1、1,基因结构与表达分析的基本策略,Strategy for Structure and Expression Analyses of Genes,分子生物学 Molecular Biology,吴 坤 陆,分子生物学研究中心,2,第一节 DNA序列分析,一、双脱氧链末端终止法,二、DNA自动化序列分析,(Frederick Sanger, 1977),三、化学降解法,3,Frederick Sanger 1918,Walter Gilbert 1932,The Nobel Prize in Chemistry 1980,Paul Berg 1926,4,一、双脱氧链末端终止法 （dideoxy
2、 chain termination）,掺入N个核苷酸,DNA合成反应,5,ATP、dATP和ddATP的结构,6,末端终止部位,DNA单链模板,引物,延伸的新合成链,掺入ddNTP,7,8,DNA测序技术基础：,高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE）技术,PAGE能分离长度为300-500个碱基，差别仅1个碱基的单链寡核苷酸DNA片段。,9,ddCTP,ddATP,ddTTP,ddGTP,dCTP,dATP,dTTP,dGTP,A G C T,5 T,4,7,11,G A A T G A 3,A,C,G,C,T,10
3、,2. DNA测序主要步骤,已知序列,未知序列,变性,模板-引物退火,标记反应,延伸-终止反应,测序引物,测序引物延伸,CCTAGGCT GGATCCGA,GGATCCGA,GGATCCGA,A反应管,GGATCCGA,G反应管,C反应管,T反应管,ddATP& dNTPS,ddGTP& dNTPS,ddCTP& dNTPS,ddTTP& dNTPS,5 3,5 3,5 3,3,5,单链模板,5,5,3 5,待测双链 DNA,变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,放射自显影,阅读分析结果,11,12, 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳, 单链DNA模板的制备, DNA模板与测序引物退火, 掺入法标记反应, 延伸-终止
4、反应, 放射自显影, 阅读测序结果,测序步骤,13,ddCTP,ddATP,ddTTP,ddGTP,dCTP,dATP,dTTP,dGTP,二、DNA自动化序列分析,14,用荧光化合物分别标记4种ddNTP终止反应产物，替代放射性同位素标记是实现DNA测序自动化的基础。,15,DNA自动化测序步骤,4种带有不同荧光染料标记的终止物ddNTPs,Sanger测序反应,反应产物毛细管电泳分离,荧光信号采集、计算机分析与DNA自动排序。,激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子， 发射出四种不同波长的荧光,16,Dye labeled dideoxyterminators on ABI 3730 ca
5、pillaries,17,18,化学降解G反应模式图,Met,Met,Met,Met,19,20,21,22,第二节 核酸分子杂交,（Nucleic Acid Hybridization ）,三、Northern印迹杂交,一、核酸分子杂交原理,二、Southern印迹杂交,23,核酸分子杂交是指两条互补单链核酸在一定条件下按碱基互补配对原则形成双链的过程。,一、核酸分子杂交原理,24,(一) 印迹技术利用各种物理方法使电泳中的生物大分子转移到NC等各种膜上，使之成为固相化分子。,（二）探针标记技术用放射性核素、生物素或荧光素染料标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸链称为探针。,25,复性,R
6、NA,DNA,标记的单链核酸探针与待检测的靶单链DNA或RNA局部互补结合形成杂交双链。,26,二、Southern印迹杂交 (Southern blotting),将电泳分离的待测DNA片段结合到一定的固相支持物上，然后与存在于液相中标记的核酸探针进行杂交的过程。,用于DNA定性、定量分析。,27,1. 制备基因组DNA 2. 用限制性内切核酸酶消化基因组DNA 3. 琼脂糖凝胶电泳分离DNA酶切片段 4. 凝胶预处理 5. Southern 印迹转移 6. 标记核酸探针、探针与DNA片段杂交 7. 杂交结果显示,Southern印迹杂交基本过程,28,29,30,克隆基因的酶切图谱分析 基
7、因组基因的定性和定量分析 基因突变分析 限制性片段长度多态性分析,可以对DNA进行分析。,Southern印迹杂交应用,31,三、Northern印迹杂交 (Northern blotting),指将RNA变性及电泳分离后，并转移到固相支持物上，用杂交反应来鉴定其中特定mRNA分子的含量及其大小。用于mRNA定性和定量分析。,32,GAPDH,0d 2d 4d 6d 8d,Northern blotting 检测基因表达,目的基因,33,DNA Chip and Microarray,第四节 基因芯片和微阵列,基因芯片上的阵列是由有规则排列的cDNA或寡核苷酸等样品所组成的 。, cDNA微阵
8、列 寡核苷酸微阵列,34,35,36,C,B,A,Cy5-标记 cDNA,Cy3-标记 cDNA,C,B,A,C,B,A,C,B,A,C,B,A,C,B,A,C,B,A,样品1,样品2,Cy5/Cy3荧光标记,RNA提取,竞争性杂交显示 基因表达量差异,37,实验设计 基因芯片实验 图象分析,基因表达谱芯片研究应用思路,生物学问题提出， 表达基因分析， 样本分类与实验预测,某些基因表达异常或存在差异,生物学确证和解释分析,下一步实验设计,结果标准化,38,39,第五节 Western免疫印迹,原理：核酸分子杂交相似，只是以偶联标记物的抗体分子作为探针，检测转移到固相支持物上的蛋白质分子。,40,Western blotting程序： 蛋白质样品制备 SDS-PAGE分离 蛋白质转膜 标记抗体与膜上蛋白质抗原杂交 检测并分析标记物信号,41,42,Western免疫印迹信号检测原理,待测蛋白,膜,一抗,二抗-HRP,高酸,氧化产物,氧化型HRP+luminol+增强剂,光子,43,Luminol化学发光原理,过氧化物酶,44,另一种信号显示方法是在洗去一抗后，加入碱性磷酸酶标记的二抗，再用BCIPNBT在膜上直接显色。,45,谢谢大家！,分子生物学研究中心,吴 坤 陆 ,
