1、遗传学专业优秀论文 新型牛溶菌酶基因的重组真核质粒构建及活性研究关键词：牛溶菌酶基因 真核质粒 基因重组 基因表达 抗菌活性摘要：溶菌酶(lysozyme，LYZ)是一种专门作用于微生物细胞壁的水解细菌细胞壁中粘多糖 -1，4-糖苷键的胞壁质酶，是一种碱性蛋白质，存在于许多动物、植物和微生物中。研究发现，溶菌酶对革兰氏阳性细菌具有直接的溶解作用，催化革兰氏阳性菌细胞壁不溶性多糖水解，生成可溶性黏肽。在分泌型免疫球蛋白 A 和补体的参与下，溶菌酶还对革兰氏阴性细菌具有间接的溶解作用，是一种天然的抗菌物质。由于其能够增强巨噬细胞和白细胞的吞噬和消化功能、将诱发炎症的酸性物质灭活、增强抗菌素及其它药
2、物的疗效，具有消炎消肿、帮助组织修复、改善组织局部血液循环和分解脓液等药理作用，因此溶菌酶在医疗界中倍受关注。近年来，随着生物学技术和免疫学技术的发展，对溶菌酶的研究取得了令人瞩目的成就。利用 DNA 重组技术发展溶菌酶的抗菌效果，已成为其中重要的研究方向。 牛体内溶菌酶(bovine lysozyme，bLys)有大约10 种，表达的潜在位点有：乳腺、唾液、泪液、胃、气管组织以及中性粒细胞、嗜红细胞、巨噬细胞、白细胞等。由于牛奶与人们的生活息息相关，其质量的好坏关系着人们的健康，因此，对牛奶溶菌酶的研究尤为突出。为构建具有高效抗菌、活性持久的抗菌基因，探索研制新型抗菌制剂，克服耐药性细菌感染
3、日益严重的问题，本实验构建了原核表达载体 pGEX-4T-1-Lys(pGL)。本实验是以成功构建的新型牛溶菌酶基因原核表达载体 pGL 为模板，用 PCR 扩增得到目的片段 Lys 基因，将 VR1020 和目的片段 Lys 分别用 BamHI 和 Bgl双酶切，并将 VR1020 酶切片段先进行去磷酸化，然后将两种酶切产物在 16水浴过夜连接；连接产物转化大肠杆菌 DH5a 感受态细胞，筛选重组子，用碱裂解法小规模提取重组子质粒 DNA，用BamHI，Bgl作双酶切鉴定验证，并作质粒 PCR 鉴定。经双酶切和质粒 PCR 的实验结果初步确定的阳性重组子进行双向基因测序，测序结果证明插入目的
4、片段正确，证实新型牛溶菌酶基因已经克隆到真核表达载体 VR1020(VR1020-Lys，命名为 VRL)上。将重组质粒 VRL 以JetPEIlt;#39;TMgt; Cationic polymer 分子包裹，介导转染真核 HEK293 细胞，转染培养 24h、48h、72h 后分别提取培养细胞 mRNA 进行RT-PCR，与 VR1020 转染细胞比较发现，转染后 24h、48h 和 72h 的 HEK293 细胞的 RNA 中含有与目的 cDNA 片段对应的 mRNA。为了探索一种更经济高效的转染介质，本实验同时还制备了壳聚糖纳米颗粒(chitosan nanoparticles，CN
5、P)，用此壳聚糖纳米颗粒包裹重组质粒 VRL 后转染 HEK293 细胞，转染的 HEK293 细胞中也表达与目的 cDNA 片段对应的 mRNA，说明了壳聚糖纳米颗粒也能作为一种有效的转染介质。用转染后 HEK293 细胞上清分别作抑制标准大肠杆菌、产毒性大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌和肺炎球菌生长实验，实验结果证明新构建的真核表达质粒 VRL 具有良好的抑制革兰氏阳性菌生长的效果，这些为深入开展 VRL 在动物体内的抗感染抑菌实验奠定了可靠的基础。正文内容溶菌酶(lysozyme，LYZ)是一种专门作用于微生物细胞壁的水解细菌细胞壁中粘多糖 -1，4-糖苷键的胞壁质酶，是一种碱性蛋白质
6、，存在于许多动物、植物和微生物中。研究发现，溶菌酶对革兰氏阳性细菌具有直接的溶解作用，催化革兰氏阳性菌细胞壁不溶性多糖水解，生成可溶性黏肽。在分泌型免疫球蛋白 A 和补体的参与下，溶菌酶还对革兰氏阴性细菌具有间接的溶解作用，是一种天然的抗菌物质。由于其能够增强巨噬细胞和白细胞的吞噬和消化功能、将诱发炎症的酸性物质灭活、增强抗菌素及其它药物的疗效，具有消炎消肿、帮助组织修复、改善组织局部血液循环和分解脓液等药理作用，因此溶菌酶在医疗界中倍受关注。近年来，随着生物学技术和免疫学技术的发展，对溶菌酶的研究取得了令人瞩目的成就。利用 DNA 重组技术发展溶菌酶的抗菌效果，已成为其中重要的研究方向。 牛
7、体内溶菌酶(bovine lysozyme，bLys)有大约10 种，表达的潜在位点有：乳腺、唾液、泪液、胃、气管组织以及中性粒细胞、嗜红细胞、巨噬细胞、白细胞等。由于牛奶与人们的生活息息相关，其质量的好坏关系着人们的健康，因此，对牛奶溶菌酶的研究尤为突出。为构建具有高效抗菌、活性持久的抗菌基因，探索研制新型抗菌制剂，克服耐药性细菌感染日益严重的问题，本实验构建了原核表达载体 pGEX-4T-1-Lys(pGL)。本实验是以成功构建的新型牛溶菌酶基因原核表达载体 pGL 为模板，用 PCR 扩增得到目的片段 Lys 基因，将 VR1020 和目的片段 Lys 分别用 BamHI 和 Bgl双酶
8、切，并将 VR1020 酶切片段先进行去磷酸化，然后将两种酶切产物在 16水浴过夜连接；连接产物转化大肠杆菌 DH5a 感受态细胞，筛选重组子，用碱裂解法小规模提取重组子质粒 DNA，用BamHI，Bgl作双酶切鉴定验证，并作质粒 PCR 鉴定。经双酶切和质粒 PCR 的实验结果初步确定的阳性重组子进行双向基因测序，测序结果证明插入目的片段正确，证实新型牛溶菌酶基因已经克隆到真核表达载体 VR1020(VR1020-Lys，命名为 VRL)上。将重组质粒 VRL 以JetPEIlt;#39;TMgt; Cationic polymer 分子包裹，介导转染真核 HEK293 细胞，转染培养 24
9、h、48h、72h 后分别提取培养细胞 mRNA 进行RT-PCR，与 VR1020 转染细胞比较发现，转染后 24h、48h 和 72h 的 HEK293 细胞的 RNA 中含有与目的 cDNA 片段对应的 mRNA。为了探索一种更经济高效的转染介质，本实验同时还制备了壳聚糖纳米颗粒(chitosan nanoparticles，CNP)，用此壳聚糖纳米颗粒包裹重组质粒 VRL 后转染 HEK293 细胞，转染的 HEK293 细胞中也表达与目的 cDNA 片段对应的 mRNA，说明了壳聚糖纳米颗粒也能作为一种有效的转染介质。用转染后 HEK293 细胞上清分别作抑制标准大肠杆菌、产毒性大肠
10、杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌和肺炎球菌生长实验，实验结果证明新构建的真核表达质粒 VRL 具有良好的抑制革兰氏阳性菌生长的效果，这些为深入开展 VRL 在动物体内的抗感染抑菌实验奠定了可靠的基础。溶菌酶(lysozyme，LYZ)是一种专门作用于微生物细胞壁的水解细菌细胞壁中粘多糖 -1，4-糖苷键的胞壁质酶，是一种碱性蛋白质，存在于许多动物、植物和微生物中。研究发现，溶菌酶对革兰氏阳性细菌具有直接的溶解作用，催化革兰氏阳性菌细胞壁不溶性多糖水解，生成可溶性黏肽。在分泌型免疫球蛋白A 和补体的参与下，溶菌酶还对革兰氏阴性细菌具有间接的溶解作用，是一种天然的抗菌物质。由于其能够增强巨噬细胞和白
11、细胞的吞噬和消化功能、将诱发炎症的酸性物质灭活、增强抗菌素及其它药物的疗效，具有消炎消肿、帮助组织修复、改善组织局部血液循环和分解脓液等药理作用，因此溶菌酶在医疗界中倍受关注。近年来，随着生物学技术和免疫学技术的发展，对溶菌酶的研究取得了令人瞩目的成就。利用 DNA 重组技术发展溶菌酶的抗菌效果，已成为其中重要的研究方向。 牛体内溶菌酶(bovine lysozyme，bLys)有大约 10 种，表达的潜在位点有：乳腺、唾液、泪液、胃、气管组织以及中性粒细胞、嗜红细胞、巨噬细胞、白细胞等。由于牛奶与人们的生活息息相关，其质量的好坏关系着人们的健康，因此，对牛奶溶菌酶的研究尤为突出。为构建具有高
12、效抗菌、活性持久的抗菌基因，探索研制新型抗菌制剂，克服耐药性细菌感染日益严重的问题，本实验构建了原核表达载体 pGEX-4T-1-Lys(pGL)。本实验是以成功构建的新型牛溶菌酶基因原核表达载体 pGL 为模板，用 PCR 扩增得到目的片段 Lys 基因，将 VR1020 和目的片段 Lys 分别用 BamHI 和 Bgl双酶切，并将VR1020 酶切片段先进行去磷酸化，然后将两种酶切产物在 16水浴过夜连接；连接产物转化大肠杆菌 DH5a 感受态细胞，筛选重组子，用碱裂解法小规模提取重组子质粒 DNA，用BamHI，Bgl作双酶切鉴定验证，并作质粒 PCR 鉴定。经双酶切和质粒 PCR 的
13、实验结果初步确定的阳性重组子进行双向基因测序，测序结果证明插入目的片段正确，证实新型牛溶菌酶基因已经克隆到真核表达载体 VR1020(VR1020-Lys，命名为 VRL)上。将重组质粒 VRL 以JetPEIlt;#39;TMgt; Cationic polymer 分子包裹，介导转染真核 HEK293 细胞，转染培养 24h、48h、72h 后分别提取培养细胞 mRNA 进行RT-PCR，与 VR1020 转染细胞比较发现，转染后 24h、48h 和 72h 的 HEK293 细胞的 RNA 中含有与目的 cDNA 片段对应的 mRNA。为了探索一种更经济高效的转染介质，本实验同时还制备了
14、壳聚糖纳米颗粒(chitosan nanoparticles，CNP)，用此壳聚糖纳米颗粒包裹重组质粒 VRL 后转染 HEK293 细胞，转染的 HEK293 细胞中也表达与目的 cDNA 片段对应的 mRNA，说明了壳聚糖纳米颗粒也能作为一种有效的转染介质。用转染后 HEK293 细胞上清分别作抑制标准大肠杆菌、产毒性大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌和肺炎球菌生长实验，实验结果证明新构建的真核表达质粒 VRL 具有良好的抑制革兰氏阳性菌生长的效果，这些为深入开展 VRL 在动物体内的抗感染抑菌实验奠定了可靠的基础。溶菌酶(lysozyme，LYZ)是一种专门作用于微生物细胞壁的水解细菌细
15、胞壁中粘多糖 -1，4-糖苷键的胞壁质酶，是一种碱性蛋白质，存在于许多动物、植物和微生物中。研究发现，溶菌酶对革兰氏阳性细菌具有直接的溶解作用，催化革兰氏阳性菌细胞壁不溶性多糖水解，生成可溶性黏肽。在分泌型免疫球蛋白A 和补体的参与下，溶菌酶还对革兰氏阴性细菌具有间接的溶解作用，是一种天然的抗菌物质。由于其能够增强巨噬细胞和白细胞的吞噬和消化功能、将诱发炎症的酸性物质灭活、增强抗菌素及其它药物的疗效，具有消炎消肿、帮助组织修复、改善组织局部血液循环和分解脓液等药理作用，因此溶菌酶在医疗界中倍受关注。近年来，随着生物学技术和免疫学技术的发展，对溶菌酶的研究取得了令人瞩目的成就。利用 DNA 重组
16、技术发展溶菌酶的抗菌效果，已成为其中重要的研究方向。 牛体内溶菌酶(bovine lysozyme，bLys)有大约 10 种，表达的潜在位点有：乳腺、唾液、泪液、胃、气管组织以及中性粒细胞、嗜红细胞、巨噬细胞、白细胞等。由于牛奶与人们的生活息息相关，其质量的好坏关系着人们的健康，因此，对牛奶溶菌酶的研究尤为突出。为构建具有高效抗菌、活性持久的抗菌基因，探索研制新型抗菌制剂，克服耐药性细菌感染日益严重的问题，本实验构建了原核表达载体 pGEX-4T-1-Lys(pGL)。本实验是以成功构建的新型牛溶菌酶基因原核表达载体 pGL 为模板，用 PCR 扩增得到目的片段 Lys 基因，将 VR102
17、0 和目的片段 Lys 分别用 BamHI 和 Bgl双酶切，并将VR1020 酶切片段先进行去磷酸化，然后将两种酶切产物在 16水浴过夜连接；连接产物转化大肠杆菌 DH5a 感受态细胞，筛选重组子，用碱裂解法小规模提取重组子质粒 DNA，用BamHI，Bgl作双酶切鉴定验证，并作质粒 PCR 鉴定。经双酶切和质粒 PCR 的实验结果初步确定的阳性重组子进行双向基因测序，测序结果证明插入目的片段正确，证实新型牛溶菌酶基因已经克隆到真核表达载体 VR1020(VR1020-Lys，命名为 VRL)上。将重组质粒 VRL 以JetPEIlt;#39;TMgt; Cationic polymer 分
18、子包裹，介导转染真核 HEK293 细胞，转染培养 24h、48h、72h 后分别提取培养细胞 mRNA 进行RT-PCR，与 VR1020 转染细胞比较发现，转染后 24h、48h 和 72h 的 HEK293 细胞的 RNA 中含有与目的 cDNA 片段对应的 mRNA。为了探索一种更经济高效的转染介质，本实验同时还制备了壳聚糖纳米颗粒(chitosan nanoparticles，CNP)，用此壳聚糖纳米颗粒包裹重组质粒 VRL 后转染 HEK293 细胞，转染的 HEK293 细胞中也表达与目的 cDNA 片段对应的 mRNA，说明了壳聚糖纳米颗粒也能作为一种有效的转染介质。用转染后
19、HEK293 细胞上清分别作抑制标准大肠杆菌、产毒性大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌和肺炎球菌生长实验，实验结果证明新构建的真核表达质粒 VRL 具有良好的抑制革兰氏阳性菌生长的效果，这些为深入开展 VRL 在动物体内的抗感染抑菌实验奠定了可靠的基础。溶菌酶(lysozyme，LYZ)是一种专门作用于微生物细胞壁的水解细菌细胞壁中粘多糖 -1，4-糖苷键的胞壁质酶，是一种碱性蛋白质，存在于许多动物、植物和微生物中。研究发现，溶菌酶对革兰氏阳性细菌具有直接的溶解作用，催化革兰氏阳性菌细胞壁不溶性多糖水解，生成可溶性黏肽。在分泌型免疫球蛋白A 和补体的参与下，溶菌酶还对革兰氏阴性细菌具有间接的溶
20、解作用，是一种天然的抗菌物质。由于其能够增强巨噬细胞和白细胞的吞噬和消化功能、将诱发炎症的酸性物质灭活、增强抗菌素及其它药物的疗效，具有消炎消肿、帮助组织修复、改善组织局部血液循环和分解脓液等药理作用，因此溶菌酶在医疗界中倍受关注。近年来，随着生物学技术和免疫学技术的发展，对溶菌酶的研究取得了令人瞩目的成就。利用 DNA 重组技术发展溶菌酶的抗菌效果，已成为其中重要的研究方向。 牛体内溶菌酶(bovine lysozyme，bLys)有大约 10 种，表达的潜在位点有：乳腺、唾液、泪液、胃、气管组织以及中性粒细胞、嗜红细胞、巨噬细胞、白细胞等。由于牛奶与人们的生活息息相关，其质量的好坏关系着人
21、们的健康，因此，对牛奶溶菌酶的研究尤为突出。为构建具有高效抗菌、活性持久的抗菌基因，探索研制新型抗菌制剂，克服耐药性细菌感染日益严重的问题，本实验构建了原核表达载体 pGEX-4T-1-Lys(pGL)。本实验是以成功构建的新型牛溶菌酶基因原核表达载体 pGL 为模板，用 PCR 扩增得到目的片段 Lys 基因，将 VR1020 和目的片段 Lys 分别用 BamHI 和 Bgl双酶切，并将VR1020 酶切片段先进行去磷酸化，然后将两种酶切产物在 16水浴过夜连接；连接产物转化大肠杆菌 DH5a 感受态细胞，筛选重组子，用碱裂解法小规模提取重组子质粒 DNA，用BamHI，Bgl作双酶切鉴定
22、验证，并作质粒 PCR 鉴定。经双酶切和质粒 PCR 的实验结果初步确定的阳性重组子进行双向基因测序，测序结果证明插入目的片段正确，证实新型牛溶菌酶基因已经克隆到真核表达载体 VR1020(VR1020-Lys，命名为 VRL)上。将重组质粒 VRL 以JetPEIlt;#39;TMgt; Cationic polymer 分子包裹，介导转染真核 HEK293 细胞，转染培养 24h、48h、72h 后分别提取培养细胞 mRNA 进行RT-PCR，与 VR1020 转染细胞比较发现，转染后 24h、48h 和 72h 的 HEK293 细胞的 RNA 中含有与目的 cDNA 片段对应的 mRN
23、A。为了探索一种更经济高效的转染介质，本实验同时还制备了壳聚糖纳米颗粒(chitosan nanoparticles，CNP)，用此壳聚糖纳米颗粒包裹重组质粒 VRL 后转染 HEK293 细胞，转染的 HEK293 细胞中也表达与目的 cDNA 片段对应的 mRNA，说明了壳聚糖纳米颗粒也能作为一种有效的转染介质。用转染后 HEK293 细胞上清分别作抑制标准大肠杆菌、产毒性大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌和肺炎球菌生长实验，实验结果证明新构建的真核表达质粒 VRL 具有良好的抑制革兰氏阳性菌生长的效果，这些为深入开展 VRL 在动物体内的抗感染抑菌实验奠定了可靠的基础。溶菌酶(lysoz
24、yme，LYZ)是一种专门作用于微生物细胞壁的水解细菌细胞壁中粘多糖 -1，4-糖苷键的胞壁质酶，是一种碱性蛋白质，存在于许多动物、植物和微生物中。研究发现，溶菌酶对革兰氏阳性细菌具有直接的溶解作用，催化革兰氏阳性菌细胞壁不溶性多糖水解，生成可溶性黏肽。在分泌型免疫球蛋白A 和补体的参与下，溶菌酶还对革兰氏阴性细菌具有间接的溶解作用，是一种天然的抗菌物质。由于其能够增强巨噬细胞和白细胞的吞噬和消化功能、将诱发炎症的酸性物质灭活、增强抗菌素及其它药物的疗效，具有消炎消肿、帮助组织修复、改善组织局部血液循环和分解脓液等药理作用，因此溶菌酶在医疗界中倍受关注。近年来，随着生物学技术和免疫学技术的发展
25、，对溶菌酶的研究取得了令人瞩目的成就。利用 DNA 重组技术发展溶菌酶的抗菌效果，已成为其中重要的研究方向。 牛体内溶菌酶(bovine lysozyme，bLys)有大约 10 种，表达的潜在位点有：乳腺、唾液、泪液、胃、气管组织以及中性粒细胞、嗜红细胞、巨噬细胞、白细胞等。由于牛奶与人们的生活息息相关，其质量的好坏关系着人们的健康，因此，对牛奶溶菌酶的研究尤为突出。为构建具有高效抗菌、活性持久的抗菌基因，探索研制新型抗菌制剂，克服耐药性细菌感染日益严重的问题，本实验构建了原核表达载体 pGEX-4T-1-Lys(pGL)。本实验是以成功构建的新型牛溶菌酶基因原核表达载体 pGL 为模板，用
26、 PCR 扩增得到目的片段 Lys 基因，将 VR1020 和目的片段 Lys 分别用 BamHI 和 Bgl双酶切，并将VR1020 酶切片段先进行去磷酸化，然后将两种酶切产物在 16水浴过夜连接；连接产物转化大肠杆菌 DH5a 感受态细胞，筛选重组子，用碱裂解法小规模提取重组子质粒 DNA，用BamHI，Bgl作双酶切鉴定验证，并作质粒 PCR 鉴定。经双酶切和质粒 PCR 的实验结果初步确定的阳性重组子进行双向基因测序，测序结果证明插入目的片段正确，证实新型牛溶菌酶基因已经克隆到真核表达载体 VR1020(VR1020-Lys，命名为 VRL)上。将重组质粒 VRL 以JetPEIlt;
27、#39;TMgt; Cationic polymer 分子包裹，介导转染真核 HEK293 细胞，转染培养 24h、48h、72h 后分别提取培养细胞 mRNA 进行RT-PCR，与 VR1020 转染细胞比较发现，转染后 24h、48h 和 72h 的 HEK293 细胞的 RNA 中含有与目的 cDNA 片段对应的 mRNA。为了探索一种更经济高效的转染介质，本实验同时还制备了壳聚糖纳米颗粒(chitosan nanoparticles，CNP)，用此壳聚糖纳米颗粒包裹重组质粒 VRL 后转染 HEK293 细胞，转染的 HEK293 细胞中也表达与目的 cDNA 片段对应的 mRNA，说
28、明了壳聚糖纳米颗粒也能作为一种有效的转染介质。用转染后 HEK293 细胞上清分别作抑制标准大肠杆菌、产毒性大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌和肺炎球菌生长实验，实验结果证明新构建的真核表达质粒 VRL 具有良好的抑制革兰氏阳性菌生长的效果，这些为深入开展 VRL 在动物体内的抗感染抑菌实验奠定了可靠的基础。溶菌酶(lysozyme，LYZ)是一种专门作用于微生物细胞壁的水解细菌细胞壁中粘多糖 -1，4-糖苷键的胞壁质酶，是一种碱性蛋白质，存在于许多动物、植物和微生物中。研究发现，溶菌酶对革兰氏阳性细菌具有直接的溶解作用，催化革兰氏阳性菌细胞壁不溶性多糖水解，生成可溶性黏肽。在分泌型免疫球蛋白
29、A 和补体的参与下，溶菌酶还对革兰氏阴性细菌具有间接的溶解作用，是一种天然的抗菌物质。由于其能够增强巨噬细胞和白细胞的吞噬和消化功能、将诱发炎症的酸性物质灭活、增强抗菌素及其它药物的疗效，具有消炎消肿、帮助组织修复、改善组织局部血液循环和分解脓液等药理作用，因此溶菌酶在医疗界中倍受关注。近年来，随着生物学技术和免疫学技术的发展，对溶菌酶的研究取得了令人瞩目的成就。利用 DNA 重组技术发展溶菌酶的抗菌效果，已成为其中重要的研究方向。 牛体内溶菌酶(bovine lysozyme，bLys)有大约 10 种，表达的潜在位点有：乳腺、唾液、泪液、胃、气管组织以及中性粒细胞、嗜红细胞、巨噬细胞、白细
30、胞等。由于牛奶与人们的生活息息相关，其质量的好坏关系着人们的健康，因此，对牛奶溶菌酶的研究尤为突出。为构建具有高效抗菌、活性持久的抗菌基因，探索研制新型抗菌制剂，克服耐药性细菌感染日益严重的问题，本实验构建了原核表达载体 pGEX-4T-1-Lys(pGL)。本实验是以成功构建的新型牛溶菌酶基因原核表达载体 pGL 为模板，用 PCR 扩增得到目的片段 Lys 基因，将 VR1020 和目的片段 Lys 分别用 BamHI 和 Bgl双酶切，并将VR1020 酶切片段先进行去磷酸化，然后将两种酶切产物在 16水浴过夜连接；连接产物转化大肠杆菌 DH5a 感受态细胞，筛选重组子，用碱裂解法小规模
31、提取重组子质粒 DNA，用BamHI，Bgl作双酶切鉴定验证，并作质粒 PCR 鉴定。经双酶切和质粒 PCR 的实验结果初步确定的阳性重组子进行双向基因测序，测序结果证明插入目的片段正确，证实新型牛溶菌酶基因已经克隆到真核表达载体 VR1020(VR1020-Lys，命名为 VRL)上。将重组质粒 VRL 以JetPEIlt;#39;TMgt; Cationic polymer 分子包裹，介导转染真核 HEK293 细胞，转染培养 24h、48h、72h 后分别提取培养细胞 mRNA 进行RT-PCR，与 VR1020 转染细胞比较发现，转染后 24h、48h 和 72h 的 HEK293 细
32、胞的 RNA 中含有与目的 cDNA 片段对应的 mRNA。为了探索一种更经济高效的转染介质，本实验同时还制备了壳聚糖纳米颗粒(chitosan nanoparticles，CNP)，用此壳聚糖纳米颗粒包裹重组质粒 VRL 后转染 HEK293 细胞，转染的 HEK293 细胞中也表达与目的 cDNA 片段对应的 mRNA，说明了壳聚糖纳米颗粒也能作为一种有效的转染介质。用转染后 HEK293 细胞上清分别作抑制标准大肠杆菌、产毒性大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌和肺炎球菌生长实验，实验结果证明新构建的真核表达质粒 VRL 具有良好的抑制革兰氏阳性菌生长的效果，这些为深入开展 VRL 在动物
33、体内的抗感染抑菌实验奠定了可靠的基础。溶菌酶(lysozyme，LYZ)是一种专门作用于微生物细胞壁的水解细菌细胞壁中粘多糖 -1，4-糖苷键的胞壁质酶，是一种碱性蛋白质，存在于许多动物、植物和微生物中。研究发现，溶菌酶对革兰氏阳性细菌具有直接的溶解作用，催化革兰氏阳性菌细胞壁不溶性多糖水解，生成可溶性黏肽。在分泌型免疫球蛋白A 和补体的参与下，溶菌酶还对革兰氏阴性细菌具有间接的溶解作用，是一种天然的抗菌物质。由于其能够增强巨噬细胞和白细胞的吞噬和消化功能、将诱发炎症的酸性物质灭活、增强抗菌素及其它药物的疗效，具有消炎消肿、帮助组织修复、改善组织局部血液循环和分解脓液等药理作用，因此溶菌酶在医
34、疗界中倍受关注。近年来，随着生物学技术和免疫学技术的发展，对溶菌酶的研究取得了令人瞩目的成就。利用 DNA 重组技术发展溶菌酶的抗菌效果，已成为其中重要的研究方向。 牛体内溶菌酶(bovine lysozyme，bLys)有大约 10 种，表达的潜在位点有：乳腺、唾液、泪液、胃、气管组织以及中性粒细胞、嗜红细胞、巨噬细胞、白细胞等。由于牛奶与人们的生活息息相关，其质量的好坏关系着人们的健康，因此，对牛奶溶菌酶的研究尤为突出。为构建具有高效抗菌、活性持久的抗菌基因，探索研制新型抗菌制剂，克服耐药性细菌感染日益严重的问题，本实验构建了原核表达载体 pGEX-4T-1-Lys(pGL)。本实验是以成
35、功构建的新型牛溶菌酶基因原核表达载体 pGL 为模板，用 PCR 扩增得到目的片段 Lys 基因，将 VR1020 和目的片段 Lys 分别用 BamHI 和 Bgl双酶切，并将VR1020 酶切片段先进行去磷酸化，然后将两种酶切产物在 16水浴过夜连接；连接产物转化大肠杆菌 DH5a 感受态细胞，筛选重组子，用碱裂解法小规模提取重组子质粒 DNA，用BamHI，Bgl作双酶切鉴定验证，并作质粒 PCR 鉴定。经双酶切和质粒 PCR 的实验结果初步确定的阳性重组子进行双向基因测序，测序结果证明插入目的片段正确，证实新型牛溶菌酶基因已经克隆到真核表达载体 VR1020(VR1020-Lys，命名
36、为 VRL)上。将重组质粒 VRL 以JetPEIlt;#39;TMgt; Cationic polymer 分子包裹，介导转染真核 HEK293 细胞，转染培养 24h、48h、72h 后分别提取培养细胞 mRNA 进行RT-PCR，与 VR1020 转染细胞比较发现，转染后 24h、48h 和 72h 的 HEK293 细胞的 RNA 中含有与目的 cDNA 片段对应的 mRNA。为了探索一种更经济高效的转染介质，本实验同时还制备了壳聚糖纳米颗粒(chitosan nanoparticles，CNP)，用此壳聚糖纳米颗粒包裹重组质粒 VRL 后转染 HEK293 细胞，转染的 HEK293
37、 细胞中也表达与目的 cDNA 片段对应的 mRNA，说明了壳聚糖纳米颗粒也能作为一种有效的转染介质。用转染后 HEK293 细胞上清分别作抑制标准大肠杆菌、产毒性大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌和肺炎球菌生长实验，实验结果证明新构建的真核表达质粒 VRL 具有良好的抑制革兰氏阳性菌生长的效果，这些为深入开展 VRL 在动物体内的抗感染抑菌实验奠定了可靠的基础。溶菌酶(lysozyme，LYZ)是一种专门作用于微生物细胞壁的水解细菌细胞壁中粘多糖 -1，4-糖苷键的胞壁质酶，是一种碱性蛋白质，存在于许多动物、植物和微生物中。研究发现，溶菌酶对革兰氏阳性细菌具有直接的溶解作用，催化革兰氏阳性菌
38、细胞壁不溶性多糖水解，生成可溶性黏肽。在分泌型免疫球蛋白A 和补体的参与下，溶菌酶还对革兰氏阴性细菌具有间接的溶解作用，是一种天然的抗菌物质。由于其能够增强巨噬细胞和白细胞的吞噬和消化功能、将诱发炎症的酸性物质灭活、增强抗菌素及其它药物的疗效，具有消炎消肿、帮助组织修复、改善组织局部血液循环和分解脓液等药理作用，因此溶菌酶在医疗界中倍受关注。近年来，随着生物学技术和免疫学技术的发展，对溶菌酶的研究取得了令人瞩目的成就。利用 DNA 重组技术发展溶菌酶的抗菌效果，已成为其中重要的研究方向。 牛体内溶菌酶(bovine lysozyme，bLys)有大约 10 种，表达的潜在位点有：乳腺、唾液、泪
39、液、胃、气管组织以及中性粒细胞、嗜红细胞、巨噬细胞、白细胞等。由于牛奶与人们的生活息息相关，其质量的好坏关系着人们的健康，因此，对牛奶溶菌酶的研究尤为突出。为构建具有高效抗菌、活性持久的抗菌基因，探索研制新型抗菌制剂，克服耐药性细菌感染日益严重的问题，本实验构建了原核表达载体 pGEX-4T-1-Lys(pGL)。本实验是以成功构建的新型牛溶菌酶基因原核表达载体 pGL 为模板，用 PCR 扩增得到目的片段 Lys 基因，将 VR1020 和目的片段 Lys 分别用 BamHI 和 Bgl双酶切，并将VR1020 酶切片段先进行去磷酸化，然后将两种酶切产物在 16水浴过夜连接；连接产物转化大肠
40、杆菌 DH5a 感受态细胞，筛选重组子，用碱裂解法小规模提取重组子质粒 DNA，用BamHI，Bgl作双酶切鉴定验证，并作质粒 PCR 鉴定。经双酶切和质粒 PCR 的实验结果初步确定的阳性重组子进行双向基因测序，测序结果证明插入目的片段正确，证实新型牛溶菌酶基因已经克隆到真核表达载体 VR1020(VR1020-Lys，命名为 VRL)上。将重组质粒 VRL 以JetPEIlt;#39;TMgt; Cationic polymer 分子包裹，介导转染真核 HEK293 细胞，转染培养 24h、48h、72h 后分别提取培养细胞 mRNA 进行RT-PCR，与 VR1020 转染细胞比较发现，
41、转染后 24h、48h 和 72h 的 HEK293 细胞的 RNA 中含有与目的 cDNA 片段对应的 mRNA。为了探索一种更经济高效的转染介质，本实验同时还制备了壳聚糖纳米颗粒(chitosan nanoparticles，CNP)，用此壳聚糖纳米颗粒包裹重组质粒 VRL 后转染 HEK293 细胞，转染的 HEK293 细胞中也表达与目的 cDNA 片段对应的 mRNA，说明了壳聚糖纳米颗粒也能作为一种有效的转染介质。用转染后 HEK293 细胞上清分别作抑制标准大肠杆菌、产毒性大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌和肺炎球菌生长实验，实验结果证明新构建的真核表达质粒 VRL 具有良好的抑
42、制革兰氏阳性菌生长的效果，这些为深入开展 VRL 在动物体内的抗感染抑菌实验奠定了可靠的基础。溶菌酶(lysozyme，LYZ)是一种专门作用于微生物细胞壁的水解细菌细胞壁中粘多糖 -1，4-糖苷键的胞壁质酶，是一种碱性蛋白质，存在于许多动物、植物和微生物中。研究发现，溶菌酶对革兰氏阳性细菌具有直接的溶解作用，催化革兰氏阳性菌细胞壁不溶性多糖水解，生成可溶性黏肽。在分泌型免疫球蛋白A 和补体的参与下，溶菌酶还对革兰氏阴性细菌具有间接的溶解作用，是一种天然的抗菌物质。由于其能够增强巨噬细胞和白细胞的吞噬和消化功能、将诱发炎症的酸性物质灭活、增强抗菌素及其它药物的疗效，具有消炎消肿、帮助组织修复、
43、改善组织局部血液循环和分解脓液等药理作用，因此溶菌酶在医疗界中倍受关注。近年来，随着生物学技术和免疫学技术的发展，对溶菌酶的研究取得了令人瞩目的成就。利用 DNA 重组技术发展溶菌酶的抗菌效果，已成为其中重要的研究方向。 牛体内溶菌酶(bovine lysozyme，bLys)有大约 10 种，表达的潜在位点有：乳腺、唾液、泪液、胃、气管组织以及中性粒细胞、嗜红细胞、巨噬细胞、白细胞等。由于牛奶与人们的生活息息相关，其质量的好坏关系着人们的健康，因此，对牛奶溶菌酶的研究尤为突出。为构建具有高效抗菌、活性持久的抗菌基因，探索研制新型抗菌制剂，克服耐药性细菌感染日益严重的问题，本实验构建了原核表达
44、载体 pGEX-4T-1-Lys(pGL)。本实验是以成功构建的新型牛溶菌酶基因原核表达载体 pGL 为模板，用 PCR 扩增得到目的片段 Lys 基因，将 VR1020 和目的片段 Lys 分别用 BamHI 和 Bgl双酶切，并将VR1020 酶切片段先进行去磷酸化，然后将两种酶切产物在 16水浴过夜连接；连接产物转化大肠杆菌 DH5a 感受态细胞，筛选重组子，用碱裂解法小规模提取重组子质粒 DNA，用BamHI，Bgl作双酶切鉴定验证，并作质粒 PCR 鉴定。经双酶切和质粒 PCR 的实验结果初步确定的阳性重组子进行双向基因测序，测序结果证明插入目的片段正确，证实新型牛溶菌酶基因已经克隆
45、到真核表达载体 VR1020(VR1020-Lys，命名为 VRL)上。将重组质粒 VRL 以JetPEIlt;#39;TMgt; Cationic polymer 分子包裹，介导转染真核 HEK293 细胞，转染培养 24h、48h、72h 后分别提取培养细胞 mRNA 进行RT-PCR，与 VR1020 转染细胞比较发现，转染后 24h、48h 和 72h 的 HEK293 细胞的 RNA 中含有与目的 cDNA 片段对应的 mRNA。为了探索一种更经济高效的转染介质，本实验同时还制备了壳聚糖纳米颗粒(chitosan nanoparticles，CNP)，用此壳聚糖纳米颗粒包裹重组质粒
46、VRL 后转染 HEK293 细胞，转染的 HEK293 细胞中也表达与目的 cDNA 片段对应的 mRNA，说明了壳聚糖纳米颗粒也能作为一种有效的转染介质。用转染后 HEK293 细胞上清分别作抑制标准大肠杆菌、产毒性大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌和肺炎球菌生长实验，实验结果证明新构建的真核表达质粒 VRL 具有良好的抑制革兰氏阳性菌生长的效果，这些为深入开展 VRL 在动物体内的抗感染抑菌实验奠定了可靠的基础。溶菌酶(lysozyme，LYZ)是一种专门作用于微生物细胞壁的水解细菌细胞壁中粘多糖 -1，4-糖苷键的胞壁质酶，是一种碱性蛋白质，存在于许多动物、植物和微生物中。研究发现，溶
47、菌酶对革兰氏阳性细菌具有直接的溶解作用，催化革兰氏阳性菌细胞壁不溶性多糖水解，生成可溶性黏肽。在分泌型免疫球蛋白A 和补体的参与下，溶菌酶还对革兰氏阴性细菌具有间接的溶解作用，是一种天然的抗菌物质。由于其能够增强巨噬细胞和白细胞的吞噬和消化功能、将诱发炎症的酸性物质灭活、增强抗菌素及其它药物的疗效，具有消炎消肿、帮助组织修复、改善组织局部血液循环和分解脓液等药理作用，因此溶菌酶在医疗界中倍受关注。近年来，随着生物学技术和免疫学技术的发展，对溶菌酶的研究取得了令人瞩目的成就。利用 DNA 重组技术发展溶菌酶的抗菌效果，已成为其中重要的研究方向。 牛体内溶菌酶(bovine lysozyme，bL
48、ys)有大约 10 种，表达的潜在位点有：乳腺、唾液、泪液、胃、气管组织以及中性粒细胞、嗜红细胞、巨噬细胞、白细胞等。由于牛奶与人们的生活息息相关，其质量的好坏关系着人们的健康，因此，对牛奶溶菌酶的研究尤为突出。为构建具有高效抗菌、活性持久的抗菌基因，探索研制新型抗菌制剂，克服耐药性细菌感染日益严重的问题，本实验构建了原核表达载体 pGEX-4T-1-Lys(pGL)。本实验是以成功构建的新型牛溶菌酶基因原核表达载体 pGL 为模板，用 PCR 扩增得到目的片段 Lys 基因，将 VR1020 和目的片段 Lys 分别用 BamHI 和 Bgl双酶切，并将VR1020 酶切片段先进行去磷酸化，
49、然后将两种酶切产物在 16水浴过夜连接；连接产物转化大肠杆菌 DH5a 感受态细胞，筛选重组子，用碱裂解法小规模提取重组子质粒 DNA，用BamHI，Bgl作双酶切鉴定验证，并作质粒 PCR 鉴定。经双酶切和质粒 PCR 的实验结果初步确定的阳性重组子进行双向基因测序，测序结果证明插入目的片段正确，证实新型牛溶菌酶基因已经克隆到真核表达载体 VR1020(VR1020-Lys，命名为 VRL)上。将重组质粒 VRL 以JetPEIlt;#39;TMgt; Cationic polymer 分子包裹，介导转染真核 HEK293 细胞，转染培养 24h、48h、72h 后分别提取培养细胞 mRNA 进行RT-PCR，与 VR1020 转染细胞比较发现，转染后 24h、48h 和 72h 的 HEK293 细胞的 RNA 中含有与目的 cDNA 片段对应的 mRNA。为了探索一种更经济高效的转染介质，本实验同时还制备了壳聚糖纳米颗粒(chitosan nanoparticles，CNP)，用此壳聚糖纳米颗粒包裹重组质粒 VRL 后转染 HEK293 细胞，转染的 HEK293 细胞中也表达与目的 cDNA 片段对应的 mRNA，说明了壳聚糖纳米颗粒也能作为一
