1、油气田环境保护 技术与研究 石油污染土壤原位生物修复的强化实验研究 樊鹏军 徐建蓉 陈竹云 张帆 徐文 (西安长庆科技工程有限责任公司) 摘 要 为研究添加营养物质和高效降解石油微生物对油污土壤生物修复的作用，通过分层土柱的方法，连 续监测了不同条件下不同土层的含水率、石油烃含量、细菌数量及脱氢酶活性。结果表明：添加营养物质同时接种 高效微生物可使降解效果明显改善，降解率比在自然条件下提高近50 ，而单纯添加营养物质不接种高效微生物 可使降解率比在自然条件下提高约25 。降解初期，上层土壤降解效果较好，而到中后期，中下层降解效果好于上 层。微生物数量和脱氢酶活性与石油降解率之间存在良好的相关性
2、，脱氢酶活性比微生物数量更能反映修复过程 中微生物的存活状态。添加营养物质和高效降解石油微生物对油污土壤原位生物修复具有强化作用。 关键词 分层土柱法 石油 降解菌 土壤 生物修复 降解率 0 引 言 生物修复技术因具有运行费用低、处理彻底、无 二次污染等优点 而成为残油治理的重要技术，近年 来备受关注。微生物能够利用石油烃作为生长所需 的碳源和氢源，并在酶的催化下将其水解成甘油、脂 肪酸，最后降解为H O、CO。等代谢产物 。天然土 壤中含有丰富的微生物(土著菌群)，具有潜在的降解 石油污染物的能力。当土层未被污染时，土壤生态系 统能够维持营养物质平衡，微生物的活性不会受N、P 等营养物质的
3、限制3 。当土壤受到石油烃的污染 后，由于碳氢化合物激增，微生物大量繁殖，N、P会成 为微生物活性的重要制约因素。此外土壤中降解石 油微生物的数量、活性、油污土壤的含水率以及含氧 量等因素也会影响除油效果而成为自然净化的限制 因素。油污土层的自然净化过程往往是缓慢的，因 此，强化生物降解过程，缩小污染处理周期，加快污染 土层的修复十分必要。 1 实验材料与方法 J1实验装置 选用内径15 cin，高35 cm的PVC管作为实验容 器。向内添加30 cm高油污土壤，其中1 柱内不添 加任何物质自然降解，2 土柱添加氮磷营养盐，3 柱 内同时添加氮磷营养盐和高效石油降解菌GXI。采 用内径20 m
4、m的PVC管取样，取样后用同样的管插 入原取样部位，保证土柱内土层水平及垂直方向不发 生混乱。 12高效菌种来源及基本微生物学特征鉴定 实验所加高效石油降解菌GX1为其他研究筛选 分离驯化所得，源于本油污土壤，经鉴定为假单胞菌 属，其基本生物学特征及显微照相图片如表1和图1 所示。 表1 高效石油降解菌的形态学及生理生化特征 特征 鉴定结果 菌落颜色 菌落形态 菌体形态 革兰氏染色 淀粉水解 甲基红实验 油脂水解 柠檬酸盐利用 产吲哚实验 接触酶实验 石蕊牛奶实验 糖或醇类发酵实验 乳白色 圆形，半透明，边缘不整齐 短杆状 G一 不水解 阴性 阳性 阳性 形成吲哚 阳性 胨化 不产酸不产气 1
5、3分层土柱实验 在实验室内采用分层土柱法模拟三种状态下的 樊鹏军，2005年毕业于西安建筑科技大学给水排水专业，现在西安长庆科技工程有限责任公司从事设计及研究工作。通信地址：西安兴隆园小区 长庆大厦903室，7l 0018 技术与研究 油气田环境保护 第2O卷第3期2l 图1 焉效面显微照相示惹 生物降解过程：1 土柱不添加营养盐、不接种，模拟土 壤中自然存在的微生物(土著菌)的降解过程；2 土柱 添加营养盐，不接种，即不引人高效菌种，只依靠土著 菌在营养物质充足的条件下生长繁殖并进行降解；3 土柱添加营养盐同时接种，土著菌和高效菌共同起作 用。其中高效石油降解菌以菌悬液(浓度为2O gL)
6、方式接种，氮、磷营养盐以相应化合物的溶液一次加 入。分别于第0、7、21、45、60 d提取土样(取样时间 根据前期筛分高效菌及其降油效果研究时所得结果 确定)，检测土柱内上、中、下三层土样的各项实验指 标，包括含水率、石油烃含量、细菌总数及脱氢酶活 性。含水率采用重量法测得，土壤样品的总微生物数 量及细菌总数以牛肉膏蛋白胨为培养基37培养72 h后以MPN(最大可能数)三管法测定，石油烃含量 采用非分散红外吸收法(非分散红外测油仪测出样品 总含油量与含水率换算得出最终含油量)，脱氢酶活 性采用TF(三苯基甲月替)定量分析法l5J。 14油污土壤来源及其营养评价 对油污土壤中的N、P进行分析，
7、结果见表2。 表2石油污染土壤中氮、磷组分质量分数 项目 质量分数(gkg) 总磷 总氮 氨氮 硝氮 研究表明，土层中可生物利用氮主要为可溶性无 机氮，可生物利用磷主要为可溶性无机磷和可溶性有 机磷 。因而本土样中可生物利用氮(以氨氮和硝氮 为主，亚硝酸氮含量很少，并且很不稳定)约为015 gkg(以干土计)；可生物利用磷为00027 gkg。采 用非分散红外吸收法测得该土样中石油烃平均质量 分数为103 gkg。有研究表明 ：石油污染物的碳 氢比可认为是1：2，即每降解12 g碳，与降解14 g 残油等价。按此计算，石油污染土壤中的含碳量为 883 gkg。Carrierel8 等研究了原油
8、在土壤中泄漏 后的生物降解能力，发现当添加肥料的C：N：P一 100：5：17，并为缓慢释放形式时，效果最佳。参考 其他学者前期研究后确定最佳氮源为NH NO。，磷源 为PO ，氮磷比大约控制在4：1时 ，降解效果最 好。通过相关实验，确定微生物降解过程中最佳可生 物利用的c：N：P一100：4：1。按此比例，本土样 中1 kg干土需要可生物利用氮为035 g，可生物利 用磷为0088 g。因此根据理论计算，1 kg干土中需 要加入氮为03501502(g)，需要加入的磷为 0088000270O85(g)。 2结果与讨论 21土层的含水率 含水率是影响土层中微生物数量和活性的重要因 素。有研
9、究表明1 ，在风干土中细菌不活动，微生物不 繁殖；当土粒周围形成水膜后，切断或减少了石油烃与 土壤颗粒间的联系、吸附，另一方面细菌开始活动，离 开土粒进入水膜内，增加了微生物与石油的接触使得 油水界面扩大，微生物开始分裂繁殖，油水界面处微生 物数量最多也最活跃。但另有研究发现l】H ，土壤水 分不宜过高，否则会妨碍O 的扩散，当含水率为饱和持 水量的60 8O 时，好氧微生物的活性最高。本研 究在实验室进行，温度保持在室温下(2433 C)，实验 中各土层含水率的变化如图2所示。从图2可看出：3 个土柱上层土壤含水率均发生明显变化，在第45 d下 降了60 左右，而中、下层土壤含水率变化较为缓
10、慢， 在第45 d分别下降了1733 和1486 。第45 d以 后由于阴雨天气含水率变化微弱。 22土层中的微生物 微生物的活性是油污土层生物修复的关键指标。 目前广泛应用的表征微生物活性的指标是微生物数 量和脱氢酶活性。用微生物数量代替生物量存在较 大局限性_l ，但它能够反映生物量变化，且操作简 7 2 2 3 4 8 0 3 1 0 O O O O O O 油气田环境保护 技术与研究 单，对于指导工程实践具有重要意义。脱氢酶是微生 物体内普遍存在的组成酶，在许多情况下，微生物对 石油污染物的降解或转化均从脱氢开始，因此可以利 用脱氢酶的活性反映石油降解微生物酶的活性。实 验测得的脱氢酶
11、活性和微生物数量见图3和表3。 o lo 20 30 40 5o 60 70 时间d +1 土柱上层 -I-1 土柱中层 1 土柱下层 2 土柱上层 +2 土柱中层 +2 土柱下层 +3 土柱上层 一3 土柱中层 一一 3 土柱下层 图2各土层含水率随时闻变化规律 -i-1 士柱上层 -l-1 土柱中层 1 土柱下层 2 土柱上层 2 土柱中层 +2 土柱下层 +3 土柱 层 一3 土柱中层 一 3 土柱下层 0 1o 20 30 40 5o 60 70 时间d 图3各土层微生物活性随时闻变化规律 表3油污土壤中微生物数量随时间的变化(10 个g干土) 由图3和表3可见，不同土柱中微生物数量和
12、活 性存在很大差异，同一土柱内随着土层深度的变化，微 生物数量和活性也不尽相同，这是因为水分的蒸发和 氧气的扩散速度均随土层深度的增加而递减。而微生 物数量和活性的不同会直接导致降解效果的差异。 23各土柱降解效果比较 降解率是评价降解效果的最直接指标。于降解 的第0、7、21、45、60 d提取土样测其石油烃含量，直至 其石油烃含量不再有明显变化，计算其降解率得图4。 o 10 2O 3o 40 5o 60 70 时间d +1 土柱上层 +1 土柱中层 +1 土柱下层 2 土柱上层 +2 土柱中层 一 2 土柱下层 一3 土柱上层 +3 土柱中层 3 土柱下层 图4各土层降解效果示意 从图4
13、可看出：在降解初期(前7 d)，上层土壤降 解效果较好，结合前面有关土层含水率和微生物活性 的数据分析得知这是因为在初始湿度相差不大的情 况下，上层土壤具有良好的透气性，进而增强微生物 活性，促进了石油烃的生物降解。3 土柱在降解初期 就表现出很好的降解效果，其最高降解率为1477 ， 高于2 土柱915 的降解率。可见投加的高效石油 降解菌具有较好的适应性。而在降解的中、后期(第 76O d)，中、下层土壤降解效果明显好于上层。3 土柱后期中层油污土壤降解率为5651 ，高于上层 土壤4865 的降解率。这是由于中、下层土壤含水 率较高，促进细胞活性、加快代谢速率，从而增强降解 效果；另外较
14、大的含水量会使得土壤表面形成水膜， 减少了石油污染物与土壤颗粒的吸附，从而增加了微 生物与石油污染物的接触。微生物数量和脱氢酶活 性与石油污染物生物降解之间存在良好的相关性，但 与微生物数量相比，脱氢酶活性更能反映污染土壤生 物修复过程中微生物的活性状态。 stkJ,I-，从图4中可看出3 土柱的降解效果优于 其他两个土柱，最高降解率达565l ，高于1 (415 )和2 (3133 )土柱，分别提高了约5O 和 25 ，说明添加营养物质和高效降解菌种确实能够强 化油污土壤的生物修复能力。另外2 土柱也具有一 定的降解效果，说明所添加的营养物质能够促进土壤 中原有土著微生物的生长繁殖，对石油烃
15、的降解起到 一定作用。而1 土柱在营养物质缺乏又没有高效降 解菌存在的条件下，降解效果十分微弱。 如 如 如 o 瓣整数 5 2 9 6 3 0 。0爵*如踏 7 6 5 4 3 2 1( O 0 0 0 O O 0 一一 暑)暑曼 蜒粗 恒 一6 O 4 5 2 7 7 1 0 一 一 一 n 一 强 一 一 一 一4 4 5 粥 5 L 4 一 ，。 。 。 一 。 。 。 一 rL rL cL L r L c L L rL d一 一 吓 坤吓 坤吓 技术与研究 油气田环境保护 第2O卷第3期23 3 结 论 通过分层土柱实验，对添加营养物质和高效降解 石油微生物对油污土壤生物修复的强化作
16、用进行了 研究，得到如下结论： 添加营养盐对土壤中石油污染物的降解是必要的， 可激化油污土壤中的土著菌，提高其微生物活性，增强 修复效果，在此基础上接种驯化培养的高效石油降解 菌可使降解率进一步提高。3 土柱最终除油率比1 土 柱平均提高了将近50 ，比2 土柱大约提高了25 。 在降解初期(前7 d)，上层土壤降解效果较好，这 是因为在初始湿度相差不大的情况下，上层土壤具有 良好的透气性，进而增强微生物的活性，促进石油烃 的生物降解。而在降解的中、后期(第76O d)，中下 层土壤降解效果明显好于上层。实际中可考虑采用 翻耕、洒水调湿等方法强化修复效果。 采用生物方法修复石油污染土壤时，微生
17、物数量 及其脱氢酶活性可作为判断降解效果好坏的重要参 数，它们与降解效果之间存在良好的相关性。相比较 而言，脱氢酶活性更能真实反映污染土壤修复过程中 微生物的生存状态及其所起的作用。 E4 参考文献 1任磊，黄廷林石油污染土壤的生物修复技术_J安全 13 与环境学报，2001，1(2)：50 54 2Thomas M Walski，RBernard BigaCase study in sludge handlingAProceedings of the 1991 Specialty Conference on Environmental EngineeringC1991：667 672 E3G
18、Mattney ColeAssessment and remediation of petroleum contaminated sites rMNew York：Lewis Publjsher994：】993OO (上接第5页) 提供平衡的空气分布，降低锅炉过剩空气，富余氧 气量从4 降至25 ，减少排烟损失，提高热效率； 改善锅炉温度分布，减少了炉内的过热点，减排 55 以上的氮氧化物； 二氧化硫排放量降低50 75 。 Stephen R H，Dennis g M，Allson TCombined laboratory field study on the use of nitrate
19、for in situ bioremediation of a fuel contaminated aquiferJ Environ Sci Techno，1998，32(12)：18321840 俞毓馨，吴国庆，孟宪庭环境工程微生物检验手册 EM北京：中国环境科学出版社，1990，12 Graham D W，Smith V H，I aw K PEffects of nitrogen and phosphorous supply on hexadecane biodegradation in soil systemsAWater air and soil pollution llIC Wash
20、ington：Kluwer Academic Pulishers，1999 章卫华，李广贺，邵辉煌，等包气带土层中石油污染物的 微生物降解研究J环境科学研究，2002，15(2)：60-62 Carriere PEPEnhanced biodegradation of creosote contaminated soilJ Waste Management， 1 995： 579583 黄廷林，柴蓓蓓，宁亚平低残油土壤中高效降油菌的筛 选分离及其营养平衡D环境工程，2006，24(3)：7-9 陈华葵，李阜，陈文新，等土壤微生物学M上海：上 海科学技术出版社，1979 Edward J CPr
21、inciples and practices for petroleum contamihated soilsrM_Columbus：Lewis Publishers，1993 Eve RiserRoberts Bioremediation of petroleum contaminated sites r MNew York：Smoley C K Publishers，1992 Mahro B，Schaefer G，Kastner MPathways of microbial degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons in soilAHi
22、nchee RE，Vogal C M， Brockman F JBioremediation of Chlorinated and PAH Compound I C l New York：Battle (收稿日期 2010-0311) (编辑 袁立凡) 不仅为进一步发展预留总量空间，满足“增产不增污、 增产减污”的要求，同时降低了年排污费，具有一定的 经济效益，也是国家鼓励采用先进技术进行减排的重 要体现。 参考文献 4 结 论 12王文宗，武文江火电厂烟气脱硫及脱硝实用技术M 为满足“十一五”期间全国主要污染物二氧化硫 北京：中国水利水电出版社，2009 和COD总量减排10 的约束性指标。针对二氧化 (收稿日期20100601) 硫排放的情况，采取合理措施降低污染物排放总量， (编辑 袁立凡) l卜l 口
