1、酿酒科技2005年第3期(总第129期)LIQUORMAKING SCIENCE11兰 ol 竺： ：! ! 苹果酸一乳酸发酵在葡萄酒酿造中的应用 甄会英，王 颉，李长文，张伟，袁 丽 (河北农业大学食品科技学院，河北保定071001) 摘要： 苹果酸一乳酸发酵(MLF)是红葡萄酒酿造的必经步骤，是葡萄酒生物降酸的主要方法， MLF可有效降低葡萄酒中的苹果酸。苹果酸是一种具有强烈辛酸味的双羧基酸，常规的物理、化 学降酸方法对苹果酸不起作用，而MLF可降解苹果酸，使之转化为单羧基的、口感酸味柔和的乳 酸，使葡萄酒的有机酸含量降低，酒体协调性增加，并可提高其生物稳定性和风味复杂性。本文介 绍了ML
2、F的机理、引起MLF的微生物及其在葡萄酒酿造中的作用，对影响MLF环境因素和现代 发酵工程技术(固定化技术和膜生物反应器)在MLF中的新的应用与发展也作了阐述。 关键词： 葡萄酒； 苹果酸一乳酸发酵； 酿造； 降酸 中图分类号：TS2626；TS2614文献标识码：A 文章编号：1001-9286(2005)030075-03 Application of Malolactic Fermentation in Wine Production ZHEN Hui-ying，WANG Jie and LI Chang-wen et al (Food Science&Technology Colleg
3、e of Hebei Agricultural University，Baoding，Hebei 071001，China) Abstract： MLF is the necessary procedure in red grape wine production and the important approach to decrease acid content in wine Malic acid is a kind of bicarboxylic acid with strong pungent smell and ordinary physical and chemical trea
4、tment could not eliminate itMLF could effectively reduce malic acid in red grape wine by de- grading malic acid and converting it into carboxylic lactic acid of soft tasteAs a result， organic acid content in grape wine decreased，wine boay harmony enhanced，and wine biostability and wine taste multipl
5、icity promotedIn this paper，the mechanism of MLF，the microbes causing MLF，and the effects of MLF in grape wine production were introduced Besides，the environmental factors and modern fermenting engineering techniques(stabilization techniques and membrane bioreactor)influencing MLF and the newly-deve
6、loped MLF application and MLF devel opment foreground were also discussed (Tranby YUE Yang) Key words：grape wine；malolactic acid fermentation(MLF)；brewing；acid content decrease 有机酸是葡萄酒的风味物质之一，葡萄酒中的有机 酸主要包括酒石酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸等。葡萄酒 中各有机酸的组成和含量直接或间接地影响着葡萄酒 的感官特性和质量。而在较寒冷地区和年份(如我国黄 河以北地区)，葡萄酒中的有机酸尤其是苹果酸的含量
7、过高，苹果酸酸味尖刻、粗硬【1，使酒体不协调，必须进行 降酸处理。 葡萄酒的降酸方法主要有物理降酸法、化学降酸法 和生物降酸法，但物理降酸法和化学降酸法主要是去除 酒中酒石酸及其盐类，不能除去苹果酸，其弊端在生产 上日益受到重视。要降低酒中苹果酸含量，必须采用生 物降酸法。 苹果酸一乳酸发酵是葡萄酒生物降酸的主要方法， 在增加葡萄酒风味和微生物稳定性、提高葡萄酒质量等 方面有重要作用，具有长远的研究和应用历史，目前在 国际葡萄酒生产中已得到了较广泛的应用。 1 苹果酸一乳酸发酵的机理和作用 苹果酸一乳酸发酵是葡萄酒酿造中乙醇发酵后的第 二个生化过程，是L-苹果酸在乳酸菌(actc acd ba
8、cte ra，LAB)的苹果酸一乳酸酶(malolactic enzyme，MLE)催 化下转变成L-乳酸和二氧化碳的过程。引起MLF的乳 酸细菌分属于酒球菌属(Oenococcus)、酒明串珠菌属 (Leuconostoc oenos)、足球菌属(Pediococcus)、乳杆菌属 (Lactobacillus)、片球菌属(Pe c0cc )和链球菌属 rep tOCOCCli印)。 经过MLF，酸味尖刻的二元酸L-苹果酸转变为酸 牧稿日期：200411-09 作者简介：甄会英(1974一)，女，河北人，在读硕士，研究方向为果蔬加工原理与技术。 维普资讯 http:/ 酿酒科技2005年第3
9、期(总第129期)LIQUORMAKING SCrF2NCETECHNOLOGY 2005 No3(ro1129) 昧柔和的一元酸L一乳酸，葡萄酒酸度降低，新(生)葡萄 酒酸涩、粗糙等特点消失，果香、醇香增加，获得柔软、有 皮肉和肥硕的H感，质量提高闭。另外，苹果酸的生理代 谢活跃，易被微生物分解利用，经过MLF还能增加葡萄 酒的生物稳定性，并生成双乙酰和乙偶姻而增加葡萄酒 的风味复杂性Flavor complexity)，因此，苹果酸一乳酸发 酵是酿造优质红葡萄酒必须进行的工艺。 2影响苹果酸一乳酸发酵的因素 MLF对环境条件的要求与乙醇发酵相比要苛刻得 多，影响MLF的因素包括：乳酸菌的营
10、养条件、酒精浓 度、二氧化硫含量、温度、葡萄酒的pH值等，这些因素 不同程度地影响MLF的进程。 21 营养条件的影响 苹果酸一乳酸发酵的乳酸细菌对营养的要求远远超 过酵母，尤其是对于氨基酸、尼古丁酸和泛酸，有时还需 要核黄素和吡醇IS；碳水化合物主要是果糖和葡萄糖41； MII2+,C02 ，Zn2+，M 等是乳酸菌代谢所必需的矿质元素 ；精氨酸对于乳酸菌的生长具有促进作用阍。 2_2酒精浓度的影响 酒精浓度过高会对乳酸菌的新陈代谢产生抑制作 用，尤其当酒精度超过了10(vv)，酒精就会变成阻碍 乳酸菌生长的重要因子，不同的菌株对酒精浓度的抗性 不同。研究表明，125(vv)的酒精不仅抑制乳
11、酸菌的 生长，还造成乳酸菌的大量死亡。在酿造葡萄酒时，人们 常常考虑在发酵醪酒精度较低时尽早进行苹果酸一乳酸 发酵。葡萄酒酒度越高，诱导期就越长，酒中的乳酸菌数 目也越稀少，苹果酸分解速度就越慢7-9。 23二氧化硫浓度的影响 二氧化硫(so )对乳酸菌是一个强烈的抑制因子， SO 能够强烈抑制ATP酶的活性，使之降低到37-58 。葡萄酒中的二氧化硫有结合二氧化硫、游离二氧化 硫等存在形式，游离二氧化硫比结合二氧化硫对乳酸菌 作用强，二氧化硫对苹果酸一乳酸发酵的抑制作用取决 于使用的乳酸菌种、葡萄酒的pH值以及酒中存在的可 溶性固形物含量。 一般情况下，总二氧化硫在100 以上，或结合 二氧
12、化硫在50 mgL以上，或游离二氧化硫在10 mgL 以上，就可抑制葡萄醪中乳酸菌繁殖I”】。 24发酵温度的影响 温度是影响苹果酸一乳酸发酵的重要因子。葡萄酒 明串菌属的最适生长温度为2025【翻。当温度低于18 时，苹果酸一乳酸发酵的速度开始下降；当温度在5 10可阻止苹果酸一乳酸发酵；而当温度高于30时， 苹果酸一乳酸发酵也将减弱。在实际应用中，苹果酸一乳 酸发酵的温度多在1820 ”。 25有机酸含量的影响 葡萄酒中有机酸的含量决定了葡萄酒的pH值，而 pH值是影响苹果酸一乳酸发酵的最基本因素之一，其作 用主要表现在：影响乳酸菌成活率，从而决定进入苹 果酸一乳酸发酵前迟滞期的长短；影响
13、乳酸菌的生长 速率，从而减缓苹果酸一乳酸发酵速度；影响葡萄酒中 乳酸菌的生长种类。 苹果酸一乳酸发酵在酸度较低的酒中很容易发生。 通常需要进行MLF的酒的pH值为28-35之间【13】，乳 酸菌最适生长pH为42-45闭。当pH值为30或更低 时，几乎所有的乳酸菌都受到抑制，在pH值3045之 间，pH值越高，苹果酸一乳酸发酵就越容易【1 。 2，6通气的影响 通入空气常常有利于乳酸细菌的生长。饱和空气的 新葡萄酒提前几天出现苹果酸一乳酸发酵，相反，如果用 纯氧饱和反而延迟，但不完全阻碍。总的说来，对葡萄酒 发酵过程通风有利于进行苹果酸一乳酸发酵圈。 此外，葡萄酒中还存在着乳酸细菌的噬菌体，而
14、且 这些噬菌体在形态和类型等方面都存在着差异，因此， 用于进行苹果酸一乳酸发酵的乳酸菌必须具有抗性；铜 离子、残留杀虫剂等也会影响乳酸菌的生长及对葡萄酒 的作用；以前普遍认为红葡萄酒中的多酚化合物酚酸、 单宁酸等也可以抑制苹果酸一乳酸发酵旧，而Rozes N 等发现50 mgL或更多的酚类化合物促进乳酸菌的生 长，在柠檬酸和海藻糖存在的条件下，优先利用柠檬酸 和海藻糖而不是葡萄糖和果糖，酚类化合物可以降低糖 的消耗而提高对柠檬酸的降解。 3 MLF的诱导 31 自然诱导 提供适宜的环境条件，MLF可以自然发生。但是，自 发的苹果酸一乳酸发酵是难以预测的，由于酒精发酵后 的葡萄酒中可能还存在乳酸
15、菌的噬菌体，它们可能延迟 或抑制MLF，使得MLF在触发上难以保证。这种延迟对 葡萄酒酿造者而言，是相当昂贵的，它增加了腐败菌在 进行MLF的同时产生异香与异味，导致葡萄酒病害的 可能性。这种危险在允许葡萄酒中细菌生长的情况下会 增加，温暖的气温、很低的SO 、适宜的pH值，非常有利 于微生物腐败。调查发现，仅有一半未接种葡萄酒在一 个月后进行苹果酸一乳酸发酵【切。 32人工接种诱导 生产上常利用优良乳酸菌种经人工培养后添加到 葡萄酒中，以克服自然发酵不稳定、难控制等问题。现在 人们已开始应用更为简单的方法进行MLF。如可利用引 子培养物(含乳酸菌的发酵剂)，不但可以迅速达到触发 MLF的数量
16、级，而且在MLF过程中居于主导地位，有利 于酿造优质干红葡萄酒。目前，一些冷冻干菌种不用活 化和扩培就可以直接加入到葡萄酒中。根据不同的地域 维普资讯 http:/ 甄会英，王 颉，李长文，张伟，袁 丽苹果酸一乳酸发酵在葡萄酒酿造中的应用 条件和原料品质选择适宜的菌种进行MLF，成为葡萄酒 厂酿制优质高档佳酿的关键 。 4 MLF的抑制 苹果酸一乳酸发酵并不总是对改进葡萄酒的品质有 益处，有时即使用理想的乳酸菌发酵，也难免会产生一 些不愉快的气味。一般来说，如果希望获得口味清爽，果 香味浓，尽早上市的白葡萄酒，则应防止这一发酵的进 行。为此，可以采取以下抑制措施：保持葡萄酒的pH值 在32以下
17、；使酒精度达14以上；低温贮存；把总二氧 化硫浓度调至50 mgL以上，尽早倒酒和澄清；减少葡 萄皮的浸渍时间；巴斯德灭菌和滤菌板过滤；添加化学 抑制剂；添加细菌素，如乳酸链球菌素(Nisin)、植物乳 杆菌素(Plantaricin)和片球菌素(Pediocin)等；添加溶 菌酶【阍o 5现代发酵工程技术在苹果酸一乳酸发酵中的应用 由于MLF对发酵条件的要求比较复杂，生产上常 常出现MLF发酵迟滞甚至接种失败的现象。为此，酿酒 者希望有快速、可行的方法启动并完成MLF。近年来，现 代发酵工程技术的进展，为革新MLF的工艺操作提供 了新的思路。 51固定化技术 固定化技术是2O世纪6O年代在相
18、应学科发展的 基础上产生的一种新的生物技术。所谓固定化技术，是 指利用化学或物理手段将游离的微生物细胞或酶，定位 于限定的空间区域并使其保持活性，使之成为连续流动 的生物反应器，并可反复使用的一种基本技术【堋。包括 固定化酶技术和固定化细胞技术。 微生物的固定化法主要有包埋法、吸附法、交联法 和微胶囊化4种方法。以前用于葡萄酒MLF的固定化 技术只有包埋法和吸附法两种。 Kosseva MR 等在用 果胶酸盐制成的微胶囊固定乳酸菌casei细胞进行 MLF，控制二氧化硫、pH值和有机酸的含量对苹果酸一 乳酸酶的影响，固定化的乳酸菌降解了3O的苹果酸， 使白葡萄酒的pH从315上升到了34O，
19、固定化的乳 酸菌的苹果酸的转化率是游离Lactobacilluscasei细胞 的2倍，且稳定性好，可持续达6个月。并且试验还表明 微胶囊可提高发酵率，能在高酒精度下诱导MLF。 与固定化细胞技术相比，固定化酶技术需要酶的分 离，并且需要辅酶再生，因此该技术在生产上的应用受 到很多限制。Tsakiris，Aa2 】等用商业的Saccharomyce5 cerevisiae菌株(Uvaferme 299)制成固定化生物催化剂 (Immobilized Biocatalysts)，用于常温(1525。C)的干白葡 萄酒的发酵，发酵产物具有低挥发酸、低甲醇和乙醛含 量等特性，该固定化细胞系统可稳定持
20、续4个月，感官 评价表明与游离细胞系统相比，葡萄酒风味品质有明显 提高。 52 膜生物反应器(Membrane Bioreactor，MBR)的应用 膜生物反应器技术是对固定化技术的发展，是通过 凝胶膜、人工聚合膜或其他膜载体把酶酶、酶辅酶、 酶细胞或细胞器酶等反应组元固定起来(也可以是游 离态)进行生化反应 。目前，该技术已被用来进行MLF 的研究。Vaillan 等从酒明串珠菌8406中提取纯化了 MLE，并把游离的MLE和辅酶因子通过特制的Polysul fone膜及有机玻璃反应板制成生物反应器进行MLF，结 果表明，苹果酸的分解率可达7O以上。 6结语 几十年来，人们对MLF进行了大量
21、的研究，但目前 仍存在着一些需要解决的问题，发酵工程技术在MLF 中的应用还只是处在一个开发和研究的阶段， MLF还 只能部分地进行，虽然通过基因工程技术选育出了苹果 酸一乳酸酵母，但菌株的遗传稳定性、苹果酸一乳酸酶基 因和苹果酸通透酶基因在工业葡萄酒酵母菌中的表达 及其安全性等问题还有待解决，并且这两方面的研究都 在一定程度上依赖于生物技术的发展。目前，选育耐低 pH、较高酒精度和SO 且酿酒特性好的乳酸菌种的需求 较为迫切，LAB的营养条件、MLF的发生与控制的研究 还需加强。 参考文献： 【1朱华葡萄酒的芳香成分【J】酿酒科技，1996，(2)：52-53 2李华葡萄酒的苹果酸一乳酸发酵
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25、H值。同时醪液中糖类减少尤其是葡萄糖减 少，有机酸相对减少了，所以pH值有上升之势。 随着发酵的进一步进行，发酵产生酒精的速度逐渐 减慢，同时糖化的速度也在减慢，发酵醪中碳源与氮源 比相对稳定，也就是说有机酸与氨基酸类相对平衡。因 此会使发酵醪中的pH值达到一个相对平稳的过程。 第三阶段：在发酵末期，菌体自溶时随着营养物质 的耗尽与菌体蛋白酶的活跃，发酵醪中氨基酸增加致使 pH值上升，此时菌体趋于自溶而代谢活动终止。 由此可见，在适合酵母菌生长及合成产物的环境 下，菌体本身具有调节pH的能力而使pH处于适宜状 态，但当外界条件发生变化且过于剧烈，菌体就失去调 节能力，pH就会发生波动回，两种菌
26、在其生命活动中会 改变发酵醪中的pH，其可能发生的反应有以下几种13。 ，糖类 I 水解 有机酸 变酸 pH下降 发酵醪有机物 脂肪 L蛋白 氨基酸 变碱 pH上升 2 pH对黄酒发酵过程的影响网 发酵过程中pH值是一个综合性指标，它与微生物 的生长繁殖及代谢产物的积累有很大关系。 21 pH值影响酶的活性，当pH值抑制或激活菌体中 某些酶活性时使微生物的代谢途径发生改变。 22 pH值影响酵母菌，霉菌的细胞膜带电荷的状况； 菌体带电荷的改变使膜的渗透性改变，从而有可能影响 菌体的营养吸收及代谢产物的分泌。 23 pH值还可能影响发酵醪中某些营养物质的分解 或酵母中问代谢产物的解离，从而影响酵
27、母对这些物质 的利用。 3发酵过程中pH的调节 当发酵出现问题时，一般可用调节pH的办法加以 补救。目前一般采用“治本”与“治标”两种办法来调节。 在发酵中期、后期采用“治本”的办法，当发酵醪过 酸时提高通气量，反之降低通气量。 在发酵末期一般采用“治标”的办法，加入Ca(OH)： 中和或加入乳酸增酸。一般情况下最好采用“治本”的方 法。所以在早期就要密切注意pH的变化情况，使发酵 能更加完全。 参考文献： 1】陈荣三，等无机及分析化学MI北京：北京高等教育出版社， 1 9859495 2】李永泉发酵工程原理和方法眦】杭州：杭州大学出版社， 199I4208 3】同德庆，等微生物学教程M】北京
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