1、实验 1 显微镜油镜的使用、细菌单染色法及细菌芽孢观察(09 下) A.显微镜油镜的使用 一、实验目的和内容目的：复习显微镜低倍镜和高倍镜的使用技术，了解油浸系物镜的基本原理，掌握油浸系物镜的使用方法。内容：1学习油浸系物镜的使用方法。2用油镜观察枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌染色装片。二、实验材料和用具枯草芽孢杆菌(Bacillus subitilis)、金黄色葡萄球菌( Staphylococcus aureus)的染色装片。香柏油、二甲苯、显微镜、擦镜纸。三、操作步骤(一)观察前的准备1将显微镜置于平稳的实验台上，镜座距实验台边沿约为 4cm。坐正，练习用左眼观察。2调节光源：将低倍物镜转
2、到工作位置，把光圈完全打开，聚光器升至与载物台相距约1mm 左右。转动反光镜采集光源，光线较强的天然光源宜用平面镜，光线较弱的天然光源或人工光源宜用凹面镜，对光至视野内均匀明亮为止。观察染色装片时，光线宜强；观察末染色装片时，光线不宜太强。(二)低倍镜观察染色装片首先上升镜简，将枯草芽孢杆菌染色装片置于载物台上，用标本夹夹住，将观察位置移至物镜正下方，物镜降至距装片 0.5cm 处，适当缩小光圈然后两眼从目镜观察，转动粗调节器使物镜逐渐上升(或使镜台下降 )至发现物像时，改用细调节器调节到物像清楚为止。移动装片，把合适的观察部位移至视野中心。(三)高倍镜观察眼睛离开目镜从侧面观察，旋转转换器，
3、将高倍镜转至正下方，注意避免镜头与玻片相懂。再由目镜观察，仔细调节光圈，使光线的明亮度适宜。用细调节器校正焦距使物镜清晰为止。将最适宜观察部位移至视野中心，绘图。不要移动装片位置，准备用油镜观察。(四)油镜观察1提起镜筒约 2cm，将油镜转至正下方。在玻片标本的镜检部位(镜头的正下方)滴一滴香柏油。2从侧面注视，小心慢慢降下镜筒，使油镜浸在油中至油圈不扩大为止，镜头几乎与装片接触，但不可压及装片，以免压碎玻片，损坏镜头。3将光线调亮，左眼从目镜观察，用粗调节器将镜筒徐徐上升(切忌反方向旋转)，当视野中有物像出现时，再用细调节器校正焦距。如因镜头下降未到位或镜头上升太快末找到物像，必须再从侧面观
4、察，将油镜降下，重复操作直至物像看清为止。仔细观察并绘图。4再次观察 提起镜筒，换上金黄色葡萄球菌染色装片，依次用低倍镜、高倍镜和油镜观察，绘图。重复观察时可比第一次少加香柏油。(五)镜检完毕后的工作1移开物镜镜头。2取出装片。3清洁油镜，油镜使用完毕后，须用擦镜纸擦去镜头上的香柏油，再用擦镜纸沾少许二甲苯擦掉残留的香柏油，最后再用干净的擦镜纸擦干残留的二甲苯。4擦净显微镜，将各部分还原。将接物镜呈“ 八”字形降下，不可使其正对聚光器，同时降下聚光器，转动反光镜使其镜面垂直于镜座。最后套上镜罩，对号放入镜箱中，置阴凉干燥处存放。四、注意事项1使用油镜必须按先用低倍镜和高倍镜观察，再用油镜观察2
5、下降镜头时，一定要从侧面注视，切忌用眼睛对着目镜，边观察边下降镜头的错误操作，以免压碎玻片而损坏镜头。3使用二甲苯擦镜头时，注意二甲苯不能过多，以防溶解固定透镜的树脂。4注意保持显微镜的洁净，对金属部分要用软布擦拭，擦镜头必须用擦镜纸，切勿用手或用普通布、纸等，以免损坏镜头。五、实验报告分别绘出在高倍镜和油镜下观察到的枯草芽孢杆菌及金黄色葡萄球菌的形态，注明物镜放大倍数和总放大率。六、问题和思考1用油镜便于观察细菌的依据是什么？2使用油镜应特别注意哪些问题？3当物镜从低倍镜转到高倍镜和油镜时，对照明度有何要求？应如何调节？油镜的基本原理（一）油镜头的辨认油镜头上常刻有 OI(oil immer
6、sion)或 HI（homogeneneous immersion）字样，有的还刻有一圈红线或黑线标记，在低倍物镜、高倍物镜和油镜 3 物镜中，油镜的放大倍数和数值孔径（numerical aperture）最大，而工作距离最短（图 11）图 11 显微镜物镜参数示意图（二）显微镜的分辨率显微镜性能的优劣不单是看它的总放大倍数，更重要的是看它分辩率的大小。分辨率是指显微镜能分辨出物体两点间最小距离（D ）的能力。D 值愈小表明分辨率愈高。 D 值与光线的波长（）成正比，与物镜的数值孔径（NA）成反比。从上式可看出，缩短光波长和增大数值孔径都可提高分辨率。数值孔径指光线投射到物镜上的最大角度（称
7、镜口角，）的一半正弦与介质折射率（n）的乘积；影响数值孔径大小的因数，一是镜口角，二是介质的折射率。当镜与装片之间的介质为空气时，由于空气（n= 1.52）的折射率不同，光线会发生折射，不仅使进入物镜的光线减少，降低了视野的照明度，而且会减少镜口角（图 52A）。当以香柏油（n=1.515）为介质时，由于它的折射率与玻璃相近，光线经过载玻片后可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射（图 52B），不仅增加了视野的照明度，更重要的是通过增加数值孔径达到提高分辨率的目的。可见光的波长平均为 0.55m。当使用数值孔径为 0.65 的高倍镜时，它能辨别两点之间的距离为 0.42m；而使用数值孔径为 1.
8、25 的油镜时，能辨别两点之间的距离则为 0.22m。图 12 介质为空气（A）与介质为香柏油（B ）时光线通过的比较B.细菌单染色法一、实验目的和内容目的：巩固无菌操作技术，掌握细菌的涂片和单染色技术内容：1.学习细菌单染色操作技术。二、实验材料和用具大肠杆菌(E.coli )、金黄色葡萄球菌( Staphylocosccus aureus)的斜面菌种。结晶紫染液、香柏油、二甲苯、无菌水；显微镜、擦镜纸、接种环、酒精灯、载玻片、吸水纸。三、操作步骤(一)单染色法1涂片 在洁净无脂的载玻片中央滴一小滴无菌水，用无菌操作方法从菌种斜面挑取少量菌体与水滴充分混匀，涂成薄膜，涂布面积约 11.5cm
9、 2。2干燥 将涂片于室温中自然干燥。3固定 手扶载片一端，使涂菌的一面向上，将载片通过微火 23 次。在火上固定时，用手摸涂片反面，以不烫手为宜。不能将载片在火上烤，否则细菌形态毁坏。4染色 将涂片置于水平位置，滴加染色液覆盖于涂菌处，染色约 2min5水洗 倾去染色液，斜置载片，用自来水的细水流由载片上端流下，不得直接冲在涂菌处，直洗至从载片上流下的水中无染色液的颜色为止。6干燥 自然晾干或用吸水纸轻轻地吸干，注意不要擦掉菌体。7镜检 待标本完全干燥后，先用低倍镜和高倍镜观察，将典型部位移至视野中央，再用油镜观察。 单染色的方法C.细菌芽孢观察一、实验目的和内容目的：掌握细菌的芽孢观察方法
10、。内容：细菌的芽泡染色。二、实验材料和用具枯草芽孢杆菌、褐球固氮菌的斜面菌种。二甲苯、香柏油、蒸馏水、5%孔雀绿水溶液、0.5%沙黄水溶液；显微镜、接种环、酒精灯、载玻片、盖玻片、小试管(l6.5cm)、烧杯(300mL)、滴管、试管夹、擦镜纸、吸水纸。三、操作步骤1方法 1(1)取 37培养 1824h 的枯草芽孢杆菌作涂片，并干燥，固定(参见“细胞单染色法”) 。(2)于涂片上滴人 35 滴 5%孔雀绿水溶液。(3)用试管夹夹住载玻片在火焰上用微火加热，自载玻片上出现蒸汽时，开始计算时间约45min。加热过程中切勿使染料蒸干，必要时可添加少许染料。(4)倾去染液，待玻片冷却后，用自来水冲洗
11、至孔雀绿不再褪色为止。(5)用 0.5%沙黄水溶液(或 0.05%碱性复红)复染 lmin，水洗。(6)制片干燥后用油镜观察。芽孢呈绿色，菌体红色。2方法 2(1)加 12 滴自来水于小试管中，用接种环从斜面上挑取 23 环培养 1824h 的枯草芽孢杆菌菌苔于试管中，并充分混匀打散，制成浓稠的菌液。(2)加 5%孔雀绿水溶液 23 滴于小试管中，用接种环搅拌使染料与菌液充分混合。(3)将此试管浸于沸水浴(烧杯)中，加热 1520min。(4)用接种环从试管底部挑数环菌于洁净的载玻片上，并涂成薄膜，将涂片通过微火 3 次固定。(5)水洗，至流出的水中无孔雀绿颜色为止。(6)加沙黄水溶液，染 23min 后，倾去染液，不用水洗，直接用吸水纸吸干。(7)干燥后用油镜观察。芽孢绿色，菌体红色。四、注意事项供芽孢染色用的菌种应控制菌龄，使大部分芽孢仍保留在菌体上为宜。五、实验报告(一)绘图1枯草芽孢杆菌菌体及芽孢形态，芽孢的着生位置。七、问题和思考1为什么芽孢染色要加热? 为什么芽孢及营养体能染成不同的颜色?2试设计实验如何鉴定某一产芽孢菌株的芽孢形态、着生位置及所属分类地位。
