1、荧光寿命测定的现代方法与应用房 喻 王 辉(陕西师范大学化学系 西安 710062)房 喻 男 ,44 岁 ,博士 ,教授 ,主要从事光物理应用和高分子胶体与界面研究。 E2mail :yfang snnu. edu. cn国家自然科学基金资助项目 (29973024)和教育部中青年骨干教师基金资助项目 (3006)2001201231 收稿 ,2001202225 修回摘 要 介绍了时间相关单光子计数 、相调制和频闪等三种现代荧光寿命测定方法的工作原理 ,指出了各种方法的优点和局限性 ;介绍了时间相关单光子计数实验数据的处理方法 ;概述了时间分辨荧光技术在化学和生命科学中的应用。关键词 荧光
2、寿命 单光子计数 相调制法 频闪技术Abstract The principles and characteristics of some of the modern techniques , including time2correlated single2photon counting (TCSPC) ,phase modulation and strobe techniques , for fluorescence lifetime measurements have beenbriefly introduced. The advantages and disadvantages of
3、each method have also been pointed out. The common methodused for the analysis of the fluorescence decay , taking TCSPC as an example , has been discussed in detail. On thebasis of these introductions , the applications of time2resolved fluorescence techniques in chemical and biological re2search ha
4、ve been overviewed.Key words Fluorescence lifetime , Time2correlated single photon counting , Phase modulation methods , Strobetechniques荧光是分子吸收能量后其基态电子被激发到单线激发态后由第一单线激发态回到基态时所发生的 ,而荧光寿命是指分子在单线激发态所平均停留的时间。荧光物质的荧光寿命不仅与自身的结构而且与其所处微环境的极性、粘度等条件有关 ,因此通过荧光寿命测定可以直接了解所研究体系发生的变化。荧光现象多发生在纳秒级 ,这正好是分子运动所发生的时间尺度
5、 ,因此利用荧光技术可以“看”到许多复杂的分子间作用过程 ,例如超分子体系中分子间的簇集 1 、固液界面上吸附态高分子的构象重排 2 、蛋白质高级结构的变化 3 等。除了直接应用之外 ,荧光寿命测定还是其它时间分辨荧光技术的基础。例如基于荧光寿命测定的荧光猝灭技术可以研究猝灭剂与荧光标记物或探针相互靠近的难易 ,从而对所研究体系中探针或标记物所处微环境的性质作出判断。基于荧光寿命测定的时间分辨荧光光谱可以用来研究激发态发生的分子内或分子间作用以及作用发生的快慢。另外 ,非辐射能量转移、时间分辨荧光各向异性等主要荧光技术都离不开荧光寿命测定。因此本文拟对荧光寿命测定的主要方法、各种方法的原理、特
6、点以及荧光寿命测定的主要应用进行介绍。1 荧光寿命测定荧光寿命测定的现代方法主要有三种 ,即时间相关单光子记数法 ( Time2Correlated Single2PhotonCounting , TCSPC) 、相调制法 (Phase Modulation Methods) 和频闪技术 (Strobe Techniques) 。在这些方法出现之前 ,人们也曾通过测定荧光物种在溶液中的荧光偏振 ( P) 、溶液粘度 ( ) 以及估算荧光物种136http :PPchina. chemistrymag. org 化学通报 2001 年 第 10 期 1995-2003 Tsinghua Tong
7、fang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.的分子体积 ( V0 ) ,根据 Perrin 方程来计算荧光寿命 4 ,虽然这种方法所用仪器比较简单 ,但测定过程 烦琐 ,而且不管荧光衰减机理 ,都只给出平均寿命 ,因此实际应用意义有限。1P -13 1P0 -13 1 +RT V0 (1)111 时间相关单光子记数法 4 ,5 TCSPC 是目前主要应用的荧光寿命测定技术 ,1975 年由 PTI(Photon Technology International)公司首先商品化。此外 ,Edinburgh Instruments、 IBH、 H
8、ORIBA 等公司也在生产基于 TCSPC 的时间分辨荧光光谱仪。TCSPC的工作原理如图 1 所示 ,光源发出的脉冲光引起起始光电倍增管产生电信号 ,该信号通过恒分信号甄别器 1 启动时辐转换器工作 ,时幅转换器产生一个随时间线性增长的电压信号。另外 ,光源发出的脉冲光通过激发单色器到达样品池 ,样品产生的荧光信号再经过发射单色器到达终止光电倍增管 ,由此产生的电信号经由恒分信号甄别器 2 到达时幅转换器并使其停止工作。这时时幅转换器根据累积电压输出一个数字信号并在多道分析仪 (Multichannel Analyzer) 的相应时间通道计入一个信号 ,表明检测到寿命为该时间的一个光子。几十
9、万次重复以后 ,不同的时间通道累积下来的光子数目不同。以光子数对时间作图可得到如图 2 所示直方图 ,此图经过平滑处理得到荧光衰减曲线。图 1 单光子计数 ( TCSPC)测定荧光寿命工作原理图图 2 单光子计数荧光衰减曲线形成示意图实际测定中 ,必须调节样品的荧光强度 ,确保每次激发后最多只有一个荧光光子到达终止光电倍增管。假若一次激发引起的是多个荧光光子信号 ,则最先到达光电倍增管的 (寿命短的 ) 光子引起时幅转换器停止 ,而长寿命的光子不被检测 ,这样实际得到的荧光衰减曲线将向短寿命一方偏移 ,这种现象被称之为“堆积”效应 (Pileup Effect) 6 ,7 。为了避免堆积效应
10、,实际测定时 ,多道分析仪存储的光子数大致只有光源脉冲数的 1 %。也就是说 ,光源 100 次脉冲 ,大约只有 1 次所引发的荧光被检测。如果在预设时间内没有荧光信号到达终止光电倍增管 ,则时幅转换器自动回复到零 ,不输出信号。TCSPC法的突出优点在于灵敏度高、测定结果准确、系统误差小 ,是目前最流行的荧光寿命测定方法。但是这种方法所用仪器结构复杂、价格昂贵、而且测定速度慢 ,无法满足某些特殊体系荧光寿命测定的要求。236 化学通报 2001 年 第 10 期 http :PPwww. chemistrymag. org 1995-2003 Tsinghua Tongfang Optica
11、l Disc Co., Ltd. All rights reserved.112 相调制技术 8 相调制技术也称之为“频域法” ( Frequency2Domain Method) 。相调制与 TCSPC 不同之处在于样品被正弦调制的激发光激发 ,发射光是激发光的受迫响应 ,因此发射光和激发光有着相同的圆频率( ) ,但是由于激发态的微小时间停滞 荧光寿命 ,调制发射波在相上滞后激发波一个相角 tk ) (8)其中 I ( t - tk )为相应于 函数脉冲数激发的响应函数 , Nk ( t)为 I ( t - tk )与仪器响应函数 L ( tk )的卷积 。实验测定荧光衰减函数 N ( t
12、k )可看作是一系列 Nk ( t)的加和 。N ( tk ) = t = tkt = 0L ( tk ) I ( t - tk ) t (9)当 t 足够小时 ,可将上式写作为积分形式N ( t) =t0L ( t ) I ( t - t ) d t (10)此式表明 :实验中在时间 t 所测到的荧光强度可以表示为在此之前所有 函数所引发的荧光的总和 。以 t = t - 对上式进行变量代换 ,得到下式 。N ( t) =t0L ( t - ) I ( ) d (11)由此可见荧光衰减的数据处理实际上就是设法找出脉冲响应函数 I ( ) 。214 数据分析数据分析的目的在于 ,通过拟合实验所
13、得荧光衰减曲线 ,建立一种最能揭示荧光衰减本质、描述衰减过程的理论模型 ,从而对所研究体系作出深刻的理解。随着时间分辨荧光技术日益发展 ,人们相继提出了多种荧光衰减数据分析方法。例如 :非线性最小二乘法 14 、矩法 15 、 Laplace 变换法 16 、最大熵法 17 以及正弦变换法 18 等。限于篇幅 ,本文仅介绍普遍使用的非线性最小二乘法。以一个适当的数学表达式为模型描述所要分析的数据 ,通过变换模型中的有关参量使计算衰减曲线 Nc ( tk )与实验测定衰减曲线 N ( tk ) 尽可能吻合 ,拟合好坏与拟合优度 (goodness2of2fit) 参数( ) 2 大小密切相关 。
14、 2 = nk = 11 k 2 N ( tk ) - Nc ( tk ) 2 = nk = 1 N ( tk ) - Nc ( tk ) 2N ( tk ) (12)式中 n 为实验数据组数或多道分析仪开通的通道数 , k 为第 k 个数据点的标准偏差 。 根据 Poisson分布 ,每一个通道数据的标准偏差应该是其中所记录光子数的均方根 ,即 k = N ( tk ) 1P2 。也就是说一个通道对拟合优度参数的贡献为 1。因此 ,一组高质量荧光衰减实验数据的拟合优度参数 2应接近于实验数据组数 。如果选用多指数函数为模型函数 ,则拟合过程中需要通过改变参量 i 和 i 使 2 最小 (参见
15、方程 9) 。 具体讲就是以 Gauss2Newton 或其它算法改变 i 和 i 两个参量 ,得到假定衰减函数 I ( t) ,然后将其与仪器响应函数卷积 ,卷积结果与实验测定 N ( tk ) 进行比较 ,直到两者之差最小 ,这一过程称之为解卷积 。为了便于判断拟合好坏 ,通常用下式折合拟合优度参数 2 。 R2 = 2n - p = 2 (13)式中 n 为实验所用 MCA 通道数 (或实验数据组数 ) , p 为模型式中的变量数 , 为自由度数 。显然 ,好的拟合结果相对拟合优度参数 R2 应接近 1。实际工作中 ,应当注意将数学拟合与直觉观察结合起来 ,也就是说 ,除了 R2 应尽可
16、能接近 1 外 ,各数据点的标准偏差应沿零轴呈均衡分布 (参见图536http :PPchina. chemistrymag. org 化学通报 2001 年 第 10 期 1995-2003 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.4) ,另外也要防止将简单过程复杂化 ,能用简单函数拟合的决不可以用复杂函数拟合 。3 荧光寿命测定的应用荧光技术分为静态荧光技术和时间分辨荧光技术 。静态荧光技术固然重要 ,但是静态技术给出的只是平均化结果 ,平均化过程丢掉了有关分子运动的动态信息。例如在蛋白质或合成高分子研究中
17、,不管实际荧光各向异性衰减多么复杂 ,静态荧光各向异性测定总是假定体系荧光各向异性衰减是单指数的 ,而实际上大多数大分子体系荧光各向异性衰减都是多指数衰减 ,这样就掩盖了实际体系的复杂性 ,丢掉了实际体系中荧光物种所处环境的差异性等信息。通过研究大分子体系荧光各向异性的实际衰减曲线可以得到有关大分子构象和链段柔性大小的信息 19 。同样荧光强度衰减曲线也包含着十分有用的信息。例如生物大分子和合成高分子在溶液中往往具有多种不同的构象 ,因此相应的荧光衰减应该表现为多指数衰减形式。用时间分辨荧光各向异性研究供体和受体间的能量转移时 ,不仅可以得到能量转移效率 ,而且可以揭示受体在供体周围的分布形式
18、。利用时间分辨荧光技术可以揭示荧光猝灭是自由扩散控制还是特异性结合控制。实际上许多分子间或分子内的弱相互作用信息 ,特别是动态信息 ,只有通过时间分辨荧光技术才能得到。例如表面活性剂类两性分子在溶液或界面上的组装、纳米材料在储存过程中的相互聚集、蛋白质或其它大分子在固液界面吸附过程中的构象调整、大分子与大分子 ,大分子与小分子 ,大分子与金属离子等相互作用所引起的大分子构象变化以及这种变化发生的程度和部位等重要问题都有可能通过时间分辨荧光技术进行深入研究。此外 ,近年来时间分辨 (荧光 ) 成像 ( Time2Resolved Imaging) 技术 20 在临床检验上也获得了越来越广泛的应用
19、。生物芯片技术的一个重要内容就是利用芯片上荧光标记物与待测液中底物的特异性作用实现对待测物的高效检测。我们相信随着时间分辨荧光光谱仪的日渐普及和我国合肥同步辐射加速器分时光谱站使用效率的逐渐提高以及北京和上海同步辐射加速器分时光谱站的建立 ,时间分辨荧光技术必将会在未来的研究中发挥越来越重要的作用。参 考 文 献 1 Yekta A , Xu B , Duhamel J et al. Macromolecules ,1995 ,28 :956 966. 2 Char K, Frank C W , Gust A P. Langmuir ,1989 ,5 :1096 1105. 3 Cai K,
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