1、 病毒感染性疾病 基金项目 :卫生部科研基金 (1385312) ,北京市自然科学基金重点项目 (7951002)作者单位 :730000 兰州医学院第一附属医院儿科 (张春芳、金玉、张又 ) ,100020 首都儿科研究所北京市感染与免疫中心实验室 (钱渊 )3通信作者 :钱渊兰州地区婴幼儿腹泻轮状病毒的分型特点张春芳 金玉 张又 钱渊 3【摘要】 目的 调查研究兰州地区婴幼儿腹泻轮状病毒的分子流行病学特点。 方法 分别用酶联免疫吸附试验 ( ELISA) 、聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE) 、逆转录 2聚合酶链反应 (RT2PCR) 三种方法对2000 年 1 2 月、 10 12 月 ,
2、2001 年 1 3 月在兰州医学院第一附属医院儿科门诊及住院部收集的 114份婴幼儿腹泻粪便标本进行轮状病毒病原检测 ,并用核酸杂交方法对轮状病毒阳性标本进行分型。结果 三种方法检测轮状病毒感染的阳性率分别为 61 %( ELISA) 、 58 % ( PAGE) 、 5818 % (RT2PCR) ,轮状病毒核酸的电泳型有长、短两种类别 ,以长型为主 (8118 %) ,偶有长、短型混合感染。流行的 G型主要为 G3 (61 %) ,其次为 G2 (2514 %) 、 G1 (1316 %) ,未见 G4 型 , 8 例未能分型。 P 型主要为 P1A(7714 %) ,其次为 P1B(2
3、216 %) ,无 P2 型。 结论 婴幼儿轮状病毒腹泻在兰州地区的流行病学特点与世界各国报道的情况相仿 ,但 2000 年 1 2 月、 10 12 月 ,2001 年 3 月期间 ,其流行的主要基因型为 G3型。本次研究结果从分子水平初步揭示了兰州地区轮状病毒的流行情况 ,为轮状病毒疫苗在该地区的应用提供了流行病学资料。【关键词】 腹泻 , 婴儿 ; 轮状病毒感染 ; 轮状病毒属 ; 基因型VP4 and VP7 typing for rotaviruses identified from stool specimens collected from infants and youngch
4、ildren with acute diarrhea in Lanzhou ZHANG Chunfang , JIN Yu , ZHANG You , QIAN Yuan 3 .Department of Pediatrics , First Affiliated Hospital , Lanzhou Medical College , Lanzhou 730000 , China【 Abstract】 Objective Rotaviruses comprising a genus within the family Reoviridae are the most importantetio
5、logical agents of severe diarrheal illness of infants and young children , and one of the major causes of childhooddeaths in developing countries. The complex and variable molecular epidemiology of rotavirus infections made itdifficult to work out an effective vaccine. Researchers in many countries
6、are studying the characteristics of rotavirusmolecular epidemiology. This study aimed to characterize the rotaviruses causing acute diarrhea in infants andyoung children in Lanzhou , Gansu province , China. Methods Stool specimens were collected from 114 infantsand young children with acute diarrhea
7、 who were seen at the Pediatric Outpatient Department and admitted into thePediatric Ward , First Hospital Affiliated to Lanzhou Medical College , from January to February and October toDecember , 2000 and January to March , 2001. Enzyme2linked immunosorbant assay ( ELISA) , polyacrylamide gelelectr
8、ophoresis ( PAGE) and reverse transcription2polymerase chain reaction ( RT2PCR) was used to detectrotaviruses from stool specimens. Dot bolt hybridization was used to determine the VP4 and VP7 encoding genesfrom the rotavirus positive specimens. Three cases who had a cross2reaction between G3 and G4
9、 in dot bolthybridization were confirmed by nested2PCR (N2PCR) . Results Out of 114 stool specimens , 70 (61 %) , 66(58 %) and 67(58. 8 %) were rotavirus positive detected by ELISA、 PAGE and RT2PCR , respectively. Most of therotaviruses detected in this study showed long RNA pattern as determined by
10、 PAGE (81. 8 %) . Only 1 case hadmixed infection with long RNA pattern and short RNA pattern. Dot blot hybridization showed that 61 % , 25. 4 %and 13. 6 % of the rotaviruses were G3 , G2 and G1 type , respectively , and 77. 4 % of the rotaviruses in this studywere P1A type. Eight cases could not be
11、classified to G12G4 types whereas no G4 and P2 type rotaviruses weredetected . The most common combination of G and P was G3P1A (57. 7 %) , and the next common one wasG2P1B (23. 1 %) , G1P1A (19. 2 %) , respectively. Conclusions Rotaviruses are the major cause of acuteinfantile diarrhea in Lanzhou ,
12、 Gansu province , China , which is similar to many regions in China and othercountries. But G3 was the most dominant type G in this area during the period of January to February and Octoberto December , 2000 and January to March , 2001. The molecular epidemiology of rotavirus in China is alsocomplex
13、 , and a continuous surveillance is necessary.【 Key words】 Diarrhed , infantile ; Rotavirus infections ; Rotavirus ; Genotype904中华儿科杂志 2002 年 7 月第 40 卷第 7 期 Chin J Pediatr , July 2002 , Vol 40 , No. 7A 组轮状病毒 (Rotavirus ,RV) 是世界范围内两岁以下婴幼儿腹泻疾病的最主要病原 1 。轮状病毒复杂、多变的分子流行病学特点给轮状病毒疫苗的研制增加了困难 ,各国都在逐步建立完善的轮状病
14、毒分子流行病学监测网络。长春、北京、湖北等地也有轮状病毒流行情况的调查报告 2 ,3 ,我们收集了2000 年 1 2 月、 10 12 月、 2001 年 1 3 月 ,兰州医学院第一附属医院儿科门诊或住院部 114 份婴幼儿腹泻粪便标本 ,用酶联免疫吸附试验 ( ELISA) 、聚丙烯酰胺凝胶电泳 ( PAGE) 、逆转录 2聚合酶链反应(RT2PCR)分别检测 A 组轮状病毒 ,并用核酸杂交的方法对阳性标本进行轮状病毒主要抗原 VP7 和 VP4编码基因分型。材料和方法本组粪便标本共 114 份 (肉眼脓血便除外 ) ,置- 70 保存备用。11 病毒抗原 ELISA 试剂盒检测 : 采
15、用卫生部兰州生物制品研究所生产的快速一步法轮状病毒抗原检测试剂盒 (由 A 组轮状病毒单克隆抗体制成 ) 直接检测粪便标本中轮状病毒抗原。按说明书操作。21 轮状病毒 RNA 的提取 : 分别用 1 %十二烷基磺酸钠 (SDS)2酚氯仿法 4 和 Trizol 从标本中提取病毒核酸。前者备 PAGE 用 ,后者备 RT2PCR 用。3. 聚丙烯酰胺凝胶电泳 ( PAGE) : 酚 2氯仿法提取病毒核酸后不需沉淀浓缩即上样进行垂直板不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳 (3 %浓缩胶 ,10 %分离胶 ) ,硝酸银染色。4.逆转录 2聚合酶链反应 (RT2PCR) : 用 RT2PCR方法分别扩增标本中轮状
16、病毒 VP7 全基因及 VP4基因型特异性片段 (112887bp) ,方法见文献 4 。引物 5 2GGCTTTAAAAGAGAGAATTTCCGTCTGG23 ( 1228bp ) 和 5 2GGTCACATCATACAATTCTAATCT2AAG23 ( 103621062bp ) 用 于 扩 增 VP7 全 基 因(1063bp) ,引物 5 2TGGCTTTCGCCATTTTATAGACA23(11232bp ) 和 5 2ATTTCGGACCATTTATAACC23 ( 8682887bp)用于扩增 VP4 基因的特异性片段 (876bp) ,所用 Taq DNA 聚合酶购自上海生
17、工生物制品公司 ,AMV 逆转录酶购自 Promega 公司 ,dNTP 购自保灵曼公司 ,X174/ Hae Marker 购自 New England Biolabs。5. 地高辛 (Digoxin ,DIG) 标记探针的制备 : VP7各基因型别探针分别从轮状病毒我 国地方株 T73、T79、 T108、 CR117 (分别为 G12G4 型 ) 基因重组质粒(克隆于 PTZ18 ,已测序 5 ) 中制备产生。选取 VP7各基因型内高度保守而不同型之间高度变异的片段为目的片段 ,5端引物同用于 PCR 法分型的各型引物 4 , 3端引物用公用末端引物 RVG9 ( 104421063bp
18、) , PCR 扩增 cDNA 时掺入地高辛标记的dNTP。 VP4 各基因型探针分别以我国地方株 T65(P1A) 、 R50 ( P1B) 、 N16 ( P2) 基因重组质粒 (克隆于PTZ18 ,已测序 6 )中制备产生。选取 VP4 各基因型别间的高可变区 2052658bp 为目的片段 ,5端引物为P3(2052221bp) ,3端引物为 P4 (6402658bp) , PCR 扩增 cDNA 时掺入地高辛标记的 dNTP。各引物的核甘酸序列及探针长度见表 1。6. 核酸杂交确定 VP7、 VP4 基因型别 : 采用打点杂交对所有 RT2PCR 阳性标本分型。将标本中RT2PCR
19、 阳性的产物点膜 (硝酸纤维素膜 ) ,经碱变性、预杂交 ,然后加入探针 ,42 杂交过夜 ,用保灵曼公司地高辛检测试剂盒检测。每批杂交设阳性克隆和单纯质粒作为阳性和阴性对照。表 1 制备 VP7、 VP4 地高辛标记探针的引物及探针长度引物 型别 位置 序 列 长 度RVG9 G( - ) 104421062 GGTCACATCATACAATTCT 9aBT1 G1( + ) 3142335 CAAGTACTCAAATCAATGATGGG 749aCT2 G2( + ) 4112415 CAATGATATTAACACATTTTCTGTG 652aET3 G3( + ) 4892709 CGT
20、TTGAAGAAGTTGCAACAG 574aDT4 G4( + ) 4802498 CGTTTCTGGTGAGGAGTTG 583P3 P( + ) 2052221 GATGGTCCTTATCAACC 454P4 P( - ) 6402658 CATTACACTTAGATTCTTG结 果11ELISA、 PAGE 和 RT2PCR 的检测结果 :用三种方法分别检测 114 份粪便标本中的轮状病毒 ,共检出阳性标本 81 例 ,阳性率为 7111 %。其中 ELISA 阳性 70 例 ,阳性率为 61 % ;PAGE阳性 66 例 ,阳性率为58 % ;RT2PCR 阳性 67 例 ,阳性率为
21、 5818 %。三种方法均为阳性的标本 55 例 ,占总样本的 48 %。 PAGE对 RT2PCR 的符合率为 80 % ,ELISA 阳性而 PAGE 阴性者 11 例 ,占 1114 % ,PAGE 阳性而 ELISA 阴性者 8例占 813 %。发病年龄主要是 7 24 个月的婴幼儿 ,发病高峰季节在每年 11 月份。2. A 组轮状病毒的电泳型 : 所检测的阳性样品中长型 54 例 ,占 8118 % ;短型 11 例 ,占 1617 % ;混合型 1 例 ,占 115 % ;长和短型混合感染 (图 1) 。未见其他组 (B 或 C组 )电泳型。3.地高辛标记探针的特异性 : VP7
22、 各基因型的014 中华儿科杂志 2002 年 7 月第 40 卷第 7 期 Chin J Pediatr , July 2002 , Vol 40 , No. 7探针制备后分别与 G12G4 型基因的质粒杂交 ,显示G1、 G2 型探针只和同型质粒发生反应 ,而不和其他型别的质粒发生反应 ; G3、 G4 型探针和同型质粒间杂交反应最强 ,但二者之间有轻度交叉反应 ,提高杂交条件 ,杂交液中加入 50 %甲酰胺 ,提高预杂交温度至 45 ,加抗地高辛抗体前用 10 % blocking 液封闭 2 小时 ,结果明显改善 ,各型间无交叉反应。4.杂交分型结果 : 67 例 VP7 RT2PCR
23、 阳性标本中 ,杂交阳性标本共 59 份 ,其中 G3 型 36 例 ,占6110 % ; G2 型 15 例 ,占 2514 % ; G1 型 8 例 ,占 1316 %(图 2) 。 3 例 G3、 G4 间有轻度交叉反应 (与 G3 型探针反应强 ,与 G4 型探针反应较弱 ) 的标本和随机抽取的 3 份无交叉反应的 G3 型标本一起再用 PCR 方法分型 ,以 RT2PCR 产物为模板 ,以 aET3、 aDT4 (分别为 G3 和 G4 型特异性引物 4 ) 为 5端引物 ,RVG9 为3端引物 ,各标本扩增结果显示只有一条分子量大小与 G3 型特异性片段相符的条带 ,证实这 3 例
24、标本确为 G3 型 (图 3) 。有 8 例标本未能分型。 VP4 PCR阳性标本中 ,杂交阳性率 100 % ,以 P1A 为主 ,共 28例 ,占 7714 % ;P1B 8 例 ,占 2216 %(图 4) 。最多见的血清型组合是 G3P1A ,共 15 例 ,占 5717 % ;其次是G2P1B , 共 6 例 ,占 2311 % ; G1P1A 5 例 , 占 1912 %。11 例电泳型为短型的标本中 ,除 1 例不是 G2型 (为 G3 型 ) ,其余皆为 G2 型 ,与文献报道短型主要为 G2 型相一致 ,长型的电泳型则包括 G2 型以外的其他类型。 1 例混合型电泳型的标本
25、(LZ87) 经杂交和 PCR 两种方法分型 ,结果都为 G3 型。讨 论1. 轮状病毒的基因编码及分型 : 轮状病毒结构蛋白 VP4 (由第 4 基因片段编码 ) 、 VP7 (可由第 7、 8或 9 基因编码 ) 是刺激产生保护性中和性抗体的中和抗原 7 。根据 VP7 和 VP4 特异性不同将轮状病毒分为 G、 P 两个血清型 ,至今已发现 14 个 VP7 血清型 ( G12G14) ,其中 G12G4、 G8、 G9、 G10、 G12 可感染人类 ,较为常见的是 G12G4 型。 VP7 的抗原特异性与编码基因的核甘酸序列有关 ,VP7 基因具有 9 个独立的可变区 ,这些可变区在
26、同一血清型中高度保守 ,而不同型间高度变异 7 ,因此 VP7 血清型与基因型的划分相一致 ,用单克隆抗体 (McAb) 或 PCR 等方法均可对其分型。 VP4 血清型分型较复杂 ,目前至少已有 11 个 P 血清型及 20 多种 P 基因型 ,基因型与血清型密切相关 ,通常可根据基因型推测其相应的血清型。引起婴幼儿腹泻的 P 型轮状病毒血清型多属 P1A 或 P1B ,基因型则多为 P 8 、 P 4 。 G、P 最为普遍的组合是 G1P1A、 G2P1B、 G3P1A 和G4P1A。不同国家、地区 ,不同年份流行的轮状 病毒的 G、 P 型别及其组合可发生变化 ,形成轮状病毒复杂、多变的
27、分子流行病特征。2. 兰州地区轮状病毒腹泻的流行特点 : 轮状病毒感染在兰州地区普遍存在 ,占婴幼儿急性腹泻的 60 %左右 ,有明显季节性 ,高峰季节在每年 11 月份 ,与文献报道世界各国的流行情况相似。兰州地区轮状病毒存在长、短两种电泳型 ,偶有长、短型混合感染发生。 2000 年至 2001 年 3 月 ,兰州地区轮状病毒主要的血清型为 G3 (6110 %) , 其后依次为 G2(2514 %) 、 G1 (1316 %) ,未见 G4 型 ,主要的 P 血清型为 P1A (7714 %) ,其次为 P1B (2216 %) ,未见 P2型轮 状 病 毒。最 多 的 血 清 型 组
28、合 是 G3P1A(5717 %) ,其次为 G2P1B (2311 %) 、 G1P1A(1912 %) 。3. 轮状病毒病原检测 : ELISA、 PAGE、 RT2PCR三种方法都可作为临床检测轮状病毒的方法 ,ELISA具有方便、价廉的优点 ,但由于粪样中成分繁杂 ,存在其他抗原成分 ,干扰轮状病毒抗原抗体的结合 ,所以结果有一定的误差 ,可能出现假阳性或假阴性。本研究中 ELISA 法检测的阳性率最高 ,但和 PAGE法检测结果不符的例数也较多 ,证实了这点。而PAGE加上硝酸银染色 ,因其独特的电泳图形 ,特异性高 ,而硝酸银可以检测到微量的核酸 ,被视为检测轮状病毒最可靠的方法。
29、 RT2PCR 具有较高的灵敏性和特异性 ,但技术要求高 ,设备昂贵 ,基层医院难以普及。在实际工作中可酌情选择任意一种方法。4. DNA 探针的特异性 : cDNA 探针杂交方法用于轮状病毒基因分型具有成本低、简便易行、一次可检测较多样品的优点 ,适于大规模流行病学调查研究。用于分型的探针其特异性与探针和所检测基因的同源性以及各型探针之间的同源性相关 ,而在杂交过程中杂交的温度 ,杂交液中甲酰胺的浓度以及blocking 的封闭时间等因素也直接影响杂交的结果。本研究中针对各 G血清型的探针根据各基因型内高度保守而不同型之间高度变异的片段设计 ,各型特异性探针之间同源性均小于 80 % ,在改
30、善杂交条件如杂交液中加入 50 %甲酰胺 ,提高杂交温度 ,延长 blocking 封闭非特异性抗体位点的时间后 ,型间无明显交叉反应 (实验中用经测序确定的质粒作为阳性对照证明了这一点 ) ,鉴定结果可靠 ,与套式114中华儿科杂志 2002 年 7 月第 40 卷第 7 期 Chin J Pediatr , July 2002 , Vol 40 , No. 7PCR 方法分型结果一致。 8 例未能分型的标本可能为 其他型别轮状病毒 ,有待进一步鉴定。 VP4 基因2052658bp 为高可变区 ,在各基因型别间高度变异而同一型别内保守 ,以此片段制备的 cDNA 探针 ,不用提高杂交条件即
31、显示出良好的特异性。5. 分子流行病学特点的意义 : 既往的研究显示 ,轮状病毒腹泻流行的 G血清型主要是 G1 G4 ,其中 G1 占 54 %。最常见的血清型组合是 G1P1A ,其次为 G2P1B。方肇寅等 3 在我国长春、大同、郑州、广州等城市的调查结果显示 ,1982 1996 年与1998 1999 年相比 ,我国流行的轮状病毒血清型虽有所变化 ,但一直以 G1 型为主 ,占 6711 % 8314 %。国外文献报道近年来轮状病毒呈现新的分子流行病学特点 ,G3 型轮状病毒感染呈上升趋势 ,部分地区G3 占主导地位。委内瑞拉一项为期 8 年的调查结果显示该地区 G3 为主要流行血清
32、型 (25 %) ,其后依次为 G1 (20 %) 、 G4 (15 %) 、 G2 (10 %) 8 。而在加纳 ,1998年 G3 型占轮状病毒感染的 78 % ,其次是 G2(14 %) 、 G1 (2 %) 和这三者的混合感染 (6 %) 9 。本研究结果显示兰州地区在 2000 年至 2001 年间 G3型轮状病毒占主导地位 (61 %) , 丰富了国内轮状病毒感染的流行病学资料 ,表明轮状病毒感染在我国也不是单一模式 ,持续不断地监测其流行特点及规律是必要的。(本文图 1 4 见插图 7 - 2)参 考 文 献1 Bern C , Martinews J , Zoyasa I ,
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37、学医学院教授、儿科学研究生导师、浙江医学会儿科学会主任委员、浙江省科协常务委员、中华医学会浙江分会副会长、浙江省中西医结合学会顾问、中国红十字会浙江分会会长。历任中华医学会儿科学会委员、常务委员、中华儿科杂志编委。厉 华教授执着追求并毕生致力于医学教育事业和儿童保健事业 ,潜心钻研儿科教学、科研及疾病的诊断治疗 ,是享有盛誉的医学教育家和儿科专家。她医术精湛、医德高尚、治学严谨 ,有“稀有病活字典”之誉 ,在征服白血病 ,攻克儿科脑瘫顽症等方面有着独到的见地和很深的造诣 ,为浙江医学事业培养了一代又一代的儿科学人才 ,是我国儿科医学事业的老一辈开拓者、浙江省儿科学的奠基人。党和政府对她的工作给予了充分的肯定 ,曾授予她浙江省“三八红旗手”、浙江省“优秀少儿工作者”称号 ,1992 年被国务院批准享受政府特殊津贴。联合国儿童基金会也对她的工作给予了高度评价。她的一生 ,是执着追求进步的一生 ,革命的一生 ,敬业奉献的一生 ,她把毕生的精力献给了中国的儿科医学事业。她的逝世 ,使我们失去了一位优秀的医学教育家和儿科学专家、一位德高望重的长者 ,我们深感悲痛。她的高尚情操和品德永远值得我们学习。214 中华儿科杂志 2002 年 7 月第 40 卷第 7 期 Chin J Pediatr , July 2002 , Vol 40 , No. 7
