1、气相色谱法测定人血白蛋白半成品中辛酸钠含量赵明芬 1，王霞 1，李荣贞 1,2，张华 1，张晓杰 1*（1. 山东泰邦生物制品有限公司，山东 泰安 271000；2.山东省生物制品研究所，山东 泰安 271000）摘要 目的 ：建立气相色谱法测定人血白蛋白半成品中辛酸钠的含量。方法： 色谱条件：色谱柱 KB-INNOWAX（30m0.32mm0.5m） ；气化室温度 250；柱温 190；检测器温度 250；载气为氮气，柱流速 3.0mLmin-1； 氢气流速 40mLmin-1；分流比 10:1，乙酸乙酯为萃取剂（溶剂） 。进行了专属性、重复性、线性、溶液稳定性、准确度、定量限方法学验证。结
2、果： 该气相色谱法辛酸峰拖尾因子 1.10，塔理论板数为 21251，与相邻峰分离度为 5.1 且未受其他峰干扰。重复性 RSD 为 0.74%；线性范围在 157785gmL -1；溶液在 24h 内稳定，峰面积 RSD 为 1.01%；平均回收率及 RSD 分别为96.72%0.93%、0.96% ，定量限为 5.23g。结论： 本文建立的气相色谱法测定人血白蛋白半成品中辛酸钠的含量，操作简便、准确。关键词：人血白蛋白；气相色谱法；辛酸钠含量中图分类号：R 921.2 文献标识码：A 文章编号 ：1009-3656 （2017）Determination Method of Sodium
3、Caprilate assay in the Bulk of Human Serum Albumin Semi-finished Product by Gas ChromatographyZhaoHAO Ming-fen1, WangANG-Xia1，LiI Rong-zhen 1,2, ZhangHANG-Hua1,ZhangHANG Xiao-jie1* （1. Shandong Taibang Biological Products Co., Ltd, Taian 271000， Shandong Province， China；2. Shandong Institute of Biol
4、ogical Products, Taian 271000， Shandong Province， China）作者简介：.赵明芬（1984-） ，女，山东泰安，药师，本科，研究方向：药学分析，联系电话：0538-6203862，E-mail：.通信作者：张晓杰（1985-） ，男，山东泰安，工程师，硕士，研究方向：生化药学，联系电话：0538-6207098，E-mail： .Comment JX/北(北1: 中文摘要中未写 FID检测器，保留还是删掉？已删除！Comment JX/北(北2: 中文摘要中单位为 gAbstract Objective: To establish and op
5、timizetion a method for determination of sSodium cCaprilate assay in the hHuman serum aAlbumin semi-finished product by gas chromatography. Methods: The chromatographic conditions were as follows: determination was performed on KB INNOWAX column（(30m0.32mm0.5m)；）, FID as the detector; the gasificati
6、on room temperature was 250; the column temperature was 190; the detector temperature was 250, N2 as the carrier gas was N2 and column flow rate was 3.0 mLmin-1; ，hydrogen flow rate was 40mLmin-1;. Tthe split ratio was 10:1; and ethyl acetate as the extraction solvent. The Sspecificity, the repeatab
7、ility, the linearity range, the solution stability, the accuracy and, the limit of quantification of this method were validated. evaluated. Results： In this method the chromatographic peak was goodThe tailing factor of Caprilate peak was 1.10, its theoretical plate number was 21251, and the resoluti
8、on of Caprilate peak with adjacent peaks was 5.1. The RSD of repeatability was 0.74%, the linearity range was 157-785gmL-1, and the RSD of peak area for the solution stability within 24 hours was 1.01%. tThe average recovery rate and RSD werewas 96.72% 0.93% with RSD as, 0.96%. The RSD of reproducib
9、ility were 0.84%.Linearity range was 157-785gmL-1. The LOQ was 5.23gmL-1. Durablity was good.Conclusion： The method is specific, reproduciblesimple, and reliable, which can be used as for determinationdetection of sSodium cCaprilate assay in the hHuman serum aAlbumin semi-finished product.Key words：
10、Human Serum Albumin ; Gas Chromatography ; Content of Sodium Caprilate Assay人血白蛋白用于临床已有几十年的历史，其有效性、安全性已为长期的临床实践所证明。人血白蛋白制造过程中，60保温 10h灭活病毒，需加适量的辛酸钠作为稳定剂，防止白蛋白受热变性，目前本品生产过程中间品的质量标准中未对加入的辛酸钠进行定量检测控制 1230。为更好地规范生产，本文拟建立一种测定人血白蛋白半成品中辛酸钠含量的方法，作为本企业的内控方法。辛酸钠含量的检测方法中国药典2015 年版三部采用三氯甲烷萃取的气相色谱法，文献报道的萃取滴定法 2-
11、5、柱前衍生-反相高效液相色谱法 6、反相高效液相色谱法 7及离子排斥色谱法 8等，这些方法存在试样处理繁琐、检测周期较长等缺点。本文建立气相色谱法，方法简便、准确、重复性好，可用作人血白蛋白半成品中辛酸钠的含量检测。1 材料与方法1.1 样品人血白蛋白中间品为山东泰邦生物制品有限公司产品，批号 2015s1，蛋白含量为 20.41%。1.2 主要试剂及仪器乙酸乙酯（色谱级，批号：20150912，纯度99.8%）购自天津科密欧化学试剂有限公司；辛酸（批号：BCBN4402V）购自 SIGMA； 7890B 气相色谱仪，OpenLAB 工作站及氢火焰检测器（FID）均购自安捷伦仪器有限公司；色
12、谱柱KB INNOWAX（30m0.32mm0.5m）购自 Kromat Corporation（USA ）公司。2 实验操作2.1 辛酸对照品溶液 取辛酸对照品 0.15g，精密称定，置 100mL 量瓶中，用乙酸乙酯稀释至刻度，摇匀，作为辛酸对照品储备液。精密量取辛酸对照品储备液1、2、3、4、5mL，分别置 10mL 量瓶中，用乙酸乙酯稀释至刻度，摇匀，制成系列对照品溶液。2.2 供试品的处理 取人血白蛋白半成品，用纯化水稀释成每升含蛋白质 4050g 的溶液，即为供试品溶液。精密量取供试品此溶液 0.5mL，加 1.5molL-1 高氯酸溶液0.2mL，于振荡器上混合 1min，精密加
13、入乙酸乙酯 1mL，在振荡器上剧烈混合1min，以 3000rmin-1 离心 10min，静置，取乙酸乙酯层作为供试品溶液。2.3 色谱条件 1色谱柱： 为 KB-INNOWAX（30m0.32mm0.5m） ；，气化室温度：250；柱温：190 ；检测器温度 ：250；载气为氮气，柱流量速：3.0mLmin-1；氢气流量速：40mLmin -1；分流比：10:1；氢火焰检测器（FID） 。2.4 方法学验证2.4.1 专属性 将“2.1”项下系列 3 浓度的辛酸对照品溶液、 “2.2”项下处理好的供试品溶液，分别精密量取 1L，注入气相色谱仪，记录色谱图。考察溶剂是否干扰主成分。见图 1通
14、过实验得出，在上述色谱条件下，对照品溶液与供试品溶液主峰保留时间一致，辛酸峰拖尾因子为 1.10，与相邻峰分离度为 5.1，理论塔板数为 21251，且无其他峰干扰，符合规定。A.空白；B.对照品；C. 样品；1. 辛酸峰图 1 气相色谱图Fig 1 GC profile of Octoic acid2.4.2 标准曲线的绘制 精密量取“2.1”项下辛酸对照品溶液各 1L，分别注入气相色谱仪，记录色谱图。以辛酸浓度(gmL -1)对其相应的峰面积进行直线回归，求得直线回归方程，直线回归相关系数应不低于 0.99。通过实验得出，辛酸对照品系列溶液的标准曲线为 Y=1.42X-48.92，相关系数
15、为 0.999 2，线性范围为 157785gmL -1。2.4.3 重复性 按照“2.1”项下方法配制辛酸对照品溶液，精密量取各溶液 1L，分别注入气相色谱仪，记录色谱图。以辛酸浓度(gmL -1)对其相应的峰面积ABC11进行直线回归，求得直线回归方程。辛酸对照品系列溶液的直线回归方程为 Y=1.23X-29.63,r=0.998 8按照“2.2”项下供试品处理方法，制备 供试品溶液 6 份，精密量取各溶液1L，分别注入气相色谱仪，记录色谱图。将供试品溶液的峰面积代入上述直线回归方程，计算辛酸钠含量(gmL -1)及 RSD。测定结果见表 1。表 1 重复性实试验结果(n=6)Tab. 1
16、 Reproducibility test序号 峰面积 辛酸钠含量 /(gmL-1)RSD/%1 599.9 511.82 597.4 509.83 598.7 510.84 594.6 507.55 587.1 501.46 597.6 509.9平均 508.53.80.74%通过实验得出，辛酸钠含量相对标准偏差为 0.74%（n=6） 。2.4.4 溶液稳定性 将“2.2” 项下处理好的人血白蛋白样品室温下放置，分别在 0 、4 、8 、12 、16 、20 h，注入气相色谱仪，记录色谱图。结果见表 2。表 2 稳定性实试验结果(n=6)Tab. 2 Stability test序号 峰
17、面积 RSD/%1 564.42 558.1 3 552.94 547.7 1.015 555.86 558.0平均 556.25.6通过实验得出：6 次测定峰面积相对标准偏差为 1.01%。2.4.5 回收率 用辛酸对照品进行加样回收率测定，向已知辛酸钠含量的供试品中再精密加入定量的辛酸对照品，用测定值与供试品中含有量之差，除以加入对照品量计算回收率。精密量取供试品溶液 0.3mL，分别加入 750gmL-1 辛酸对照品溶液0.65、1.20、2.37mL 各三份，按照上述“2.1” 、 “2.2” 和“2.3”步骤，依法测定，精密量取乙酸乙酯层 1lL 注入气相色谱仪，计算其回收率及 RS
18、D。供试品溶液平行测定 2 份，结果取平均值。测定结果见表 3表3 回收率试验结果（n =9）Tab. 3 Recovery rate of Octoic acid供试品/(gmL-1)加入量/(gmL-1) 实测量/(gmL-1) 回收率/% RSD/%286.50 95.50291.85 97.28300.00291.01 97.00380.80 97.64380.10 97.46390.00381.86 97.91488.82 96.00486.50 95.5499.15（n=2）509.20489.67 96.160.96平均 96.72%0.93%结果表明，高、中、低3个浓度水平的回
19、收率在95.50%97.91%之间，平均回收率为96.72%0.93%，RSD为0.96%，表明所采用的样品处理方法及色谱条件均具有较好的准确性。2.4.6 定量限(LOQ) 精密量取 150gmL-1辛酸对照品溶液，逐步进行稀释，得到系列浓度的辛酸溶液，按“2.3” 项下色谱条件进行测定，进样 1lL，浓度为5.23gmL-1时，信噪比 (S/N)约为10，通过实验 确定该方法测定辛酸的LOQ为5.23g。 2.4.7 样品测定 取人血白蛋白半成品 6 批，按照上述 “2.1”、 “2.2” 和“2.3”步骤，进行测定，同时用药典法进行比对，测定结果见表 4。以辛酸对照品浓度(gmL -1)
20、对其相应的峰面积进行直线回归，求得直线回归方程，将供试品溶液的峰面积代入上述直线回归方程，计算出供试品溶液辛酸含量（A） ，再按下式计算供试品辛酸钠含量：辛酸钠含量（mmol/g -1pr 蛋白质）= 10cB2.14nA式中 A 为供试品溶液辛酸绝对值，gmL -1；B 为取样量，即为 0.5mL；n 为供试品稀释倍数；144.22 为辛酸的相对分子质量。备注：lmmol 辛酸相当于 lmmol 辛酸钠。表 4 供试品中辛酸钠含量的测定结果（ n=6）Tab. 4 The Sodium Caprilate assay in HAS样品批号 含量（mmolg -1 蛋白质）2015s1 0.1
21、632015s2 0.1642015s3 0.1642015s4 0.1652015s5 0.1682015s6 0.163平均 0.16450.0019由以上结果可以看出，该方法经验证后，测定样品，测定结果均在药典标准范围内，确保了数据准确可靠，可用作人血白蛋白半成品中辛酸钠的含量检测。2.4.8 本法与药典法结果比较 取相同人血白蛋白半成品 6 批，按照药典方法进行测定，测定结果见表 5表 45 供试样品中辛酸钠含量的测定结果 （n=6）Tab. 5 The Sodium Caprilate assay in HAS样品批号 本法（mmolg -1 蛋白质） 药典法（mmolg -1 蛋白
22、质）2015s1 0.163 0.1652015s2 0.164 0.1652015s3 0.164 0.1652015s4 0.165 0.1622015s5 0.168 0.1662015s6 0.163 0.166平均 0.16450.0019 0.16480.0015p 0.075通过实验得出， 6 批人血白蛋白半成品中辛酸钠含量，结果同药典方法比较，pP0.05 无统计学差异，结果基本一致，能够真实反映样品中辛酸钠含量，拟定为本企业半成品辛酸钠含量的内控方法。4 讨论为更加规范本企业人血白蛋白的生产，半成品的质量控制增加辛酸钠含量的检测。关于辛酸钠含量检测的方法，我们发现姜国亮等人报
23、道的滴定法，试样处理易乳化、滴定终点较难判断，且使用了毒性试剂乙醚、石油醚等问题；中国药典采用的气相色谱法使用了三氯甲烷，该溶剂易挥发且对人体有致畸、致癌性，对神经系统及内脏具有毒害作用，破坏敏感水生生物的呼吸系统 9 等缺点。本文建立的气相色谱法，采用中国药典2015 年版辅料辛酸钠检测 1513所用溶剂，减少了三氯甲烷的使用；缩短了试验时间；方法学验证确保了该方法的准确可靠。结果证明，本文建立的气相色谱法测定人血白蛋白半成品中的辛酸钠含量，更为简洁，结果重复性好，可用作本企业人血白蛋白半成品中辛酸钠含量检测的内控方法。参考文献1 中国药典S .2015 年版.四部：230,513-5142
24、 姜国亮. 萃取法测定人血白蛋白中辛酸钠含量J. 中国现代药物应用，2011，5（2）：117-1183 李荣贞，赵军，李庆英,等.两种定量测定人血白蛋白中辛酸钠含量方法的比较J. 药学研究，2014，33（2）：85-864 仲立军，刘欣宴，李庆英，等.人血白蛋白中辛酸钠的含量测定J.中国医院药学杂志, 2006，26(11):1443-14445 霍雯. 对石油醚萃取法检测人血白蛋白制品中辛酸钠含量可靠性的验证J. 临床和实验医学杂志，2007，6（5）：119-1206 蒋翠岚，王丽娜，韩继红，等. 柱前衍生-反相高效液相色谱法测定人血白蛋白中辛酸钠含量J ，分析化学研究， 2010，38(3): 425-4287卢胜娟，刘艳花，陈金利. 反相高效液相色谱法测定人血白蛋白制品中辛酸钠含量J河北企业，2015，(4)：95-968 陈学奎，邹澄川，杨泽蓉.离子排斥色谱法测定白蛋白中的辛酸钠含量 J.中国输血杂志，2000，13（4）: 242-2439 张文博，吴闯.三氯甲烷对卤虫的急性毒性研究J.当代化工， 2015，44（9）: 2264-2266（收稿日期：2016-03-03）
