1、 脂质氧化 (MDA)检测试剂盒 产品编号 产品名称 包装 S0131 脂质氧化 (MDA)检测试剂盒 100次 产品简介： 碧云天的 脂质氧化 (MDA)检测试剂盒 (Lipid Peroxidation MDA Assay Kit)采用一种基于 MDA和硫代巴比妥酸 (thiobarbituric acid, TBA)反应产生红色产物 的显色反应 ， 随后 通过比色法 用于对血浆、血清、尿液、 动植物 组织 或细胞裂解液中 MDA进行 定量 检测 ， 广泛用 于 脂质氧化 (lipid peroxidation) 水平检测 的 试剂盒。 丙 二醛 (Malondialdehyde, MDA
2、)是 一种生物体脂质氧化的天然产物 。 动物或植物细胞发生氧化应激 (oxidative stress)时，会发生 脂质氧化 。一些脂肪酸氧化后逐渐分解为一系列复杂的化合物，其中包括 MDA。此时通过检测 MDA的水平即可检测脂质氧化的水平 ，因此 MDA的测定被广泛用作脂质氧化的指标。生物体内的一些其它生化反应也会产生 MDA，例如thromboxane synthase也可以催化产生，但只要在测定时设置适当对照即可观察到脂质氧化水平的变化。 丙二醛在 较高温度 及酸性环境 中 可与 TBA发生反应 ，形成红色 的 MDA-TBA加合物，相应的反应原理图如下： MDA TBA MDA-TBA
3、 Adduct MDA-TBA加合物在 535nm处有最大吸收，据此可以通过比色法进行检测。另外， MDA-TBA加合物也可以在 535nm被激发产生最大发射波长 553nm，据此也可以进行荧 光检测。 特点： 本试剂盒中采用了特殊的抗氧化剂，可以有效地抑制样品在检测过程中 产生 新的 MDA，使检测更加准确。 同时本检测试剂盒在检测过程中可以把部分 MDA天然形成的聚丙二醛分解成 MDA，使对脂质氧化的测定更加准确。 本试剂盒可以检测低达 1M的 MDA。 血 浆 、血清样品中的 MDA含量通常在约 2-4M， 尿液中的 MDA含量通常在约 5-30M， 在本试剂盒的检测范围内，可以直接用本
4、试剂盒检测 血 浆 、血清 、尿液 样品等。 本 试剂盒 共 可进行 100次检测。 包装清单： 产品编号 产品名称 包装 S0131-1 TBA 25mg S0131-2 TBA配制液 5ml S0131-3 TBA稀释液 15ml S0131-4 抗氧化剂 300l S0131-5 标准品 (1mM) 200l 说明书 1份 保存条件： -20 保存 ， 一年 有效。 S0131-1 TBA和 S0131-4 抗氧化剂 需避光保存。 S0131-1 TBA、 S0131-2 TBA配制液 和 S0131-3 TBA稀释液 可室温或 4 存放 三个月。 注意事项： 醛、 较高浓度的 可溶性糖
5、 (例如 250mM蔗糖 )对反应有干扰， 可溶性糖与 TBA显色反应的产物在 532nm也有吸收 (最大吸收在 450nm)。 如果可溶性糖对测定有干扰，可以通过 测定 450nm作为参考波长进行 双波长测定，消除 其干扰。 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 使用说明： 1. 样品的准备： a. 血浆、血清或尿液样品制备后可以直接用于 MDA测定。 b. 组织或细胞可以使用 PBS或碧云天的 Western及 IP细胞裂解液 (P0013)等裂解液进行匀浆或裂解 。对于组织，组织重量占匀浆液或裂解液的比例为 10%；对于细胞，每 100万细胞使用 0.1ml裂解液或匀浆液。
6、匀浆或裂解后， 1600g离心 10分钟取上清用 于后续测定。 匀浆或裂解 等样品制备步骤 宜在冰浴或 4 进行操作。 c. 对于组织或细胞样品， 样品准备完毕后可以用 BCA蛋白浓度测定试剂盒 (P0009/P0010/P0010S/P0011/P0012/P0012S)测定蛋白浓度 ， 以便于后续计算单位蛋白重量组织或细胞内的 MDA含量。 d. 本试剂盒对于样品中的常见 化学 成分的兼容性参考下表： 试剂类别 化学成分 是否干扰 缓冲试剂 Borate (50mM) 否 HEPES (100mM) 否 Phosphate (100mM) 否 Tris (25mM) 否 去垢剂 CHAPS
7、 (1%) 否 Triton X-100 (1%) 否 Tween 20 (1%) 否 抑制剂 /螯合剂 Antipain (100g/ml) 否 Chymostatin (10g/ml) 否 Leupeptin (10g/ml) 否 PMSF (200M) 否 Trypsin (10g/ml) 否 EDTA (1mM) 否 EGTA (1mM) 否 其它试剂 Sucrose (250mM) 是 Glycerol (10%) 否 2. 试剂盒的准备工作： a. TBA储存液的配制 ： 称取适量 TBA，用 TBA配制液 配制成浓度为 0.37的 TBA储存液。例如 18.5mg TBA用 5m
8、l TBA配制液配制，最终浓度即为 0.37%。 TBA配制液需完全溶解后再使用，可以加热到 70 以促进溶解。 TBA储存液 较难溶解，需加热到 70 ，并通过剧烈 Vortex以促进溶解。 配制好的 TBA储存液室温避光保存，至少 3个月内有效。 b. MDA检测工作液的配制 : 根据待测定的样品数 (含对照 )，参考下表在临检测前新鲜配制适量的 MDA检测工作液 检测次数 1次 10次 20次 50次 TBA稀释 液 150l 1500l 3000l 7500l TBA储存液 50l 500l 1000l 2500l 抗氧化剂 3l 30l 60l 150l 注意 : MDA检测工作液较
9、难溶解，可以 70 加热，并剧烈 Vortex以促进溶解。也可以通过超声处理以促进溶解。配制好的 MDA检测工作液必须当天使用。 c. 标准品的稀释： 取适量 标准品 用 蒸馏水 稀释至 1、 2、 5、 10、 20、 50M， 用于后续制作标准曲线 。 3. 样品测定 : a. 在离心管或其它适当容器内加入 0.1ml匀浆液、裂解液或 PBS等适当溶液作为空白对照，加入 0.1ml上述不同浓度标准品用于制作标准曲线，加入 0.1ml样品用于测定；随后加入 0.2ml MDA检测工作液。可参考下表设置检测反应体系： 空白对照 标准 品 样品 匀浆液、裂解液或 PBS 0.1ml 标准品 0.
10、1ml 待测样品 0.1ml MDA检测 工作液 0.2ml 0.2ml 0.2ml b. 混匀后， 100 或沸水浴加热 15分钟。加热时 务必 注意避免液体暴沸溅出。如果使 用加热块 (Heat block)进行加热注意用重物压紧离心管盖；如果使用沸水浴，则需使用可把盖子锁死的离心管 或螺旋盖 离心管 ，或用 Parafilm封住离心管口，用针头刺一小孔。 最方便和准确的加热方法是使用带有热盖并可以加热 0.5ml PCR管的 PCR仪。 c. 水浴冷却至室温， 1000g室温 离心 10分钟。取 200微升上清加入到 96孔板中，随后用酶标仪在 532nm测定吸光度。如果不方便测定 53
11、2nm的吸光度，也可以测定 530-540nm之间的吸光度。可以设定 450nm为参考波长进行双波长测定。 d. MDA含 量的计算：对于血浆、血清或尿液等样品可以直接根据标准曲线计算获得 MDA的摩尔浓度 ，对于细胞、或组织样品，计算出样品溶液中的 MDA含量后，可以通过单位重量的蛋白含量或组织重量等来表示最初样品中的 MDA含量 ，例如 mol/mg蛋白或 mol/mg组织 。 常见问题： 1. 没有检测到 MDA。 可能样品中 MDA浓度过低，在检测限之下。在检测组织或细胞的 MDA时，请注意使用更多的组织或细胞。并注意尽量不要稀释样品。 使用本产品的文献 ： 1. Qian J, Jiang F, Wang B, Yu Y, Zhang X, Yin Z, Liu C. Ophiopogonin D prevents H2O2-induced injury in primary human umbilical vein endothelial cells. J Ethnopharmacol. 2010;128(2):438-45. Epub 2010 Jan 18.
