1、 农杆菌介 Btcry1Ah 及 cry1Ie 基因抗虫植物之研究1 引言自 1996 年首例转基因作物批准商业化生产以来，转基因作物的生产进入了快速发展时期。2012 年，作为转基因作物商业化的第 17 年，全球有 28 个国家种植转基因作物，已有包括大豆、玉米、棉花等 24 种转基因作物实现了商业化种植，转基因作物受益农户为 1730 万，种植总面积达到 1.703 亿公顷，比 1996 年的 170 万公顷增长了 100 倍 (见图 1-1)。所以转基因技术已成为目前应用最为迅速的生物技术。其中耐除草剂作物种植面积达到 1.005 亿公顷，占全球转基因作物种植总面积的 59 %；Bt 抗
2、虫作物种植面积达到 2610 万公顷，其中 Bt 抗虫玉米的种植面积由 2011 年的 600 万公顷增长到 750 万公顷；在转基因作物中，复合性状是一个比较重要的特征，13 个国家种植了复合性状转基因作物，种植面积达 4370 万公顷，而在 2011 年，种植面积为 4200 万公顷1。玉米 Zea mays L.）是重要的粮食作物和工业原料，对国民经济的发展起着十分重要的作用。同时玉米也是重要的饲料原料，玉米的粗纤维含量为 2%，而无氮浸出物所占的比例却达到 72%，所以玉米的利用率在众多作物中是最高的。我国玉米的种植面积从 2000 年的2306 万公顷逐渐增加到 2009 年的 30
3、46 万公顷，总产量从 10600 万吨增到 16300 万吨，玉米的种植面积首次超过水稻、小麦成为我国第一大粮食作物2。虫害一直是制约玉米产量的一个重要因素。全球范围内玉米害虫约有 350 种，这些害虫中危害最为严重分布最广的是鳞翅目玉米螟。每年因玉米螟危害会导致全球的玉米减产 5%左右。在我国玉米螟危害从北向南一年可发生 17 代，一般年份春玉米受到玉米螟的危害可造成玉米减产 10%左右，大发生年所造成的产量损失严重时可达 30%以上3,4。同时鳞翅目害虫对玉米穗发生侵害时，可能会导致产生伏马毒素，这是一种霉菌毒素，会对牲畜的健康造成很多不良的影响，并且该毒素被怀疑可导致癌症5,6。因此，
4、有效地防治虫害对我国乃至全世界的农业发展意义重大。传统意义上的病虫害防治方法主要为化学防治和生物防治。其中化学防治的优点有杀虫谱广，见效快，应急性强，操作方便，但长期喷洒会导致严重的生态问题，包括害虫产生抗药性，对环境造成污染，对人体健康造成严重危害，毒害害虫的天敌及有益的昆虫等诸多弊端7-9。生物防治是从生态角度寻求的一种方法，相对安全一些，减轻了环境污染，但其见效慢，受环境影响较大，并且会对环境造成一定的负面影响，影响公众健康，攻击非靶标生物10,11。抗虫转基因技术的发展对植物自身抗虫性的提高有十分重要的意义12,13，为虫害的防治提供了一条新的途径。自 1996 年第一例转 Bt 基因
5、抗虫玉米在美国被批准商业化种植以来，全球抗虫转基因玉米的种植面积逐年增加。在转基因作物研究中，应用的抗虫基因种类比较多，根据基因的来源可分为三大类：第一类是蛋白酶抑制剂基因(PI)14，其中应用最为广泛的是豇豆胰蛋白酶抑制剂基因 (cowpeatrypsin inhibitor，CpTI)15-17，CpTI 蛋白有两个可以抑制胰酶的结构域，使蛋白酶不能水解外源蛋白质，导致蛋白质不能被正常消化，继而导致昆虫死亡。第二类是植物凝集素基因18,19，凝集素是生物体中大量存在的一类非免疫性球蛋白。其杀虫原理是当凝集素被昆虫食入后，它会与昆虫肠道细胞膜上的糖蛋白发生结合，从而影响营养的吸收，最终导致昆
6、虫死亡。第三类也是应用最广泛的一类就是 Bt 基因20-22 。Bt 蛋白通过破坏害虫的中肠细胞使其致死23。Bt 抗虫转基因作物的种植大大减少了杀虫剂的使用，增加了作物的产量，给农民带来了很好的经济效益的同时对人类的健康和环境的安全起到了很好的作用24-27。在重要经济作物防虫害方面，Bt 抗虫转基因作物的发展应用已经成为一个重大的生物技术突破28。1.1Bt 杀虫基因概况国外的几个具有代表性的大型跨国生物技术公司，例如孟山都、先正达、杜邦先锋等在 Bt 基因抗虫玉米的早期研发工作中就投入了大量的人力和财力，使得该研究工作发展十分迅猛。美国孟山都公司和迪卡公司于 1990 年首次获得一定的研
7、究成果，报道了能够正常结实的 Bt 基因抗虫玉米的获得 36,37；1996 年，美国首次商业化种植抗虫转基因玉米；随后由先正达公司推出的Bt176和Bt11以及孟山都公司推出的MON810抗虫玉米在美国上市销售，它们都是转 Bt cry1Ab 基因的以玉米螟为防治对象的抗虫玉米；随后迪卡公司推出了转 Bt cry1Ac 基因的抗虫玉米 DBT418 ，杜邦先锋公司和 Aventis CropScience 公司分别推出了转 Bt cry1F 基因的抗虫玉米 TC1507和转 Bt cry9C 基因的抗虫玉米CBH351，其防治对象也为玉米螟。除了玉米螟危害，地下害虫也是玉米减产的另一个重要因
8、素。为防治地下害虫危害，孟山都公司推出了防治地下害虫的转 Bt cry3Bb 基因的抗虫玉米MON863和同时防治地下害虫和玉米螟的转 Bt cry3Bb 和 Bt cry1Ab 双基因的抗虫玉米MON863 MON810。先正达公司于 2007 和 2008 年分别推出了抗虫玉米 MIR604 和 MIR162，所选用的基因分别为 Bt cry3A 和 Bt vip3Aa，防治对象也为地下害虫类。随后先正达公司于 2011 推出了转 Bt vip3Aa 和 Bt cry1Ab 双基因的抗虫玉米BT11 x GA21 x MIR162，又于 2012 年推出了转 Bt cry3A，Bt cry
9、1Ab 和 Bt vip3Aa 三基因的抗虫玉米BT11 x MIR162 x MIR604 x GA21，同时防治玉米螟和地下害虫类 GM Crop Database (详见表 1-2)。现在国际上转 Bt 基因抗虫玉米的发展趋势为：转化的基因由单一基因向多基因发展，表现的性状由单一性状向复合性状发展。2 材料与方法2.1 转 Bt cry1Ah 基因烟草研究中的实验材料与方法各种限制性内切酶、Taq DNA polymerase 均购自 Takara 生物公司；同位素法探针标记试剂盒和 T4DNA 连接酶均购自 Promega 生物公司；ELISA 试剂盒购自 Envirologix 公司
10、；BCIP/NBT 碱性磷酸酶显色试剂盒和 RNase A 均购自北京康为世纪有限公司；RNA 提取试剂 Trizol，植物基因组 DNA 小量提取试剂盒以及琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒购自天根生化科技有限公司，反转录试剂盒和蛋白标准 Protein marker）购自 Fermentas 公司；SYBR GreenReal-time PCR Master Mix 购自北京全式金公司； BSA 购于北京德维奥普有限公司；引物由北京诺赛基因组研究中心有限公司合成；HybondTM-XL 尼龙膜购自 GE 公司，PVDF 膜购自 Millipore 公司；-32p-dCTP 同位素购自北京亚辉生
11、物科技有限公司；植物激素 6-BA、NAA 、氨苄青霉素 Amp）和羊抗兔二抗等购自 Sigma 公司；植物组织培养试剂购自 PhytoTechnologyLaboratories 西美杰公司代理）。烟草植株生长到七叶期时，选取每个烟草植株的第二、三、四片叶子三个生物学重复）进行生测；用脱脂棉球将叶片的叶柄包裹，然后放于铺有一层灭过菌滤纸的平皿中，在棉球上滴加少量 ddH2O 进行保湿；接虫：将 12 头初孵棉铃虫接于每片叶片上。编号后将平皿封口，并将平皿放于铺有湿纱布的箱中，并用湿纱布将四周盖上，放于 28 暗室中；要保持纱布的湿度以及室内的温度；三天后对幼虫的死亡数进行统计，并计算幼虫死亡
12、率；参照棉花抗病虫性评价技术规范第 1 部分：棉铃虫）来判定抗性级别。以目测分为 4 个等级：叶片未见取食或取食很少，即为 1 级；叶片上有一些被食孔但不多，即为 2 级；叶片上有许多被食孔但没有出现大片叶片被食缺口，即为 3 级；叶片大部分被食或所剩无几为大量取食，即为 4 级。3 结果与分析 .263.1 Cry1Ah 和 cry1Ie 基因改造 .263.2 植物表达载体的构建 .273.2.1 中间载体 PUhNK、PUhCTP 和 PUhER 的构建27.2.2 植物表达载体 pMhNK、pMhCTP 和 pMhER 的构建.313.3 转 Bt cry1Ah 基因烟草研究中的结果与
13、分析.363.4 转 Bt cry1Ah/cry1Ie 基因抗虫玉米研究 454 讨论.664.1 Bt cry1Ah 基因在转基因烟草中的应用 664.1.1 基因改造 .664.1.2 叶绿体定位表达 664.2 Cry1Ah 和 cry1Ie 基因在抗虫玉米中的应用 674.3 创新点 684.4 展望 685 结 论.69结论1、构建了植物表达载体 PMhNK 、 PMhCTP、PMhER 。2、通过转基因烟草植株的分子检测和室内生物活性检测，表明 cry1Ah 基因的三次密码子优化和蛋白的叶绿体定位表达不断的提高了外源基因的转录水平、蛋白表达水平以及植株对棉铃虫的抗性。3、进一步完善
14、了农杆菌转化玉米幼胚的体系，转化率为 7 %。4、获得两个转 cry1Ah 基因的高抗虫玉米事件，六代跟踪检测表明 cry1Ah 基因能够稳定遗传和表达，植株对玉米螟的抗性也是稳定遗传的。5、获得 29 个转 cry1Ah 基因抗虫玉米事件和 14 个转 cry1Ah 和 cry1Ie 基因双价抗虫玉米事件 11 个为高抗虫，32 个抗虫），两代跟踪检测已初步表明 cry1Ah 基因能够稳定遗传和表达，植株对玉米螟的抗性也是稳定遗传的。6、抗虫表现突出的两个双价玉米事件经生物活性检测，已表明各个组织部位都表现出了极好的抗虫性，并且苞叶、叶片和花丝中 Cry1Ah 蛋白的高表达也表明可以有效防治玉米螟危害。
