1、 南方红豆杉紫杉醇产生菌的分离与鉴定4700 字紫杉醇（Paclitaxel，商品名 Taxol）是一种具有广谱抗癌活性的三环二萜类化合物，1971 年从太平洋短叶红豆杉（Taxus brevifolia）中分离获得1，Schiff 等2随后证实紫杉醇具有独特的抗癌机制。采用微生物发酵法，即从红豆杉植物中寻找紫杉醇产生菌并加以菌种改良，结合微生物发酵技术以提高产量，是目前公认的环境友好、成本低廉的解决紫杉醇生产原料来源危机的好方法3。 自 1993 年 Stierle 等4从太平洋短叶红豆杉树皮中分离出可产紫杉醇内生真菌以来，国内外学者相继开展了筛选产紫杉醇内生真菌的研究，到目前为止，人们已发
2、现了 20 多个属的内生真菌可以产生紫杉醇5，分离部位 专业提供代写教学论文和的服务，欢迎光临大部分取自树干和树枝。本研究从南方红豆杉（Taxus chinensis var. mairei）根部采集树皮，从中分离筛选内生真菌，测定其产紫杉醇性能，以及通过形态特征和 ITS 序列分析对其进行了分类。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 试验材料 南方红豆杉（Taxus chinensis var. mairei）根部树皮，来源于湖南省永州市阳明山国家森林公园内的野生红豆杉，样品采集后迅速装入无菌塑料袋中，4 保存。 1）培养基。固体培养基为 PDA 培养基，琼脂 2.0%，灭菌后冷却至
3、4050 加入 25 mg/L 链霉素，半固体培养基琼脂浓度减半。液体种子培养基：PDA 培养基不加琼脂。发酵培养基（ g/L）6：葡萄糖 1.0，果糖 3.0，蔗糖 6.0，醋酸钠 1.0，酵母粉 0.5，MgSO4 0.36，KH2PO4 0.5，乙酸钠 2.0，ZnSO4 2.510-3，MnSO4 0.510-3，Cu（NO3）2 0.65，KCl 0.06，Ca（NO3 ）2 210-3， FeCl2 210-3，苯丙氨酸 510-3，苯甲酸钠 0.5，KH2PO4 0.136。 2）试剂。紫杉醇标准品（纯度95%，Sigma）， HPLC 流动相甲醇为色谱纯， 水为三蒸水，Ezup
4、 柱式真菌基因组抽提试剂盒（SK8259 ） ，PCR Buffer（10 ），dNTP（10 mol/L ），Taq 酶（5U/L），引物：ITS1 和 ITS4（ITS1：5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3 和 ITS4：5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3，由上海铂尚生物合成）；其他试剂均为国产分析纯。3）仪器。日本岛津 LC-10ATvP 高效液相色谱仪、旋转蒸发仪、BIO-RAD PCR 仪、恒温摇床。 1.2 试验方法 1.2.1 菌株的分离与纯化 将南方红豆杉树皮置于无菌条件下，剥除根部外皮，留取内皮和韧皮部，切割成边长为 0.5 cm0.5 cm 的正方
5、形小块，用 75%的乙醇表面消毒 23 min，无菌水漂洗23 次；滤纸吸干水分，斜插入半固体培养基中，每皿 68 块树皮，共 50 皿。28 培养 37 d，挑取自真皮向培养基基质生长的菌丝体微丝于固体培养基中，纯化 23 次，编号，保藏备用。 1.2.2 菌株的鉴定 1）形态学鉴定。将分离到的菌株于固体培养基，28恒温培养，每隔 12 h 记录菌落形态变化；显微形态观察采用插片法，40 倍物镜；综合以上结果，依据菌落形态、菌丝体、孢子梗、营养细胞以及基质变化等特征，参考真菌鉴定手册进行鉴定7。 2）分子生物学鉴定。按上海生工 SK8259 真菌基因组 DNA抽提试剂盒提取菌株基因组 DNA
6、，以此为模板扩增 ITS 序列（扩增条件：预变性 94 、5.0 mim； 94 、30 S ，55 、35 S， 72 、1.0 min， 35 个 循环； 72 延伸 8.0 min） 测序由上海铂尚生物技术有限公司完成，所得序列经 EMBL数据库中的 BLAST 比对分析，并利用 DNAMAN 和 MEGA 软件进行系统进化树分析。 1.2.3 发酵培养 28 接种待培养菌株至固体培养基，培养45 d，无菌生理盐水洗下孢子，接种至 20 mL 装液量的液体种子培养基中，3 皿/瓶，28 、220 r/min 培养 1416 h 后，将液体种子以 8%的接种量接种至发酵培养基中，28 、2
7、00 r/min 摇床培养7 d。 1.2.4 紫杉醇的提取 发酵液 4 800 r/min 离心 20 min，收集上清液；所得菌体沉淀以 20 000 r/min 匀浆 1520 min，使目标产物充分释放，再离心；将两次上清液合并，双层滤纸过滤，滤液 50 旋转蒸发浓缩至原体积的 1/10，加入等体积氯仿充分振荡进行萃取，共萃取两次，合并有机相，无水 Na2SO4 干燥，35 旋转蒸发至干，样品加少量甲醇溶解，用 0.45 m 微孔滤膜过滤， 定容至 10 mL 备用。 1.2.5 样品中紫杉醇含量的检测 1）标准溶液配制。精确称取紫杉醇标准品 1.0 mg， 用 10 mL 甲醇溶解，
8、配成 100 mg/L 母液备用。将母液稀释成5.0、10.0、15.0、20.0、40.0 mg/L 系列浓度的标准溶液。 2）色谱条件。日本岛津 LC-10ATvP 高效液相色谱仪，Kromstar C18 柱（250 mm4.6 mm）；流动相， 甲醇水（V/V） =6535；流速 1.0 mL/min， 检测波长 227 nm， 柱温 28 ， 进样量 10 L。 2 结果与分析 2.1 内生真菌的分离及形态学鉴定 从南方红豆杉树皮中分离出 69 株内生真菌， 依据形态学鉴定，确定其分属 16 属。每个属中挑选生长性状优良的菌株，进行液体发酵培养，测定其发酵物的紫杉醇含量，相同种属菌株
9、取紫杉醇产量平均值，未检出者则视为无效菌株，不在表内列出。共获得 7株产紫杉醇菌株，对应的鉴定结果及紫杉醇产量见表 1。 2.2 紫杉醇含量的检测 2.2.1 标准曲线的制作 取所配的紫杉醇标准品溶液，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标作标准曲线，回归方程为=16 518x-9475.1，r2= 0.998 1。结果表明，回归方程在 040 mg/L 范围内线性关系良好（图 1）。 2.2.2 发酵液中紫杉醇的检测 紫杉醇标准品和链格孢属菌株（YEP751）发酵提取物的 HPLC 检测结果见图 2 和图 3。在相同色谱条件下，紫杉醇标准品的保留时间为 23.574 min，菌株发酵浓缩液在此时间处
10、有一明显对应峰，即检测到菌株代谢产物中含有紫杉醇。 2.3 紫杉醇产生菌的分子生物学鉴定 菌株 YEP731、YEP822 和 YEP751 的 ITS 扩增序列分别为564、599、532 bp，该序列在 EMBL 数据库中经 BLAST 比对，显示与链格孢属真菌（Alternaria sp.）有极高的同源性（99%），系统进化树（图 4） 结果亦表明这 3 株菌株与链格孢属真菌的亲缘关系最近；菌株 YEP821 与葡萄孢盘菌属真菌（Botryotinia sp.）的 ITS序列有 99%的一致性；菌株 YEP742 与葡萄刺盘孢属真菌（Colletotrichum sp.）的 ITS 序列
11、有 99%的一致性；菌株 YEP442 与拟茎点霉属（Phomopsis sp.）的 ITS 序列有 99%的一致性；菌株YEP611 与枝孢菌属真菌（Cladosporium sp.）的 ITS 序列有 99%的一致性。上述相关序列均在 ENA（European Nucleotide Archive）完成注册，相应 EMBL 登录号为 HG530662-HG530668。 3 讨论 本试验从南方红豆杉的根部树皮中分离得到 69 株内生真菌，形态学鉴定其分属 16 属， 通过 HPLC 法检测发酵物中紫杉醇的含量， 发现有 7 株菌株能够产生紫杉醇， 再经过 ITS 序列分析确定分别属于链格孢属（Alternaria）、葡萄孢盘菌属（Botryotinia）、刺盘孢属（Colletotrichum ）、拟茎点霉属（Phomopsis）和枝孢菌属（Cladosporium）。 其中链格孢属真菌（Alternaria）平均产量为271.54 g/L（其中一株产量更是高达 303.06 g/L），是目前见诸报道的产量最高的链格孢菌8-11，亦是从红豆杉根部树皮中筛选出的紫杉醇产量较高的野生菌株之一5。随着后续研究的跟进，其紫杉醇产量有望跃上一个新台阶。
