1、研究论文 哪。 Af= E 荧光定量PCR方法分析皱纹盘鲍HSP70在温度胁迫下的表达 程培周 ，刘 晓 ，张国范 ，高其康。 (1中国科学院海洋研究所，山东青岛266071；2中国科学院研究生院，北京100049；3浙江大学分析测 试中心，浙江杭州310029) 摘要：根据皱纹盘鲍(Haliotisdiscus hannai Ino)HSP70和Actin mRNA序列，设计合成引 物，建立了皱纹盘鲍HSP70的荧光定量PCR技术平台，并用于检测皱纹盘鲍在热激处理后 不同恢复时间HSP70的转录水平变化。结果表明在热诱导后，肌肉组织HSP70的表达呈 时间依赖性，存在先升高后降低的趋势，在热
2、诱导后2 h，肌肉HSP70基因的表达量明显升 高，是对照组(0 h)的15倍，随后HSP70的表达量继续升高，在诱导后12 h达到最高值，是 对照组的21倍。然后表达量开始回落，至热诱导后96 h，HSP70表达量降至初始值，表现出 一种瞬时表达的趋势。 关键词：皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai Ino)；热激蛋白70；荧光定量PCR 中图分类号：Q78 文献标识码：A 文章编号：10003096(2007)10007705 应激时机体组织细胞内热激蛋白(heat shock protein，HSP)的量会发生急剧变化以稳定改变了的 细胞内环境，维持细胞的生存。HSP含
3、量发生急剧 变化的原因可能是应激时HSP基因转录水平的变 化 】；热激蛋白可能通过不同的调节方式由细胞核 进入细胞质，在细胞各组织中有选择地进行表达2 ； 也可能是HSP mRNA的稳定性在应激时有所变化； 或者是在机体受到应激时，热激蛋白的降解速度发 生改变所致3。HSP的研究目前主要集中在功能和 表达调控两个方面，其中HSPs的表达调控研究主要 在转录和翻译两个水平，以前者为主。因此正确度量 应激反应过程中HSPs含量的改变是许多学者所关 注的重点问题之一，建立有效的HSPs mRNA定量 方法也是非常必要的。实时荧光定量PCR(fluores cence quantitative PCR
4、，FQ-PCR)技术是近几年开发 成功的准确的基因定量方法，与Northern印迹法、斑 点印迹法相比，具有准确、灵敏、简便等特点，在微生 物的检测、转基因食品的检测、基因表达研究等方面 有重要的应用价值4。SYBR Green模式的荧光 PCR是利用荧光染料SYBR Green I与DNA双链结 合后释放荧光的特点而建立的一种应用较广的荧光 PCR技术，它具有成本低、不需设计探针，且适合于 高度变异的基因检测等优点。本试验利用PCR产物 样品制作标准曲线，以及利用SYBR Green I染料建 立实时荧光定量RTPCR技术平台，对HSP70在温 度胁迫下不同恢复时间的表达进行实时检测，研究
5、热激应激时HSP mRNA转录水平的变化，以探讨应 激时HSP量变化的原因和机理。 1 材料和方法 11 材料和试剂 皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai Ino)取自薛家 岛养殖场，平均壳长为63 mm_-+-45 mm在16C控 温的沙滤海水暂养，气泵充气保证供氧，每天换水一 次，每天投喂海带，暂养7 d。将鲍从16C海水取出 放入3O海水中保持1 h。然后放回到1 6海水中， 处理后在不同的时间(O，2，12，24，72和96 h)随机取 3头鲍的肌肉组织于一80C保存。抽提RNA。 Trizol购自Invitrogen公司；MMLV，RQ1 RNaseFree DNa
6、se购自Promega公司；PCR产物纯 化试剂盒(OMEGA，USA)购自0MEGA公司； SYBR Green I染料，上海开放科技有限公产品；iCy cliQTM荧光实时多波长PCR检测系统，美国Bio- Bid公司产品。 收稿H期：20060518；修回H期：20060620 基金项目：国家863计划项目(2003AA603023， 2004AA62607O)；国家自然科学基金项目(3037111 7) 作者简介：程培周(1977一)，男，山东潍坊人，博士，助研，研究 方向为贝类遗传育种，Email：chenpeizhoumsqdioac cn；张国范，通讯作者，研究员，博导，Emai
7、l：gfzhangms qdioaccn Marine SciencesV0131，No102007 77 维普资讯 http:/ 研究论文 。 开 E 12 方法 121 RNA提取及纯化 RNA用Trizol Reagent(Invitrogen)按照说明书 提取。用RQ1 RNaseFree DNase消化去除总RNA 样品中的DNA，加入25 L DNase buffer，25 L DNase在37下温浴30 min；加入2 L Stop Buff er，65C10 min，终止反应；电泳，紫外分光光度计测 量RNA浓度及纯度。 122引物设计 利用primer premier50引物
8、设计软件根据皱纹 盘鲍HSP70全长序列(GenBank Accession no： DQ324856)设计特异性引物：HSP70 F：5 GAT GCC AAT GGT ATC CTC AAT G-3；HSP70 F： 5一TGA AGA TGA CAA GAA GAC CA-3；HSP7O R：5一ACT TCT ACT GTT CTT CTG GT-3； HSP70 F1和HSP70 R扩增片段为520 bp，回收片 段，作为标准曲线用DNA。HSP70 F和HSP70 R预 期扩增片段长度为260 bp，应用于HSP70的定量。 持家基因13-actin的引物是基于GenBank(Ge
9、nBank Accession No：AY380809)的序列设计：-actinF(5 CCG ACG GTC AGG TCA TCA C-3)；-actinR(5一 CTC ATC GTA CTC CTG CTT 3)预期的 actin 产物长度为350 bp左右。 123 Real Time PCR PCR反应体系为总体积25 L：BioRad Super sYbRGreen mix125 L；模板20 L；正向引物(5 molL)05 L；反向引物(5molL)05 L；超纯 水1O L，补足25 L。PCR反应条件：94C预变性3 min；94变性30 S；55退火30 S；72延伸1
10、 min； 78 30 26 22 18 14 10 6 4O个循环；72C延伸10 min，根据标准曲线，求出待 测cDNA中目的基因(模板)的原始数量(浓度)对标 准品的比值。归一化：每份cDNA中目的基因量除 以持家基因量。计算一个目的基因(转录水平)在不 同cDNA样品中相差的倍数公式为 一 C1- Ca 式中，C ：HSP70基因处理样品的根据标准曲线 将C 值转化为模板的原始浓度；C ：持家基因处理样 品的根据标准曲线将c 值转化模板原始浓度；C。： HSP70基因对照样品的根据标准曲线将C 值转化模 板原始浓度；C ：持家基因对照样品的根据标准曲线 将C 值转化模板原始浓度；C
11、：指产生可被检测到的 荧光信号所需的最小循环数。 2 结果 21 标准曲线的建立 HSP70 F和HSP70 R引物扩增片段为520 bp， 回收片段，作为标准曲线用DNA。分光光度计分析 回收PCR产物的质量浓度为0038 5 gL，A 。为 188，适合作为标准品分析。实验结果显示，HSP70 标准品DNA在稀释1O。，1O ，1O ，1O ，1O ，1O。倍后 制作标准曲线，从图1可知，标准曲线回归方程为Y ：一3483x+36636，斜率为一3536，相关系数为 0996(POO1)，PCR扩增效率为9378 ，其中y 代表C 值， 代表模板量的对数值。结果表明标准曲 线的斜率值接近理
12、想值一3 322，一致系数也接近 1000 相关系数：0996，斜率：一3483，截距：36636，Y=一3483X+36636 扩增效率：937 a样品 。标准品 # 一一 1日一i 一鼬 一 i ： - 、：= 2 3 4 5 6 7 8 最初拷贝数对数值 图1 HSP70标准曲线 Fig1 Standard curve for HSP70 海洋科学2007年第31卷第10期 医 坦 维普资讯 http:/ 研究论文 A只 E 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 扩增循环数 图2 HSP70扩增曲线 Fi
13、g2 HSP70 Real time amplication curve 22热诱导后肌肉组织HSP70表达变化 3 讨论 如图3所示，分析结果表明：在热诱导后，肌肉组 织HSP70表现出具有显著差异的时间依赖性。表现 为先升高后降低的趋势，在肌肉热诱导后2 h， HSP70基因的表达量明显升高，是对照组(0 h)的15 倍，随后HSP70的表达量继续升高，且在诱导后12 h 达到最高值，是对照组的21倍。然后表达量开始回 落，至热诱导后96 h，HSP70表达量基本降至初始 值。表现出一种瞬时表达的趋势。 0 12 0 10 0 08 0 06 004 0 02 0 0 2 12 24 72
14、 96 热诱导处理后时间，h 图3 Real time PCR检测热诱导后肌肉组织不同时间点的 HSP70表达 Fig3 Realtime PCR analysis of HSP70 gene expression in response of heat shock 本试验建立了皱纹盘鲍的HSP70荧光定量的检 测技术平台。SYBR Green I是一种可与dsDNA双 螺旋小沟区域结合的具有绿色激发波的染料。荧光 定量PCR反应过程中，随着PCR产物的增加，PCR 产物与SYBR Green I结合的量增大，两者结合后形 成的荧光信号可被仪器检测到，每个环延伸结束后， 在8O收集荧光8 S，
15、所得的荧光线实时地反映了 PCR过程中产物量的增加；熔点曲线分析可以对 PCR产物的特异性进行鉴定；标准曲线制作采用了 PCR产物回收法，结果表明该方法简单可行，未知样 品通过与标准曲线比较即可得定性及定量的结果。 由于试验选取的组织块具有一定程度的差异，抽提的 RNA得率会出现偏差，各样品RNA反转录效率的 差异都将会影响到最后的结果而产生误差。为了较 充分地比较HSP mRNA转录水平的差异，笔者在试 验中检测了每个样品的持家基因Actin的相对数量， 用以把目的基因归一到相同细胞数进行比较，使细胞 数目的差异(误差)尽可能降低。提取的所有RNA 模板用DNase I进行了消化，消除在取R
16、NA过程中 带有的少量基因组DNA所带来的干扰。 Real TimePCR检测到热诱导后皱纹盘鲍肌肉 组织中HSP70在不同时间点的转录表达。在热诱导 后，肌肉组织HSP70表达表现出具有显著差异的时 间变化。在肌肉热诱导后2 h，HSP70基因的表达量 明显升高，是对照组(0 h)的15倍，随后HSP70的表 Marine SciencesV。131N。102007 79 0 3 2 2 1 1 一 研米 u l雷 鲁 l雷 。 工 维普资讯 http:/ 研究论文 。 ARTICLE 达量继续升高，且在诱导后24 h达到最高值，是对照 组的21倍。然后表达量开始回落，至热诱导后96 h，
17、HSP70表达量基本降至初始值。 HSP70是主要的胁迫诱导HSP蛋白，许多内部 及外部环境条件均能诱导其表达，如：热诱导、寄生 病、酒精、重金属、挤压及炎症等。各种胁迫因子均导 致细胞内变性蛋白质的含量增加l5。在细胞内， HSP70作为“分子伴侣”可辨认和稳定蛋白质在折 叠、装配过程中的中间产物，当细胞处于应激状态时， 它可结合细胞内变性或新合成的异常蛋白，限制其 聚合或将其修复，不能修复者将其降解，同时还可促 进某些变性蛋白的降解和清除，重新激活某些酶的 活性，以维持细胞的功能和生存，以及抵抗某些细胞 毒性因素引起的细胞凋亡、延长细胞的存活l6。HSP 可增加细胞对伤害性刺激的耐受性，提
18、高细胞的存 活率，具有明显的保护作用I7。 在大部分生物中，热诱导均能使HSP70的表达 量升高，诱导性HSP70是HSP70s家族中研究最多 的成员之一8 。早期的研究表明，此类蛋白的诱导 与生物对高温的耐受力呈密切的相关性l8。在相对 较高的温度条件下，HSP70可以促进生长，在接近致 死温度时，HSP70保护生物体维持生活力。众所周 知，热诱导可以使细胞中蛋白质变性并发生聚合，并 破坏重要细胞器的完整性，抑制某些重要的生理生 化过程，如转录和表达过程。而在其他生物的大量研 究中，从正反两方面证明了热休克所诱导的保护作 用是由于热休克蛋白高表达，尤其是HSP70高表达 的结果。HSP70可
19、以与新生蛋白及受热诱导影响而 伸展的蛋白结合，防止它们产生聚合并催化它们重 新折叠成原来的状态ll ，这是其热耐受的分子机制 之一。本试验研究了不同胁迫条件对皱纹盘鲍 HSP70基因的表达影响，结果发现胁迫条件对皱纹 盘鲍HSP70的表达影响与其他生物中的研究结果一 致l1 ”。热诱导能促进HSP70的上调表达，表明 HSP70可能参与了皱纹盘鲍的免疫。 参考文献： 1 ShyuW C，KaoM C，ChouW Y，et a1Heat shock modulates prion protein expression in human NT 2 Ceils口Molecular Neuroscie
20、nce，2000，2：771774 2Saavedra C A，Hammell C M，Heath C VYeast heat shock mRNAs are exported through a distinct path way defined by RiplpJGenesand Development， l997，1l：2 8452 856 8O 3Benedetti A，Baglioni CTran slational regulation of the synthesis of a major heat shock protein in HeLa cellsJThe Journal
21、of Biological Chemistry，1986， 261：15 800 15 804 E4 张立国，张琚实时定量PCR技术的介绍J生物技 术，2003，13(2)：39-40 E5Feder M E，Hofmann G EHeatshock proteins，mo lecular chaperones，and the stress response：evolu tionary and ecological physiologyJAnnu Rev Physi一 0l，1999，61：243 282 6 Mayer M P，Bukau BHsp70 chaperones：cellular
22、 functions and molecular mechanismJCell Mol Life Sci，2005，62：670684 7 Kabakov A E，Budgaova K R，Bryantsev A LHeat shock protein 70 or heat shock protein 27 overex pressed in human endothelial ceils during posthypoxic reoxygenation can protect from delayed apoptosis-J Cell Stress Chaperones，2003，8：335
23、 347 EsBuckley A B，Owen M E，Hofmann G EAdjusting the thermostat：the shreshold induction temperature for the heatshock response in intertidal mussels(ge nus Mytilus)changes as a function of thermal history EJThe Journal of Experimental Biology，2001，204， 3 5713 579 9Hofmann G E，Buckley B A，Airaksinen
24、S，et a1 Heatshock protein expression is absent in the Antarc tic fish Trematomus bernacchii(Family nototheniidae) EJThe Journal of Experimental Biology，2000，203： 2 331 2 339 10Welch W JMammalian stress response：cell physi ology，structurefunction of stress proteins，and im plications for medicine and
25、diseaseJPhysiological Review，l992，72(4)：l O63一l O81 11 Amro M H，Daniel P CPhenotypic plasticity of HSP70 and HSP70 gene expression in the pacific oys ter(Crassostrea gigas)：Implications for thermal limits and induction of thermal toleranceJBiol Bull，2003，205：l 6Ol69 12Deane E E，Woo N Y S WCloning an
26、d characteriza tion of the hsp70 multigene family from silver sea bream：Modulated gene expression between warm and cold temperature acclimationJBiochmieal and Biophysical Research Comunications，2005，330：776 783 海洋科学2007年第31卷第lO期 维普资讯 http:/ 研究论文 。 ARTICLE Real-time PCR analysis of HSP70 gene express
27、ion in response to heat shock CHENG Peizhou ，LIU Xiao ，ZHANG Guofan ，GAO Qikang。 (1Institute of Oceanology，Chinese Academy of Sciences，Qingdao 26607 1，China；2Graduate School，Chi nese Academy of Sciences，Beijing 100039，China；3Center of Analysis&Measurement of Zhejiang Univer sity，Hangzhou 310029，Chin
28、a) Received：May，18，2006 Key words：abalone Haliotis discus hannai Ino；Heat shock protein 70；FQ-PCR Abstract：The transcription changes of abalone HSP mRNA were studied during the heat stressingAc cording to the specific sequence of HSP70 and ACTIN mRNA。the primers were designed and synthesizedBy means
29、 of established fluorescence quantitative RTPCR method，the transcription changes of the HSP70 mR NA and the HSP70 mRNA in muscle of transport stressed abalone were studied after 2，1 2，24，72 and 96 h after heat shockThe volume ratios were calculated as the HSP70 relative expression valuesIn muscle，le
30、vels of HSP70 were significantly increased compared to untreated control abalone，at 2 h of recovery following the heat shockHSP70 levels reached the peak，at 1 2 h of recoveryAfter that，the HSP70 levels dropped tiU 96 hwhen HSP70 returned to eontrollevels (本文编辑：张培新) 海洋科学杂志2008年征订启事 海洋科学是由中国科学院海洋研究所主办
31、、科学出版社出版的学术性期刊，中国自然科学核心期刊、华 东地区优秀期刊、山东省优秀期刊。本刊以密切联系生产实际、服务于我国现代化建设为宗旨，及时、快速报 道海洋学及其分支学科的新成果、新理论、新观点、新工艺及新进展等，对重大科研和应用性研究成果特别予 以优先报道。主要刊载内容有：海洋生物、海洋水产生产、海洋活性物质提取、海洋环境保护、海洋物理、物理 海洋、海洋地质、海洋化学、海洋工程、海洋仪器研制等方面的学术论文、研究报告、研究简报、专题综述、学术 讨论和争鸣、学术动态以及新产品介绍(有偿刊登)等。 本刊为月刊，每月9日出版，大16开，96页，每期定价3O元，全年订价36000元。本刊国内外公
32、开发行 (国际刊号：ISSN10003096；国内刊号：CN37一l1 51P；国内邮发代号：2-655；国外发行代号：M6666)。全国各 地邮局均可订阅。欢迎各科研机构、高等院校、生产厂家和从事该领域的科技人员踊跃订阅。邮局订阅不便 者可直接向本刊编辑部订购。本刊发行量在同类期刊中一直名列前茅，订户遍及全国2O多个省、市、自治区， 影响面广，宣传力大，欢迎广大的广告客户在本刊刊登广告，价格优惠。 欢迎订阅海洋科学欢迎广告惠顾 海洋科学编辑部地址：山东省青岛市南海路7号，266071 电话及传真：O53282898755 Email：MSJmsqdioaeen Marine SciencesVo131，No1O2007 81 维普资讯 http:/
