; 日本三井石油株式会社 750 升植物细胞反应器生产紫草宁, 可满足日本需求的 43%。欧阳平凯等人采用内环流气升式发酵罐培养西洋参和紫草细胞, 西洋参培养 25d 后, 细胞浓度为 14g/L (干重), 总皂甙含量为 4.45%; 紫草培养 10d 后, 细胞中紫草素含量为 10%- 14%14。植物悬浮细胞培养的生物反应器应用可大大降低劳动力需求, 而且反应器中通过物化条件调控达到最佳的生长和代谢, 不受时间和地点的限制, 随时随地进行规模化生产, 这对于植物组织与细胞培养工业化开辟了一个广阔的前景。2 影响植物细胞次
16、生代谢物产生的因素及其调控2.1 培养中植物细胞特性对次生代谢的影响 在正常栽培的植物中, 花、果实、成熟叶、成熟根都是次生代谢物积累的重要场所, 构成这些结构的细胞不会迅速分裂, 它们高度分化,产物通过循环周期而积累。遗传性状和生理状态等是影响细胞培养发生次生代谢的内在因素。20 世纪 90 年代以来, 科学工作者对许多植物种属进行了细胞分裂、生长与分化的研究, 发现由于基因型的不同, 形态建成能力差异很大。这种差异不仅表现在物种与物种之间, 在同一个种的不同品种之间, 纯种和杂种之间也明显。植物细胞大量培养的研究表明,次生代谢物的积累与培养细胞的分化程度之间存在正相关,愈伤组织的培养具有初
17、步分化或部分分化的结构, 可以积累较多的产物, 但是, 它在形成连续生产方面却极为不利。而在生长迅速、高度分散的细胞悬浮培养系统中, 细胞所处的环境既无极性也无梯度, 虽然可以获得迅速增长的生物量,但只有在细胞生长的相对静止期才能积累较多产物, 如甜菜产生的新疆圆柏毒素 (podophyllotoxin), 在培养的滞后期物质发生积累 15。这说明,慢速生长、分化或部分分化的组织或组织团块,才能积累较多的次生产物 16。在苦茄 (Solanum dulcamara)细胞悬浮培养中, 直径为 5mm 或更大的青色细胞团, 其类固甾碱含量为小细胞团的 4 倍 17; 而三尖杉(Cepalotaxu
18、s)目的次生代谢物只在固体培养的愈伤组织中存在, 一旦转入液体进行单细胞悬浮培养, 目的次生代谢产物就消失或含量极低。因此,植物细胞的培养特点是生长缓慢, 合成次生代谢产物的能力低且不稳定。有必要深入研究以愈伤组织颗粒为代表的细胞成团生长、细胞分化规律, 以便进一步提高次生代谢物的产量 18。2.2 高产细胞系的筛选 要实现植物细胞次生代谢的大规模工业化生产, 首要条件是筛选生长快、次生代谢物合成能力强的细胞系。可以通过细胞诱变和放射免疫测定法结合单细胞克隆技术, 筛选次生代谢物合成能力稳定的高产细胞系加以解决 19。筛选高产细胞系的方法很多, 较为常用的有: (1)目测法: 对含色素的株系筛
19、选具通用性。中科院植物所的叶和春等人在对新疆紫草高产细胞系的筛选中就采用了此方法,获得了遗传稳定性很高的六个细胞系。吴蕴祺等对 4 种红豆杉的愈伤组织培养物进行多次比较、选择, 最终选择出“sinenxans”含量高、生长良好的细胞系 20; 利用小细胞团法筛选花色苷含量高的玫瑰茄细胞系, 花色苷含量最高者为 2.33%, 产量为 13.44mg, 分别比对照提高了 14.5 和 16 倍 21。(2) 流动细胞测定法: 局限于被测定细胞中次生代谢产物在激光处理后能发出荧光的一类化合物。Adanls 设计了一套流动细胞测定仪 , 成功地筛选了万寿菊噻吩高含量细胞系。(3)酶联免疫法: 测定方便
20、、快速、灵敏等优点, 在大规模筛选中前景广阔。Robin 应用此技术进行美洲苦木细胞中苦木素的含量测定及高产细胞系的筛选。(4)小块琼脂法: 限于测定抑菌作用的次生化合物高产细胞系的筛选, 且需要选择一种特异敏感菌株。Suzuky 利用此法选择了欧亚唐松草高小檗碱细胞系。(5)放射免疫法: 由于实验研究的仪器贵、合成放射性标记抗原困难, 安全性差等原因, 目前只适合在实验室使用。总体来说, 使用较多的是直接筛选法和诱变育种法 22。在高产细胞系的筛选上尚无一种普遍的、行之有效的方法, 应根据培养的植物细胞种类进行研究。2.3 植物细胞培养环境条件的影响 植物离体培养中, 影响植物脱分化和再分化
21、的因子, 包括外因和内因两方面。外因即指植物细胞的营养条件和环境条件, 内因即指植物的遗传性和生理状态 23。植物细胞次生代谢物产量的培养环境条件的影响因素及其调控是指培养条件的优化, 包括培养基组分和培养条件(温度、光照、通气等)的优化。2.3.1 培养基组分 培养基中的各组分对植物组织生长和次生代谢物生产具有重要的作用。(1)碳源 : 蔗糖常用作为碳源, 一般认为它被植物组织细胞壁内的蔗糖酶分解为葡萄糖和果糖后再被细胞吸收利用,而且对于维持培养基的渗透压也具有重要作用。对于通常使用的单糖则需要一定的浓度, 增加其浓度会减慢生长并提高产率, 但浓度过高, 则会导致生物合成能力的丧失。(2)氮
22、源 : 氮源的类型对次生代谢物的产率有很大影响,如在雷公藤培养中, 增加 K、N、P 浓度有利于细胞内雷公藤内酯的积累。在天仙子毛状根培养中, 增加 150mmolKNP,不仅细胞生长快, 而且生物碱产量明显增加。然而任何 NH4+的增加对紫草宁衍生物的合成产生明显的抑制作用 3。(3)有机物质: 培养基中添加特定的有机物质如二甲基亚砜(DMSO)、吐温- 20、双氧苯咪唑和氯化氯胆碱等, 可调节次生代谢途径与方向或促进次生代谢物的释放。二甲亚砜是一种高度甲基化的有机溶剂, 它可改变细胞壁 /膜的渗透性。实验表明, 经体积分数为 0.01 的二甲亚砜长期处理的三七细胞生长良好, 且皂甙分泌量增
23、加, 培养基中可达 130mg/L , 约占皂甙总量的 10%24。在青嵩素合成过程中加入固醇生物合成抑制剂双氧苯咪唑和氯化氯胆碱处理, 可使代谢向合成青嵩素的方向移动, 青嵩素合成量明显提高 25。但由于次生代谢及其产物的不同, 添加的有机物质需经深入研究予以确定。(4)外源植物激素或植物生长调节剂: 外源植物激素或植物生长调节剂的添加对于植物组织生长、分化及次级代谢产物的调控具有重要作用。通过添加不同种类和浓度外源激素来调控生长、分化和代谢取得了一定规律性认识。一般情况是, 低浓度的生长素有利于次生代谢和次生代谢产物的积累, 而 2,4- D 则会抑制次生代谢物的产生, 如长春碱、天仙子、
24、颠茄、罂粟等细胞培养物在有 2,4- D 存在时不产生生物碱, 并且完全抑制蒽醌的生成; NAA 也会抑制紫草愈伤组织中紫草宁的产生, 这主要是因为较高浓度的生长素会抑制次生代谢途径中一些重要酶的活性, 从而使产物的合成受阻 26。赤霉素很少用于培养基, 但其对于某些萜类的产生是必要的, 如青蒿毛状根培养基添加适量的赤霉素可明显地促进毛状根生长和青蒿素的产生; 细胞激动素的作用不很明确, 但秋水仙碱在未分化的培养物中可导致多倍体生成, 细胞体积增大, 使香叶天竺葵细胞中单萜的产量明显提高; 乙烯在欧亚唐松草的培养中通过调节 4-氢小檗碱的加氢酶的活性来促进小檗碱的积累而且作用明显 3。张俊莲等
25、在研究不同培养条件下栀子愈伤组织生长和栀子黄色素的产生时发现, B5、MG- 5 基本培养基有利于愈伤组织生长, M-9 基本培养基有利于黄色素的生物合成, 在培养基中添加 01.5 mg/L IAA 和 00.25 mg/L KT 对愈伤组织生长和黄色素的产生都有促进作用, 而 IBA、BA、ZT 的加入对两者都产生抑制作用 27。水杨酸(SA) 、乙烯和茉莉酸类化合物(Jas)能够在高等植物的抗病反应中诱导植物抗病素 (主要是萜类和异黄酮类化合物) 的产生, 在细胞工程中常作为诱导子可促进植物细胞次生代谢物的产生。适当浓度的 SA 和 MJ (茉莉酸甲酯) 能促进野葛(Pueraria l
26、obata) 幼叶的悬浮细胞葛根素的积累, 如 0.1mg/LSA 和 1.0mg/L MJ 处理 8d, 可使培养物的葛根素产量分别提高 12.61%和 22.15%。尽管如此, 各种浓度的 SA 和 MJ 对野葛细胞生物量作用不大, 且易引起细胞褐化 28。一定浓度的生长素可以明显促进愈伤组织的生长, 但通常会抑制次生代谢物的生成。(5)无机营养: Rojas 等在薯蓣(D.galeottiana)的细胞悬浮培养研究中发现降低磷酸盐可促进了其次生代谢物薯蓣皂甙元的产生 29。但目前植物细胞培养大多数采用比较成熟的培养基配方, 很少有人进行系统研究。由于特殊的无机离子对植物细胞的次生代谢是必
27、需的, 可针对次生代谢途径中的关键酶进行深入研究。(6) pH 值:培养基的酸碱度对次生代谢物的分泌很重要。研究表明, 一些次生代谢物是与 H+通过对运方式跨膜传递的 30。由于细胞膜两侧的 pH 差控制对运的方向, 因此, 当培养基中 pH 值降低时, 即培养基中 H+浓度升高时, 就会促进次生代谢物向细胞外运输, 而 H+向细胞内运输。如降低培养基的 pH 值 , 可有效提高大麦细胞释放七叶甙和高山红景天细胞红景天甙的释放 31。但长春花细胞中阿吗碱可能是以结合态被牢固束缚于液泡中, 不易透过液泡膜, 单纯的扩散调控不能促进其释放。由此说明 pH 值改变引起代谢物外并不适用所有的物质, 对
28、于具体的次生代谢及其产物需进行具体研究。2.3.2 培养条件(1) 光照 : 植物生长、发育离不开光, 光可参与众多生理、生化过程。光对于体内的许多酶具有诱导和抑制作用。光照对诱导分化通常是必要的, 可激活某些酶的活性以及光诱导的叶绿体形成或叶绿素代谢产物的存在。毛地黄中卞烯内酯的合成对光具有强烈的依赖性, 青蒿毛状根中倍半萜内酯的合成也受光的调控。而在硬紫草的培养中, 白光和蓝光强烈抑制紫草宁的合成, 红光和绿光则不产生影响。若在培养特定时间照射远红外光和紫外光, 对紫草宁的积累具有明显的促进作用 3。由此可见, 光对于不同体系次生代谢物的积累具有重要调控作用, 光的强度、波长不同, 对于次
29、生代谢的影响也不尽相同, 其作用机理有待于进一步研究。(2) 温度: 温度影响植物细胞新陈代谢中的酶活性。关于温度的影响未有系统的报道, 在正常的实验研究与生产中,植物细胞培养的温度设置为 20-25, 超过 30, 则对生长具有明显的抑制作用。不同次生代谢物的积累对温度的依赖性不同, 实验研究表明较低的温度有利于生物碱的合成, 而高温则会导致次生代谢生物合成基本停止。对于具体的植物种类应进行有针对性的研究。3 展望近年来, 植物细胞培养技术取得了可喜发展, 但真正应用于商业化生产尚不多。随着分子生物学技术的发展, 基因方法越来越多引入植物细胞培养工程, 次生代谢物代谢途径和关键酶以及关键酶基
30、因编码及其表达调节; 通过增加新基因调节次生代谢; 通过特殊基因调节次生代谢, 运用反义 RNA 技术调节次生代谢等基因水平的调控, 将为植物细胞培养解决众多理论与实践问题。植物细胞培养技术与生化工程技术结合, 针对不同的培养要求, 研制高效的生物反应器系统, 必将为今后植物资源的开发利用和发酵工业的发展注入崭新的活力, 以满足人们对植物次生代谢物的需求。参考文献:1李志勇 , 郭勇. 植物细胞生产药物的培养技术J. 工业微生物,1999,29(4):51- 54.2陈士云 , 侯嵩生. 生产植物次生代谢物几项新技术研究进展J. 生物工程进展,1993,4(2): 43- 45.3刘春朝 ,
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