利用ATP 扩增反应与生物发光法结合检测微量微生物.pdf

1、Re search Paper 研 究 报 告微 生 物 学 报 Acta Microbiologica Sinica49 (6) : 826 - 830 ; 4 June 2009ISSN 0001 - 6209 ; CN 11 - 1995PQhttp :PPjournals. im. ac. cnPactamicrocn基 金 项 目 :国 家 自 然 科 学 基 金 (30470454) ;日 本 日 立 中 央 研 究 所 资 助3 通 信 作 者 。 TelPFax : + 86225284514223 ; E2mail : ghzhou nju. edu. cn作 者 简 介 :

2、陈 颖 (1983 - ) ,女 ,湖 北 省 钟 祥 人 ,硕 士 ,主 要 从 事 功 能 蛋 白 质 的 表 达 及 应 用 研 究 。 E2mail : chensiyu1123 1631com收 稿 日 期 :2008211222 ;修 回 日 期 :2009202219利 用 ATP 扩 增 反 应 与 生 物 发 光 法 结 合 检 测 微 量 微 生 物陈 颖 1 ,邹 秉 杰 1 ,2 ,朱 术 会 1 ,马 寅 姣 1 ,周 国 华 1 ,2 ,3 3(1 中 国 药 科 大 学 生 命 科 学 与 技 术 学 院 ,南 京 210009)(2 华 东 医 学 生 物 技

3、术 研 究 所 ,南 京 210002)(3 南 京 大 学 医 学 院 ,南 京 210093)摘 要 :【 目 的 】 腺 苷 酸 激 酶 (adenylate kinase , ADK) 和 多 聚 磷 酸 盐 激 酶 (polyphosphate kinase , PPK) 偶 联 催 化 的ATP 扩 增 反 应 结 合 生 物 发 光 检 测 法 能 够 对 微 量 微 生 物 进 行 检 测 。 但 是 PPK当 中 结 合 的 内 源 性 的 ADP 会 产生 背 景 干 扰 ,影 响 测 定 。 本 文 旨 在 融 合 表 达 ADK和 PPK,并 建 立 一 种 方 便 有

4、 效 的 内 源 性 ADP 的 去 除 方 法 ,降低 背 景 ,使 之 与 传 统 生 物 发 光 法 结 合 ,实 现 高 灵 敏 生 物 发 光 法 检 测 微 量 ATP 及 微 生 物 。 【 方 法 】 PCR 扩 增 得到 PPK、 ADK基 因 ,插 入 表 达 载 体 pET28a ( + )中 构 建 重 组 表 达 质 粒 pET28a ( + )2PPKADK,表 达 PPK2ADK融合 蛋 白 。 利 用 表 面 包 裹 聚 胺 醇 ( Polyurethane) 的 磁 珠 (magnetic beads) ,通 过 化 学 反 应 将 腺 苷 酸 双 磷 酸 酶

5、(apyrase)固 定 于 磁 珠 表 面 ,制 备 固 相 腺 苷 酸 双 磷 酸 酶 (Beads2apyrase) ,用 于 除 去 与 融 合 蛋 白 结 合 的 内 源 性ADP ,降 低 ATP 扩 增 反 应 的 背 景 ,从 而 使 之 与 生 物 发 光 反 应 相 结 合 ,测 定 微 量 外 源 ATP 及 细 菌 菌 落 数 。 【 结果 】 表 达 的 融 合 蛋 白 具 有 PPK和 ADK的 活 性 ,利 用 Beads2apyrase 可 以 方 便 而 有 效 的 去 除 内 源 性 ADP ,显 著 地降 低 反 应 背 景 ,从 而 实 现 了 利 用

6、ATP 扩 增 反 应 与 传 统 生 物 发 光 反 应 结 合 ,测 定 了 小 于 1 fmol 的 外 源 微 量ATP ,使 生 物 发 光 法 检 测 ATP 及 微 生 物 的 灵 敏 度 提 高 至 少 100 倍 。 【 结 论 】 利 用 Beads2apyrase 能 够 方 便 、 有 效地 降 低 PPK2ADK中 的 ADP 背 景 ,从 而 使 PPK2ADK催 化 的 ATP 扩 增 反 应 能 够 与 传 统 生 物 发 光 法 相 结 合 ,极 大地 提 高 了 生 物 发 光 法 的 灵 敏 度 。关 键 词 : ATP 扩 增 反 应 ;腺 苷 酸 激

7、酶 ;多 聚 磷 酸 盐 激 酶 ;生 物 发 光 检 测中 图 分 类 号 : Q9313 文 献 标 识 码 :A 文 章 编 号 :000126209 (2009) 0620826205目 前 ,利 用 生 物 发 光 法 检 测 ATP1 已 应 用 于 许多 方 面 ,尤 其 在 食 品 卫 生 监 控 中 ,利 用 生 物 发 光 法 进行 微 生 物 菌 落 计 数 已 被 认 为 是 一 种 快 速 而 有 效 的 方法 2 。 但 是 传 统 的 生 物 发 光 法 不 能 检 测 低 于 10- 14mol 的 ATP ,这 种 灵 敏 度 有 时 达 不 到 卫 生 学

8、要 求 ,所以 需 要 寻 求 一 种 有 效 的 方 法 ,使 低 于 10 - 14 mol 的 微量 的 ATP 也 能 够 被 生 物 发 光 法 所 检 测 ,从 而 提 高 生物 发 光 法 的 检 测 限 和 灵 敏 度 。腺 苷 酸 激 酶 ( ADK) 3 和 多 聚 磷 酸 盐 激 酶(PPK) 4 - 6 共 同 作 用 可 以 对 ATP 进 行 扩 增 ,其 原 理如 图 1 所 示 。 1 分 子 的 ATP 被 ADK催 化 生 成 两 分子 的 ADP ,再 通 过 PPK利 用 polyP 将 两 分 子 ADP 转化 成 两 分 子 ATP ,两 分 子 A

9、TP 可 经 过 相 同 的 反 应 生成 4 分 子 ATP ,连 续 的 循 环 反 应 后 ,即 可 像 PCR 一 样完 成 对 ATP 的 指 数 扩 增 7 - 9 。 将 该 反 应 与 传 统 的 生物 发 光 反 应 相 结 合 ,就 能 够 实 现 原 本 利 用 生 物 发 光法 无 法 测 定 的 微 量 ATP 的 检 测 。但 是 ,制 备 的 PPK往 往 会 紧 密 结 合 少 量 的 底 物ADP ,当 polyP 存 在 时 ,不 加 外 源 ATP ,这 些 内 源 性 的ADP 也 会 引 发 ATP 扩 增 反 应 ,从 而 带 来 很 高 的 背图

10、1 ATP扩 增 原 理 图Fig. 1 The principle of ATP Amplification.景 ,限 制 了 该 反 应 的 实 际 应 用 。 为 了 应 用 此 方 法 结合 生 物 发 光 反 应 检 测 微 量 的 外 源 ATP ,就 必 需 除 去 与PPK结 合 的 ADP。 Satoh 等 采 用 大 量 的 腺 苷 酸 双 磷 酸酶 (apyrase)处 理 带 有 His 标 签 的 融 合 蛋 白 PPK2ADK,利 用 apyrase 来 降 解 去 除 内 源 性 ADP ,再 通 过 镍 亲 和层 析 除 去 加 入 的 apyrase7 。 这

11、 种 降 低 背 景 的 方 法 不但 操 作 十 分 繁 琐 ,而 且 处 理 过 程 消 耗 的 大 量 apyrase也 难 以 再 利 用 ,使 得 制 备 PPK2ADK的 成 本 很 高 。本 文 以 pET28a ( + )作 为 表 达 载 体 ,构 建 重 组 质粒 pET28a ( + )2PPKADK,并 在 大 肠 杆 菌 中 表 达 融 合蛋 白 PPK2ADK。 为 去 除 内 源 性 ADP ,将 apyrase 与 磁性 微 球 (magnetic beads) 相 结 合 ,制 备 固 相 腺 苷 酸 双磷 酸 酶 (Beads2apyrase) ,利 用 B

12、eads2apyrase 处 理 制 备的 PPK2ADK后 ,无 需 复 杂 的 层 析 过 程 ,只 要 用 磁 铁吸 引 ,就 能 将 apyrase 与 PPK2ADK分 离 ,并 且 Beads2apyrase 可 以 回 收 利 用 ,极 大 地 降 低 了 实 验 成 本 。 经过 Beads2apyrase 处 理 的 融 合 蛋 白 可 以 有 效 扩 增 微 量的 外 源 ATP ,与 生 物 发 光 测 定 法 结 合 ,将 生 物 发 光 法测 定 大 肠 杆 菌 菌 落 数 的 灵 敏 度 提 高 了 100 倍 。1 材 料 和 方 法111 材 料11111 质

13、粒 与 菌 株 :宿 主 菌 大 肠 杆 菌 ( Escherichiacoli) BL21 (DE3) 及 原 核 表 达 质 粒 pET28a ( + ) 购 自Novagen 公 司 。 大 肠 杆 菌 标 准 株 CMCC (B) 44102 为本 实 验 室 保 存 。11112 试 剂 :限 制 性 内 切 酶 、 Taq DNA 聚 合 酶 、 T4DNA 连 接 酶 、 蛋 白 Marker、 PCR 产 物 纯 化 试 剂 盒 购 自Takara 公 司 ;d2虫 荧 光 素 ,荧 光 素 酶 购 自 Promega 公司 ;AMP、 polyP (average chain

14、2length : 65) 、 Apyrase 购自 Sigma 公 司 ; Dynabeads M2280 Tosylactivated 购 自Invitrogen 公 司 ; His Bind Resin 和 His Bind Columns购 自 Novagen 公 司 ;其 他 试 剂 均 为 国 产 分 析 纯 。11113 引 物 :根 据 文 献 报 道 的 大 肠 杆 菌 PPK、 ADK基 因 序 列 和 载 体 pET28a ( + ) 多 克 隆 位 点 ,设 计 引物 ,如 表 1 所 示 :表 1 引 物Table 1 PrimerPrimer Sequence (5

15、 3 ) SizePbp Restriction sitePPK2P1 GTGTGTCATATGATGGGTCAGGAAAAGCTATA 32 Nde PPK2P2 GTGTGTGGATCCTTCAGGTTGTTCGAGTGATT 32 BamH ADK2P1 GTGTGTGGATCCATG CGTATCATTCTGCTTGG 32 BamH ADK2P2 GTGTGTAAGCTTTTAGCCGAGGATTTTTTCCA 32 Hind 112 融 合 蛋 白 PPK2AD K的 制 备以 大 肠 杆 菌 基 因 组 DNA 为 模 板 ,利 用 PCR 扩 增PPK、 ADK基 因 ,插 入

16、 质 粒 pET28a ( + ) 中 ,构 建 重 组质 粒 pET28a ( + )2ADK。 PPK扩 增 产 物 插 入 重 组 质粒 pET28a ( + )2ADK中 ,构 建 重 组 表 达 质 粒 pET28a( + )2PPKADK。将 重 组 菌 进 行 诱 导 表 达 ,分 别 于 0 h、 1 h、 3 h、5 h收 集 1 mL 菌 液 ,离 心 收 集 菌 体 ,SDS2PAGE(12 %)分 析 外 源 蛋 白 表 达 情 况 。 收 集 诱 导 表 达 5 h 的 菌体 ,超 声 破 碎 后 ,收 集 上 清 ,进 行 SDS2PAGE(12 %) 电泳 。 采

17、 用 镍 亲 和 层 析 系 统 进 行 纯 化 ,具 体 操 作 步 骤参 照 Novagen 公 司 操 作 手 册 进 行 。 将 洗 脱 液 用 截 留分 子 量 为 10000 的 超 滤 膜 进 行 超 滤 除 盐 ,所 得 产 品进 行 SDS2PAGE(12 %)分 析 其 纯 度 。113 融 合 蛋 白 内 源 性 ADP的 去 除首 先 制 备 Beads2apyrase (磁 珠 固 定 的 双 磷 酸 酶 ,能 够 降 解 ATP 并 能 通 过 磁 铁 吸 引 从 溶 液 中 去 除 ) ,制 备 方 法 参 见 Dynabeads M2280 Tosylactiv

18、ated(Invitrogen) 说 明 书 。 取 3 g 融 合 蛋 白 与 1 molpolyP 在 37 条 件 下 孵 育 10 min 后 ,加 入 1 LBeads2apyrase 继 续 孵 育 10 min ,在 磁 铁 的 作 用 下 ,Beads2apyrase 可 以 从 溶 液 中 回 收 并 重 复 利 用 ,经 过Beads2apyrase 处 理 的 酶 去 掉 了 内 源 性 的 ADP 可 以 用来 检 测 外 源 微 量 的 ATP。114 外 源 微 量 ATP的 扩 增 反 应微 量 ATP 扩 增 反 应 使 用 的 反 应 液 组 成 为 :10

19、molPL AMP , 400 molPL PolyP , 8 mmolPL MgCl2 ,60mmolPL Tris2HCl ,013 g PPK2ADK,pH 714。 反 应时 ,向 49 L 反 应 液 中 加 入 1 L ATP(终 浓 度 分 别 为728陈 颖 等 : 利 用 ATP扩 增 反 应 与 生 物 发 光 法 结 合 检 测 微 量 微 生 物 .P微 生 物 学 报 (2009) 49 (6)2 10 - 10 molPL、 2 10 - 9 molPL、 2 10 - 8 molPL) ,37 温 浴 ,每 反 应 一 段 时 间 从 中 取 出 1 L 加 入

20、到 10 L生 物 发 光 反 应 液 中 测 定 荧 光 信 号 ,同 时 以 不 加 ATP的 反 应 液 作 为 对 照 ,以 发 光 信 号 对 时 间 作 图 得 到 微量 ATP 的 放 大 曲 线 。 生 物 发 光 反 应 液 组 成 :011 molPL Tris2Ac (pH 7175) , 015 mmolPL EDTA , 5mmolPL Mg ( Ac ) 2 , 014 mgPmL PVP , 0102 % BSA , 1mmolPL DTT ,014 mmolPL d2虫 荧 光 素 ,1146 gPmL 荧光 素 酶 。115 融 合 蛋 白 PPK2AD K用

21、 于 检 测 大 肠 杆 菌 菌 落数将 培 养 24 h 的 大 肠 杆 菌 标 准 株 用 灭 菌 019 %的生 理 盐 水 梯 度 稀 释 ,取 50 L 稀 释 菌 液 加 入 50 L 细胞 裂 解 液 ,100 加 热 2 min 让 细 胞 内 ATP 充 分 释放 ,取 2 L 处 理 的 样 品 加 入 到 48 L ATP 扩 增 体 系中 反 应 ,每 隔 10 min 测 定 荧 光 信 号 ,与 不 经 过 扩 增反 应 所 产 生 的 荧 光 信 号 做 对 比 。 样 品 中 的 菌 落 数 通过 平 板 计 数 法 获 得 。图 2 融 合 蛋 白 PPKAD

22、 K的 表 达 及 纯 化 的 SDS2PAGE分析Fig. 2 SDS2PAGE analysis of the PPD2ADK expression and purificationM: Protein marker ; Lane 1 : Total protein of E. coli BL ( DE3 )transformed with pET28a ( + )2PPKADKwithout IPTGinduction ;Lane 2 4 : Total protein of E. coli BL (DE3) transformed with pET28a ( + )2PPKADK af

23、ter being induced with IPTG of 1 h , 3 h , and 5 h ,respectively ;Lane 5 : Supernatant of the lysate of E. coli BL21 (DE3)transformed with pET28a ( + )2PPKADK;Lane 6 : Purified recombinantPPK2ADK.2 结 果211 融 合 蛋 白 PPK2AD K的 制 备SDS2PAGE分 析 诱 导 表 达 0、 1、 3、 5 h 的 菌 体 总蛋 白 及 表 达 5 h 的 上 清 ,从 图 2 中 可 以 看

24、 出 ,重 组 菌表 达 了 分 子 量 约 为 101 kDa 的 融 合 蛋 白 PPK2ADK,且 部 分 是 以 可 溶 形 式 表 达 的 。 将 细 胞 破 碎 液 上 清 采用 镍 亲 和 层 析 纯 化 ,首 先 用 60 mmolPL 咪 唑 的 洗 脱缓 冲 液 洗 脱 杂 蛋 白 ,再 用 300 mmolPL 咪 唑 的 洗 脱 缓冲 液 洗 脱 目 的 蛋 白 ,洗 脱 液 用 超 滤 膜 进 行 超 滤 除 盐 ,SDS2PAGE分 析 纯 化 的 融 合 蛋 白 ,结 果 显 示 ,纯 化 得到 的 融 合 蛋 白 基 本 达 到 电 泳 纯 。212 融 合 蛋

25、 白 内 源 性 ADP的 去 除由 于 内 源 性 ADP 与 PPK紧 密 结 合 在 一 起 ,在 处理 PPK2ADK时 必 须 加 入 polyP ,使 内 源 性 的 ADP 转化 为 ATP 后 从 蛋 白 上 释 放 出 来 ,释 放 出 来 的 ATP 被Beads2apyrase 所 降 解 ,转 化 为 AMP ,从 而 降 低 背 景 干扰 。 从 图 3 可 以 看 出 ,没 有 经 过 Beads2apyrase 处 理的 PPK2ADK,在 不 加 入 外 源 ATP 的 情 况 下 ,由 于PPK含 有 内 源 性 的 ADP 污 染 ,在 polyP 存 在

26、条 件 下 ,内 源 性 的 ADP 被 转 化 成 为 ATP ,进 而 能 够 发 生 ATP扩 增 反 应 ,产 生 较 强 的 背 景 信 号 (图 中 的 所示 ) 。 但 经 过 Beads2apyrase 处 理 的 PPK2ADK,由 于 内源 性 的 ADP 已 经 被 降 解 ,在 不 加 入 外 源 ATP 的 情 况下 ,就 不 会 产 生 渐 渐 增 强 的 背 景 信 号 (图 中 的 所 示 ) ,从 而 使 测 定 微 量 外 源 ATP 成 为 可 能 。图 3 融 合 蛋 白 内 源 性 ADP的 去 除Fig. 3 Removal of endogenou

27、s ADP from PPK2ADK by Beads2apyrasetreatment. Before and after Beads2apyrase treatment ,013 g of PPK2ADKwas added to a reaction mixture containing 10 molPL AMP ,400 molPLPolyP, 8 mmolPL MgCl2 , 60mmolPL Tris2HCl (pH 714) . 1 L of thereaction mixture was sampled and detected by BPCL luminometer.213 微

28、 量 外 源 性 ATP的 扩 增 反 应为 了 验 证 本 文 表 达 的 并 经 Beads2apyrase 处 理 的PPK2ADK对 微 量 外 源 性 ATP 扩 增 反 应 的 效 果 ,在PPK2ADK扩 增 反 应 体 系 中 分 别 加 入 不 同 量 的 ATP ,在 反 应 前 及 反 应 进 行 到 不 同 时 间 点 取 出 1 L 反 应液 ,加 入 到 荧 光 素 酶 生 物 发 光 反 应 体 系 中 测 定 发 光强 度 ,结 果 如 图 4 所 示 。 不 同 量 的 外 源 ATP 均 能 够得 到 不 同 程 度 的 扩 增 ,在 反 应 的 初 始 阶

29、 段 ,由 于 ATP的 量 低 于 生 物 发 光 法 的 检 测 限 ,测 不 到 ATP 的 荧 光信 号 ,随 着 ATP 放 大 反 应 的 进 行 ,ATP 不 断 被 扩 增 ,使 得 荧 光 信 号 逐 渐 增 强 ,表 明 经 Beads2apyrase 处 理828 Ying Chen et al.PActa Microbiologica Sinica (2009) 49 (6)的 PPK2ADK催 化 的 ATP 扩 增 反 应 ,可 以 有 效 地 对 不同 起 始 浓 度 的 微 量 外 源 性 ATP 进 行 扩 增 。图 4 微 量 外 源 性 ATP的 扩 增

30、反 应 时 间 曲 线Fig. 4 Bioluminescence time courses of ATP amplification at differentamounts of exogenous ATP. The reaction mixture containing 10 molPLAMP ,400 molPL PolyP ,8 mmolPL MgCl2 ,60mmolPL Tris2HCl (pH 714)and 013 g Beads2apyrase treated PPK2ADK. The amount of ATP wasinitially present in the 1 L

31、 reaction mixture indicated.214 融 合 蛋 白 PPK2ADK用 于 检 测 大 肠 杆 菌 菌 落 数图 5 大 肠 杆 菌 ATP的 扩 增 反 应Fig. 5 Bioluminescence Time Courses during ATP Amplification of E.coli cells. E. coli cells were appropriately diluted. The cell suspensions(50 L) were mixed with 50 L lysis buffer and then incubated at 100 f

32、or 2 min. Heated samples (2 L) were subjected to ATP Amplification.The number of E. coli CFU that were present in the 1 L reactionmixture indicated.传 统 微 生 物 限 度 检 测 需 要 通 过 平 板 计 数 法 ,该方 法 需 要 过 夜 培 养 ,耗 时 太 多 。 生 物 发 光 法 检 测 微生 物 具 有 快 速 、 方 便 、 灵 敏 的 优 点 。 但 是 一 般 的 生 物发 光 法 难 以 检 测 低 于 10 - 14 m

33、ol 的 ATP ,这 种 灵 敏 度有 时 达 不 到 卫 生 学 要 求 。 利 用 ATP 扩 增 反 应 ,能 够测 定 一 般 的 生 物 发 光 法 难 以 检 测 到 的 ATP ,使 得 基于 生 物 发 光 的 微 生 物 限 度 检 测 法 的 灵 敏 度 也 能 得 到很 大 提 高 。 在 本 实 验 中 ,大 肠 杆 菌 破 菌 释 放 出 的ATP 经 过 扩 增 反 应 后 ,能 够 利 用 生 物 发 光 法 检 测 到很 高 的 信 号 ,如 图 5 所 示 。 与 不 经 过 扩 增 反 应 相 比较 而 言 ,生 物 发 光 法 测 定 菌 落 数 产 生

34、 的 ATP 信 号 至少 提 高 了 100 倍 ,即 更 少 的 菌 落 数 可 以 通 过 扩 增 反应 后 被 检 测 到 ,结 果 如 表 2 所 示 。表 2 生 物 发 光 法 检 测 大 肠 杆 菌 菌 落 数 经 过 ATP扩 增反 应 与 不 经 过 扩 增 反 应 的 比 较Table 2 Detection of E. coli cells by Bioluminescence Assaywith and without ATP AmplificationE. coli cells(CFU) LuminescenceP( IntensityPmV)Without ATP

35、 amplification With ATP amplificationControl (none) 3 2 48 16200 5 4 550 212000 26 9 2627 5920000 82 11 11864 356The E. coli culture was appropriately diluted with sterile 019 % isotonic Nachloride and heated to 100 for 2 min to release ATP from the cells. ATPamplification was performed for 40 min t

36、o the bioluminescence assay. Theluminescence values are the means standard deviations of separatemeasurements.215 数 据 分 析本 文 在 测 定 外 源 ATP 时 发 现 低 于 20 fmol 的ATP用 传 统 的 生 物 发 光 法 不 能 检 测 (如 图 4 中 0 时刻 所 示 ) ,而 经 过 ATP 放 大 反 应 后 ,012 fmol 的 ATP也 能 得 到 检 测 。 实 验 测 定 012 pmol ATP 所 产 生 的 荧光 信 号 的 高 度 约

37、 3000 ,将 放 大 后 各 点 的 荧 光 信 号 换算 出 各 点 所 对 应 的 ATP 的 量 ,可 以 计 算 出 ATP 的 放大 倍 数 至 少 约 100 倍 。 在 进 行 微 生 物 菌 落 测 定 时 ,仅 通 过 40 分 钟 的 放 大 ,就 能 使 原 本 利 用 普 通 生 物 发光 法 无 法 测 定 的 细 菌 得 以 测 定 。3 讨 论本 研 究 成 功 构 建 了 原 核 表 达 载 体 pET28a ( + )2PPKADK,将 该 载 体 转 化 菌 株 BL21 (DE3) 中 ,在 IPTG的 诱 导 下 高 效 表 达 了 融 合 蛋 白

38、PPK2ADK。 重 组 蛋白 带 有 His2Tag ,经 镍 亲 和 层 析 和 超 滤 离 心 后 ,蛋 白纯 度 可 达 电 泳 纯 级 别 。 在 经 过 Beads2apyrase 处 理后 ,消 除 了 内 源 性 ADP 对 ATP 扩 增 产 生 的 背 景 干扰 ,这 种 处 理 方 法 方 便 、 有 效 并 且 成 本 低 ,对 外 源 微量 ATP 的 放 大 试 验 结 果 表 明 ,原 本 利 用 生 物 发 光 法无 法 测 定 的 微 量 ATP 通 过 放 大 反 应 可 以 实 现 测 定 ,这 极 大 地 提 高 了 生 物 发 光 法 测 定 ATP

39、的 灵 敏 度 ,从而 拓 宽 了 生 物 发 光 法 在 微 生 物 检 测 中 的 应 用 范 围 。应 用 该 放 大 系 统 检 测 大 肠 杆 菌 菌 落 数 的 实 验 结 果 表明 ,采 用 ATP 扩 增 法 可 以 检 测 到 传 统 生 物 发 光 法 所检 测 不 到 的 菌 落 数 ,这 对 提 高 环 境 、 食 品 卫 生 微 生 物检 测 的 灵 敏 度 和 准 确 度 有 重 要 意 义 ,能 有 效 防 止 假阴 性 结 果 的 出 现 ,也 为 单 细 胞 甚 至 单 分 子 的 检 测 奠定 了 基 础 。928陈 颖 等 : 利 用 ATP扩 增 反 应

40、 与 生 物 发 光 法 结 合 检 测 微 量 微 生 物 .P微 生 物 学 报 (2009) 49 (6)参 考 文 献 1 DeLuca M , McElroy WD. Kinetics of the firefly luciferasecatalyzed reactions. Biochemistry , 1974 , 13 (5) : 921 -925. 2 Bautista DA , Vaillancourt JP , Clarke RA , et al. Adenosinetriphosphate bioluminescence as a method to determine

41、microbial levels in scald and chill tanks at a poultry abattoir.Poultry Science , 1994 , 73 (11) : 1673 - 1678. 3 Brune M , Schumann R , Wittinghofer F. Cloning andsequencing of the adenylate kinase gene ( adk ) ofEscherichia coli. Nucleic Acids Res , 1985 , 13 (19) : 7139- 7151. 4 Akiyama M , Crook

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46、y concomitant use of ATP amplification andbioluminescence assayYing Chen1 , Bingjie Zou1 , 2 , Shuhui Zhu1 , Yinjiao Ma1 , Guohua Zhou1 ,2 ,3 3(1 School of Life Science and Technology , China Pharmaceutical University , Nanjing 210009 , China)(2 Huadong Research Institute for Medicine and Biotechnic

47、s , Nanjing 210002 , China)(3Medical School , Nanjing University , Nangjing 210093 , China)Abstract: Objective To detect low levels of microorganism by bioluminescence assay , the reaction of ATP amplificationcatalyzed by ADK (adenylate kinase) combined with PPK (polyphosphate kinase) can be employe

48、d. However , the endogenousADP bound to PPK is a background source and interfere the effective detection of low levels of exogenous ATP. We expressed afusion protein of PPK and ADK and established a new method to decrease the background signal. Methods The genes of PPKand ADK were amplified by PCR a

49、nd cloned into vector pET28a ( + ) to provide a recombinant expression plasmid pET28a( + )2PPKADK to prepare the fusion protein. Apyrase was immobilized on the surface of magnetic beads coated with polyurethaneto provide Beads2apyrase to eliminate background caused by ADP bound to PPK2ADK. The exogenous ATP and microorganismwere also detected by using ATP amplification reaction coupled with bioluminescence assay. Result