1、 芹菜素对小鼠 T 淋巴细胞体外增殖、 细胞周期和凋亡的影响作者：梁兆端, 曾耀英, 黄秀艳, 贺芳【摘要】 目的: 研究芹菜素（AP）对小鼠 T 细胞体外增殖、细胞周期和凋亡的影响。方法: 无菌分离小鼠淋巴结和胸腺细胞, MTT 法检测不同浓度（25、 50、 100、 150、 200 mol/L）的AP 对多克隆刺激剂刀豆蛋白 A(ConA)诱导的 T 细胞增殖的影响, PI 染色结合流式细胞术（FCM）分析细胞周期的分布 , Annexin V-FITC/PI 双染色结合 FCM 检测 AP 对 T 细胞凋亡的影响, 以及 AP与地塞米松（DEX）共同作用下 T 细胞凋亡的变化, 并用
2、 MTT 法检测该药物浓度对 T 细胞的毒性作用。结果: 25200 mol/L AP 对T 细胞无药物毒性作用, 并明显抑制 ConA 诱导的 T 细胞增殖(P0.01), 使细胞周期停滞在 G0/G1 期, 且呈剂量依赖关系; 各浓度 AP 对 T 细胞凋亡均具有抑制作用, 并明显抑制 DEX 诱导的 T 细胞凋亡(P0.01), 且呈剂量依赖关系。结论: 在一定浓度范围内, AP 明显抑制 ConA 诱导的小鼠 T 细胞体外增殖 , 使细胞周期停滞G0/G1 期, 并明显抑制 T 细胞凋亡。 【关键词】 芹菜素 T 淋巴细胞 增殖 周期 凋亡Abstract AIM: To study
3、the effect of Apigenin (AP) on the proliferation, cell cycle and apoptosis of mouse T cells in vitro. METHODS: The lymphocytes were prepared from lymph nodes and thymus of mice. The effect of AP on the proliferation of T in response to ConA at different concentrations (25, 50, 100, 150, 200 mol/L) w
4、as detected by MTT. Cell cycle was measured by PI staining and FCM. The effect of Apigenin and Apigenin with DEX on T cell apoptosis was measured by Annexin V-FITC/PI double staining and FCM. The effect of different concentrations of AP cytotoxicity to T cells was measured by MTT. RESULTS: 25-200 mo
5、l/L of AP didnt have cytotoxicity to T cells, but it had some inhibitory effect on T cells in response to ConA(P0.01), arresting cell cycle at G0/G1 in a dose-dependent manner. Different concentrations of AP inhibited the apoptosis of T cells, especially those induced by DEX(P0.01). CONCLUSION: AP c
6、an inhibit the proliferation of mouse T cells in response to ConA, arrest cell cycle at G0/G1 and inhibit the apoptosis of T cells.KeywordsApigenin; T lymphocyte; proliferation; cell cycle; apoptosis芹菜素（Apigenin, AP）, 又名 4, 5, 7-三羟基黄酮, 分子式C15H10O5, 是一种无诱导突变的黄酮类化合物 , 也是一种植物雌性激素, 广泛存在于绿色植物中1, 2。AP 具有抗
7、增殖、 抗炎、 抗病毒微生物和清除自由基等功能, 同时也是信号通路中几种蛋白激酶的抑制剂, 其 4, 5, 7 位置的三个羟基和 C2C3 双键决定了其独特的生物学特性3-5。目前, AP 广泛应用于肿瘤研究中 , 具有抑制多种肿瘤增殖的潜能, 但在免疫学方面的研究罕见报道。目前, 以淋巴细胞增殖、 细胞周期和凋亡为研究靶点, 成为筛选和开发新型免疫调节药物的新策略。在当今开发新型化学药物极为困难的情况下, 从食物提取物中筛选具有免疫调节作用的药物具有很大的空间。1 材料和方法1.1 材料 清洁级 BALB/c 近交系小鼠(雄性, 810 周龄, 质量2225 g; 34 周龄, 质量 121
8、6 g), 购自广东省医学实验动物中心。刀豆蛋白 A(ConA)、 L-谷氨酰胺、 -二巯基乙醇、 二甲基亚砜(DMSO)、 碘化丙啶（PI ）、 地塞米松(DEX) 、 噻唑蓝(MTT, 用PBS 配制成 5 g/L 的工作液 , -20贮存备用)、 芹菜素（AP, 用DMSO 溶解成 265 mmol/L 的储存液, 分装, -20保存, 临用前用含100 mL/L DMSO 的 PBS 稀释成 10 mmol/L 的工作液）和 RNase 均购自美国 Sigma 公司。青霉素和链霉素购自华北制药公司。RPMI1640 和胎牛血清 (fetal calf serum, FCS)购自美国 G
9、ibco-BRL 公司。Annexin V-FITC/PI 凋亡检测试剂盒购自北京宝赛生物技术有限公司。无水乙醇购自广州化学试剂厂。FACSCalibur 流式细胞仪为美国 Becton Dickinson 公司产品。1.2 方法1.2.1 淋巴结细胞和胸腺细胞的制备 将 BALB/c 小鼠断髓处死, 无菌分离双侧颌下、 腋窝、 锁骨下、 腹股沟浅表和肠系膜淋巴结以及胸腺, 去掉被膜, 于 200 目尼龙网筛研磨过滤, 于 4, 125 g 离心 5 min, 并收集细胞, 4磷酸盐缓冲液(PBS, pH7.2)洗涤, 同上条件离心 1 次, 2 mL/L 台盼蓝染色, 活细胞百分率达 96%
10、, 并用含100 mL/L FCS 的 RPMI1640 培养液悬浮淋巴细胞并调整淋巴结细胞和胸腺细胞的密度分别为 2109/L 和 1109/L。1.2.2 MTT 法检测 AP 对 ConA 诱导的小鼠淋巴结 T 细胞增殖的影响分别设置 Control 组、 ConA 组、 ConA+AP 25mol/L组、 ConA+AP 50 mol/L组、 ConA+AP 100 mol/L组、 ConA+AP 150 mol/L组和 ConA+AP 200 mol/L组。细胞接种于 96 孔细胞培养板, 每孔加 10 L不同浓度的 AP（终浓度分别为 25、 50、 100、 150、 200 m
11、ol/L）, 每一浓度设 3 个复孔, 每孔定容 200 L, 于37、 50 mL/L CO2 培养箱预孵育 2 h, 然后加入 ConA (终浓度 5 mg/L)继续培养。加 ConA 后 48 h, 每孔加入 20 L MTT 工作液, 于37、 50 mL/L CO2 培养箱孵育 4 h, 300 g 离心 5 min, 吸掉上清液体, 每孔加 100 L DMSO, 振荡 10 min, 免疫酶标仪 490 nm 波长检测吸光度（A 值）, 并计算细胞相对抑制率（ %）。抑制率=(1实验组 A 均值)/对照组 A 均值100%。1.2.3 PI 染色分析细胞周期分布 按 1.2.2
12、的分组及培养方法进行培养, 48 h 后收集细胞, 冷 PBS 洗涤, 于 4, 125 g 离心 5 min, 300 L含 100 mL/L 普通级小牛血清的 PBS 重悬, 边轻荡边加入 700 L冷无水乙醇, 4固定 30 min, 于 4, 125 g 离心 5 min, 弃去上清, 2 mL 冷 PBS 重悬洗涤, 同上条件离心 2 次, 弃去上清, 收集沉淀细胞, 边轻荡边加入 300 L PI 染液（含 RNase） , 避光 15 min, 立即进行FCM 分析。1.2.4 Annexin V-FITC/PI 染色检测凋亡细胞 分别设置 Control组、 AP 25 mol
13、/L组、 AP 50 mol/L组、 AP 100 mol/L组、 AP 150 mol/L组、 AP 200 mol/L组、 DEX 组、 DEX+AP 25 mol/L组、 DEX+AP 50 mol/L组、 DEX+AP 100 mol/L组、 DEX+AP 150 mol/L组和 DEX+AP 200 mol/L组。胸腺细胞接种于24 孔细胞培养板, 每孔加 50 L不同浓度的 AP（终浓度分别为25、 50、 100、 150、 200 mol/L）, 定容 1 mL, 于 37、 50 mL/L CO2 培养箱预孵育 2 h, 然后加入 DEX (终浓度 1 mol/L)继续培养。
14、6 h 后收集细胞 , 冷 PBS 洗涤离心(125 g, 5 min, 4), 弃上清液体, 加入 100 L染料结合缓冲液(Binding buffer)重悬后加 10 L Annexin V-FITC 染色, 混匀后室温避光静置 15 min, 补加 200 L Binding buffer 和 5 L PI 染液（50 mg/L）, 混匀静置 5 min, 立即进行 FCM 分析。1.2.5 FCM 分析 FITC 在荧光 1(FL1)通道检测, PI 在荧光2(FL2)通道检测。先在前散射(FSC)对侧散射(SSC)二维散点图中划出淋巴细胞区 R1, 然后对 R1 细胞群作 DNA
15、倍体分析, 并对 R1 细胞群 FITC/PI 荧光强度进行检测, 每管样品检测 10000 个细胞。全部数据经 FACSCalibur 流式细胞仪和 CELLQuest 软件获取和分析, 检测周期的数据用 ModFit 软件进一步分析。1.2.6 MTT 法检测药物毒性作用 分别设置 Control 组、 AP 25 mol/L组、 AP 50 mol/L组、 AP 100 mol/L组、 AP 150 mol/L组和 AP 200 mol/L组。淋巴结 T 细胞接种于 96 孔细胞培养板, 余下处理同 1.2.2（不加 ConA）, 并计算细胞相对存活率(%)。存活率=（实验组 A 均值/
16、对照组 A 均值） 100%。1.2.7 统计学处理 获得的结果用 xs 表示, n 为样本量。统计软件用 SPSS.10, 统计方法用 one-way ANOVA。2 结果2.1 AP 对 ConA 诱导小鼠淋巴结 T 细胞增殖的影响 如表 1 所示, 培养 48 h, Control 组 A 值为 0.1110.002, 而 ConA 组 A 值明显增加, 为 0.8500.112（P0.01）, ConA+AP 25 mol/L组 A 值与ConA 组无统计学意义（P0.05）, 其余各浓度组 A 值明显低于ConA 组（P0.01）, 并具有浓度依赖性。表 1 AP 对 ConA 诱导
17、的 T 细胞增殖的影响（略）Tab 1 The influence of Apigenin on the proliferation of T cells in response to ConAbP0.01 vs control; dP0.01 vs ConA.2.2 AP 对 ConA 诱导小鼠淋巴结 T 细胞细胞周期阻滞分析 如图 1 所示, 各组均有晚期凋亡或坏死的细胞, Control 组细胞大部分处于 G0/G1 期, 即为静止状态, ConA 组细胞明显进入 S 期和 G2/M 期（P 0.01）, ConA+AP 25 mol/L组细胞周期分布与 ConA 组无统计学意义（P0.
18、05）, 其余各浓度组细胞周期分布与 ConA 组均有统计学意义（P0.01）, G0/G1 期明显增高, 而 S 期和 G2/M期明显降低, 并具有浓度依赖性。图 1 AP 对 ConA 诱导的 T 细胞细胞周期阻滞分析（略）Fig 1 The analysis of AP to T cell cycle blockage in response to ConAa: Control; b: ConA; c: ConA+AP 25mol/L; d: ConA+AP 50mol/L; e: ConA+AP 100mol/L; f: ConA+AP 150mol/L; g: ConA+AP 200
19、mol/L.2.3 AP 及 AP 与 DEX 共同作用下对胸腺 T 细胞凋亡影响 Annexin V-FITC 是一种标记有荧光素的钙依赖磷脂结合蛋白, 可特异性地与早期凋亡细胞外翻的细胞膜磷脂酰丝氨酸(PS)结合, PI 能进入细胞膜不完整的晚期凋亡和坏死的细胞, 故 Annexin V-FITC/PI 双染色细胞可呈现 3 个细胞群, 即正常细胞 (Annexin V-FITC-/PI-)、 早期凋亡细胞(Annexin V-FITC+/ PI-)、 晚期凋亡和坏死细胞(Annexin V-FITC+/PI+)。如图 2 所示, 培养 6 h, Control 组胸腺 T 细胞自发凋亡率
20、低（7.78%）, 地塞米松(DEX)诱导的胸腺 T 细胞凋亡率明显增加（63.84%）（P0.01）, 各浓度 AP 明显抑制 T 细胞自发凋亡, 并对 DEX 诱导的 T 细胞凋亡具有明显抑制作用（P0.01）。图 2 AP 对胸腺 T 细胞凋亡影响和 AP 与 DEX 共同作用下胸腺 T 细胞凋亡变化（略）Fig 2 The influence of Apigenin on the apoptosis of thymus T cells and the change of Apigenin with DEX on the apoptosis of thymus T cellsa: Con
21、trol; b: AP 25 mol/L; c: AP 50 mol/L; d: AP 100 mol/L; e: AP 150 mol/L; f: AP 200 mol/L; g: DEX; h: DEX+AP 25 mol/L; i: DEX+AP 50 mol/L; j: DEX+AP100 mol/L; k: DEX+AP 150 mol/L; l: DEX+AP 200 mol/L.2.4 MTT 法检测 AP 对 T 细胞的药物毒性作用 如表 2 所示, 25200 mol/L AP 作用 48 h 后, 细胞相对存活率大于 50%。故培养48 h, 25200 mol/L AP
22、对小鼠 T 细胞无药物毒性作用。表 2 AP 对 T 细胞的药物毒性评价（略）Tab 2 The value of AP cytotoxicity to T cells3 讨论 MTT 法检测 AP 对 ConA 诱导的小鼠淋巴结 T 细胞增殖影响的结果显示, 在一定浓度范围内（50200 mol/L）, AP明显抑制 ConA 诱导的小鼠淋巴结 T 细胞的增殖, 具有浓度依赖性, 并与该浓度药物对 T 细胞的毒性作用无关。PI 染色分析细胞周期分布结果表明, AP 抑制 ConA 诱导 T 细胞增殖, 并使细胞周期停滞在G0/G1 期。上述结果与 AP 使前列腺癌细胞生长停滞在 G0/G1
23、期相似。AP 可能促进 p53 的表达使前列腺癌细胞生长停滞在 G0/G1 期2。p53 基因是重要的抑癌基因, 可使细胞分裂停滞在 G0/G1 期。p53 可以通过促进细胞周期抑制蛋白 p21 等表达, 抑制异二聚体蛋白激酶（如 cyclinD1/CDK4）的活性, 使 Rb 去磷酸化, 引起细胞周期停滞在 G0/G1 期6。AP 抑制 ConA 诱导的小鼠淋巴结 T 细胞增殖, 使细胞生长停滞在 G0/G1 期, 可能与 p53 途径有关, 其作用机制有待进一步研究。 有研究表明 AP 通过诱导肿瘤细胞凋亡而抑制肿瘤细胞增殖1, 但本研究 Annexin V/PI 双染色结果表明, AP
24、抑制胸腺 T 细胞的自发凋亡, 并抑制 DEX 诱导的胸腺 T 细胞凋亡。AP 是 Ca2+通道阻断剂7。研究发现 , 胞内自由 Ca2+浓度持续升高与凋亡形成有关。线粒体过载 Ca2+, 则通过释放凋亡促进因子和产生活性氧族直接诱导细胞凋亡。此外, 高浓度胞内自由 Ca2+会引起内质网持续的 Ca2+释放, 产生内质网应激, 从而激活凋亡信号而诱导细胞死亡8。AP 可能抑制胞内自由 Ca2+浓度的升高, 从而对胸腺 T 细胞具有保护作用。此外 , AP 是 NF-B、 蛋白激酶C（ PKC）、 酪氨酸激酶和有丝分裂原激活蛋白激酶（MAPK）等抑制剂9, 这些信号分子均与增殖和凋亡信号传导有关。AP 可能通过抑制上述信号分子的活性而抑制 T 细胞的增殖和凋亡。其确切机制有待下一步的研究。 本研究证明 AP 对 ConA 诱导的小鼠 T 细胞体外增殖具有抑制作用, 使细胞周期停滞在 G0/G1 期, 并抑制 T 细胞凋亡, 这将其开发成为免疫调节药物提供了实验基础。【
